江蘇省及周邊地區(qū)番茄黃化曲葉病毒寄主范圍調(diào)查

季英華， 朱葉芹， 李 貴， 張 暉， 趙文浩， 吳淑華， 程兆榜， 趙統(tǒng)敏， 余文貴， 周益軍

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基地，江蘇南京 210014；2.江蘇省植物保護(hù)站，江蘇南京 210046； 3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，江蘇南京 210014)

江蘇省及周邊地區(qū)番茄黃化曲葉病毒寄主范圍調(diào)查

季英華1， 朱葉芹2， 李 貴1， 張 暉1， 趙文浩1， 吳淑華1， 程兆榜1， 趙統(tǒng)敏3， 余文貴3， 周益軍1

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基地，江蘇南京 210014；2.江蘇省植物保護(hù)站，江蘇南京 210046； 3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，江蘇南京 210014)

近年來由番茄黃化曲葉病毒(tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)導(dǎo)致的番茄黃化曲葉病給江蘇省及周邊地區(qū)番茄生產(chǎn)造成了慘重的損失，除番茄外，TYLCV還可以侵染多種作物及雜草，這些非番茄寄主在番茄黃化曲葉病的周年發(fā)生中起著重要的作用。為明確TYLCV的寄主范圍，2012—2014年對(duì)TYLCV在江蘇省及周邊地區(qū)的寄主范圍進(jìn)行了調(diào)查。結(jié)果顯示，除番茄外TYLCV還可以侵染菜豆，并導(dǎo)致嚴(yán)重的矮化及皺縮癥狀，暗示TYLCV的發(fā)生可能成為菜豆種植的新威脅。雜草寄主的調(diào)查結(jié)果顯示，TYLCV可以侵染鐵莧菜、皺果莧，暗示這2種雜草是TYLCV的中間寄主，可能在TYLCV的周年循環(huán)中起作用。

番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)；寄主范圍；江蘇省及周邊地區(qū)

番茄黃化曲葉病毒(tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)是一種粉虱傳植物DNA病毒，屬雙生病毒科(Geminividae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)[1]，是重要的植物病原病毒。由于TYLCV侵染番茄常引起番茄葉緣及脈間黃化、葉片上卷等癥狀，因此生產(chǎn)上常將這類病害稱為番茄黃化曲葉病。除在葉片上表現(xiàn)癥狀外，番茄黃化曲葉病還嚴(yán)重影響番茄產(chǎn)量，特別是在苗期感染，常導(dǎo)致絕產(chǎn)絕收，造成毀滅性危害。目前該病害至少在20多個(gè)國家和地區(qū)出現(xiàn)發(fā)生流行危害報(bào)道[2-4]，給當(dāng)?shù)胤焉a(chǎn)造成了慘重的損失。

除番茄外，TYLCV還可以侵染菜豆[5-6]、辣椒[7-8]、煙草等多種作物及雜草。雖然很多報(bào)道顯示TYLCV只侵染雙子葉植物，但由于TYLCV目前已成為一種在世界范圍內(nèi)發(fā)生的植物病毒，因此寄主范圍相對(duì)比較復(fù)雜。1998—2001年 Salati 等在對(duì)多米尼加共和國的TYLCV寄主范圍進(jìn)行調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，調(diào)查采集的10個(gè)科26種寄主中，在8個(gè)科16種寄主上檢測(cè)到了TYLCV[9]。2007—2008年P(guān)apayiannis等在對(duì)塞浦路斯番茄產(chǎn)區(qū)的TYLCV寄主范圍進(jìn)行調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，調(diào)查涉及的25個(gè)科122種(4 000份樣品)寄主上，在15個(gè)科49種(461份樣品)寄主中檢測(cè)到了TYLCV[10]。這些寄主一方面是TYLCV的危害對(duì)象，另一方面它們又是TYLCV的中間寄主，在TYLCV周年循環(huán)中是重要的病毒侵染來源，因此針對(duì)一個(gè)地域了解當(dāng)?shù)氐腡YLCV寄主范圍不僅有助于明確 TYLCV 的潛在危害對(duì)象，也有助于弄清TYLCV的發(fā)生規(guī)律，進(jìn)而制定有效的防控策略。

江蘇省內(nèi)由TYLCV導(dǎo)致的番茄黃化曲葉病于2007年年底出現(xiàn)危害[11]，2008—2009年該病迅速擴(kuò)張至整個(gè)江蘇省及周邊地區(qū)[12]，給當(dāng)?shù)氐姆焉a(chǎn)造成慘重?fù)p失，為了弄清其發(fā)生規(guī)律，探索有針對(duì)性的防控措施，本試驗(yàn)于2012—2014年對(duì)它的寄主范圍進(jìn)行了調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本研究涉及作物及雜草樣品于2012—2014年采自江蘇省及周邊的安徽省部分區(qū)域番茄種植區(qū)(集中在番茄黃化曲葉病發(fā)病棚室內(nèi)及周邊區(qū)域)，樣品采集后保存于-20 ℃冰箱備用。

1.2 樣品檢測(cè)

參照謝艷等的方法[13]提取DNA：取10 mg樣品于 1.5 mL 離心管中，加100 μL 0.5 mol/L NaOH，研磨成勻漿狀，低速離心，取上清，用0.1 mol/L Tris-HCl稀釋100倍作為PCR反應(yīng)模板。

使用粉虱傳雙生病毒引物PA(5′-TAATATTACCKGWKGVCCSC-3′)和PB(5′-TGGACYTTRCAWGGBCCTTCACA-3′)進(jìn)行PCR檢測(cè)[14]，PCR反應(yīng)條件為94 ℃變性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。PCR反應(yīng)體系為10×反應(yīng)緩沖液(含Mg2+)2.5 μL；10 mmol/L dNTP混合物 0.5 μL；10 μmol/L PA 1.5 μL；10 μmol/L PB 1.5 μL；模板DNA 2 μL；5 U/mLTaqplusDNA聚合酶0.5 μL；加ddH2O至終體積25 μL。PCR反應(yīng)產(chǎn)物于1%瓊脂糖電泳中檢測(cè)，隨機(jī)抽取陽性樣品進(jìn)行序列測(cè)定，序列測(cè)定由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.3 陽性寄主的認(rèn)定

由于粉虱傳雙生病毒的分類標(biāo)準(zhǔn)是采用全基因組序列的同源性高低來認(rèn)定(DNA-A全基因組序列同源性≥91%為同一個(gè)種，<91%為不同種)[15]，因此對(duì)于PA/PB檢測(cè)結(jié)果為陽性的樣品，只能認(rèn)定為疑似寄主。

為了進(jìn)一步判定這些陽性樣品是否為TYLCV的寄主，筆者從所有檢測(cè)結(jié)果為陽性的疑似寄主中抽取典型樣品進(jìn)行全基因組序列的克?。涸O(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物TY_1A-BF(5′-ATGTGGGATCCACTTCTAAATGAATTTCC-3′)和TY_1A_SR(5′-GCGTCGACAGTGCAAGACAAACTACTTGGGGACC-3′)進(jìn)行全基因組序列PCR擴(kuò)增(PCR體系及反應(yīng)程序同上，其中退火溫度為58 ℃，延伸時(shí)間為3 min)，擴(kuò)增產(chǎn)物回收后克隆至pGEM-T載體上測(cè)序，最終根據(jù)測(cè)序結(jié)果判定該寄主是否為TYLCV的自然寄主。

2 結(jié)果與分析

2.1 TYLCV作物寄主種類調(diào)查

在江蘇省內(nèi)，番茄作為TYLCV的主要危害寄主已有報(bào)道[11]，因此筆者在本次調(diào)查過程中主要針對(duì)TYLCV的其他潛在危害作物寄主進(jìn)行調(diào)查：2012—2014年，筆者累計(jì)對(duì)江蘇省及周邊地區(qū)包括辣椒、茄子、菜豆、豇豆、黃瓜、西瓜、絲瓜、冬瓜、南瓜、萵苣、棉花等作物在內(nèi)的1 062份非番茄寄主樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果在菜豆上確認(rèn)了TYLCV的發(fā)生(圖1)，在西瓜、豇豆上檢測(cè)到了疑似樣品(表1)。其中菜豆受TYLCV侵染后會(huì)表現(xiàn)出明顯的葉片皺縮、變小，植株矮化(圖1)，結(jié)莢率嚴(yán)重下降，特別是在秋茬菜豆與番茄混種的棚室內(nèi)，該病發(fā)生非常嚴(yán)重。

2.2 TYLCV雜草寄主種類調(diào)查

在很多植物病毒的周年侵染循環(huán)中， 雜草是重要的中間寄主，是病毒再侵染的重要來源(病毒庫)。為明確江蘇省TYLCV的雜草中間寄主種類，筆者對(duì)江蘇省及周邊地區(qū)的雜草寄主進(jìn)行了調(diào)查，對(duì)22種常見的雜草調(diào)查結(jié)果顯示，鐵莧菜、皺果莧是TYLCV的雜草中間寄主(表2)。在田間隨機(jī)抽樣調(diào)查中，采自番茄黃化曲葉病棚室周邊的鐵莧菜TYLCV感染率平均達(dá)47%，部分棚室周邊采的樣品感染率高達(dá)72%，說明鐵莧菜是TYLCV的重要中間寄主。由于TYLCV侵染鐵莧菜多不表現(xiàn)癥狀(偶爾伴有黃化癥狀)，因此在田間單靠癥狀很難區(qū)分。皺果莧是保護(hù)地內(nèi)常見的雜草，在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)它也是TYLCV的中間寄主，但是皺果莧在自然條件下的感染率不高(相比鐵莧菜)，感染后也不表現(xiàn)明顯的癥狀(偶爾伴有葉片卷曲癥狀)。因此在生產(chǎn)上，特別是在多種雜草混生地區(qū)，番茄黃化曲葉病的防控要特別注意周邊雜草(毒源)，清除田間及周邊地區(qū)的雜草可以有效地壓低TYLCV的中間寄主數(shù)量，這無論是對(duì)番茄黃化曲葉病的防控還是對(duì)其他蟲媒病毒病的防控都有重要的意義。

表1 江蘇省及周邊地區(qū)TYLCV作物寄主調(diào)查

注：“*”為已克隆全序列的寄主樣品。下表同。

3 討論

江蘇省內(nèi)目前已知的TYLCV寄主至少有4種，可以分為2類：一類為作物寄主，包括番茄和菜豆，由于番茄是主要受害作物，2008年就有報(bào)道[11]，人們對(duì)它已普遍認(rèn)知；而對(duì)于菜豆，早前西班牙[5]、希臘[6]、日本[16]等地都報(bào)道其為TYLCV寄主。本研究中，筆者也發(fā)現(xiàn)江蘇及安徽地區(qū)的菜豆上感染了TYLCV，表明菜豆也是TYLCV的潛在危害對(duì)象。在調(diào)查中也發(fā)現(xiàn)有些菜豆品種上TYLCV發(fā)生很重，而有些品種上發(fā)生較輕，暗示了并非所有的菜豆品種都對(duì)TYLCV敏感。但目前國內(nèi)菜豆品種對(duì)TYLCV的抗性水平尚不明確，因此在選種菜豆時(shí)應(yīng)盡量避免在煙粉虱大發(fā)生的6—10月與番茄等作物混種或者使用相同的育苗場(chǎng)所。若使用相同的育苗場(chǎng)所一定要注意嚴(yán)防煙粉虱，同時(shí)盡量遠(yuǎn)離有番茄黃化曲葉病發(fā)生的大棚。另一類為雜草寄主，包括鐵莧菜和皺果莧，這2種雜草在田間都沒有典型的癥狀(零星的樣品有癥狀)，因此田間靠癥狀鑒別是否感染TYLCV比較困難。由于江蘇地區(qū)夏季溫度偏高，保護(hù)地6—7月基本不會(huì)安排番茄種植(露地番茄很少)，因此在這段時(shí)間，雜草和其他作物可能是TYLCV的重要中間寄主，為TYLCV再次侵染下茬番茄提供重要的病毒侵染來源，因此在田間清除雜草時(shí)應(yīng)特別注意這2種雜草。另有2個(gè)疑似寄主：豇豆和西瓜，將其劃分為疑似寄主主要有2個(gè)方面的考慮：(1)調(diào)查結(jié)果顯示這2種疑似寄主上TYLCV的檢出率都很低(表1)；(2)雖然2種寄主中都有樣品檢測(cè)結(jié)果為陽性(PA/PB)，但是由于這2個(gè)陽性樣品目前都沒有拿到全基因組序列，因此將其暫列為疑似寄主。2012年Dai等在上海發(fā)現(xiàn)TYLCV可以侵染豇豆并且導(dǎo)致比較明顯的褪綠黃化癥狀，因此在江蘇省內(nèi)它也可能是TYLCV的一個(gè)寄主[17]，但是從本研究的結(jié)果看其感染率(檢出率)并不高。

表2 江蘇省及周邊地區(qū)TYLCV雜草寄主調(diào)查

TYLCV自2006年傳入中國以來，目前有報(bào)道的寄主包括番茄[18]、豇豆[17]、菜豆、陸地棉、苘麻、煙草、百日菊[19]、鐵莧菜、皺果莧等9種，這個(gè)結(jié)果相較于TYLCV在塞浦路斯的寄主種類(15個(gè)科49種，2007—2008年)[10]明顯少許多，可能的原因有2個(gè)方面：一方面TYLCV在我國發(fā)生的時(shí)間相對(duì)較短(始于2006年)，而TYLCV在塞浦路斯的發(fā)生時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)(始于1974年)，長(zhǎng)時(shí)間的適應(yīng)可能使得TYLCV有更廣的寄主范圍；另一方面可能與調(diào)查時(shí)采用的檢測(cè)方法有關(guān)，有報(bào)道顯示TYLCV在有些雜草寄主中的病毒含量較低，因此采用不同的檢測(cè)方法得到的結(jié)果可能有些不同。在本研究中樣品的檢測(cè)主要通過PCR完成，而塞浦路斯樣品檢測(cè)主要依托實(shí)時(shí)定量PCR：實(shí)時(shí)定量PCR的檢測(cè)結(jié)果是49種寄主(普通PCR的檢測(cè)結(jié)果是43種)，暗示研究TYLCV的雜草寄主時(shí)，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)在靈敏性上更有優(yōu)勢(shì)。

由于TYLCV是一種在世界范圍發(fā)生危害的病毒，因此對(duì)于其寄主范圍多地都有報(bào)道[9-10，20-22]，但是不同的地域由于氣候、環(huán)境、耕作方式等方面的差異，往往有不同的植被群落，再加上地域間介體類型及介體發(fā)生規(guī)律也不盡相同，因此病毒在不同地域的寄主范圍往往會(huì)有差異，有時(shí)甚至同樣的植物在不同的地域表現(xiàn)出寄主與非寄主的差異。Davis在美國佛羅里達(dá)州調(diào)查TYLCV寄主范圍時(shí)發(fā)現(xiàn)反枝莧是TYLCV的寄主[20]，而筆者在江蘇地區(qū)的調(diào)查結(jié)果顯示在反枝莧中沒有檢測(cè)到TYLCV。Zubiaur等在調(diào)查古巴TYLCV的寄主范圍時(shí)發(fā)現(xiàn)南瓜是TYLCV的寄主[23]，但是本研究在江蘇省采集的南瓜樣品中均未檢測(cè)到TYLCV。同樣有很多報(bào)道顯示辣椒也是TYLCV的寄主[7-8]，但在江蘇地區(qū)也未在辣椒上檢測(cè)到TYLCV。由此可見，不同地域的生態(tài)環(huán)境不同、栽培模式不同，病毒的寄主范圍也往往不盡相同。針對(duì)江蘇地區(qū)TYLCV寄主種類展開調(diào)查，明確其寄主范圍，將有利于進(jìn)一步明確TYLCV在江蘇地區(qū)的發(fā)生規(guī)律，為探尋TYLCV周年循環(huán)中的薄弱環(huán)節(jié)，找到有效切斷病毒傳播途徑的方式，制定有針對(duì)性的防控策略提供基礎(chǔ)。

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10.15889/j.issn.1002-1302.2017.02.024

2015-11-08

國家自然科學(xué)基金(編號(hào)：31572074)；國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(編號(hào)：201303028)；江蘇省“333”高層次人才培養(yǎng)工程科研項(xiàng)目(編號(hào)：BRA2013262)；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自住創(chuàng)新重點(diǎn)項(xiàng)目[編號(hào)：CX(12)1004]；江蘇省科技基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：4911406)。

季英華(1979—)，男，山東日照人，碩士，副研究員，主要從事粉虱傳病毒研究。E-mail：jiyinghua@jaas.ac.cn。

周益軍，博士，研究員，主要從事植物病毒的研究。Tel：(025)84390391；E-mail：yjzhou@jaas.ac.cn。

S436.412.1+1

A

1002-1302(2017)02-0090-03

季英華，朱葉芹，李 貴，等. 江蘇省及周邊地區(qū)番茄黃化曲葉病毒寄主范圍調(diào)查[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45(2)：90-93.