葛紹陽，王娜，劉治麟，楊子彪，武永超，桑躍，趙亮

（1.北京資源亞太飼料科技有限公司博士后科研工作站，北京 102600；2.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京市高等學校畜產(chǎn)品工程研究中心，北京 100083；3.北京和益源生物技術有限公司，北京 100089；4.云南皇氏來思爾乳業(yè)有限公司，大理 671000）

雙歧桿菌A6對健康青年人群腸道菌群的影響

葛紹陽1，王娜2，劉治麟3，楊子彪4，武永超3，桑躍3，趙亮2

（1.北京資源亞太飼料科技有限公司博士后科研工作站，北京 102600；2.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京市高等學校畜產(chǎn)品工程研究中心，北京 100083；3.北京和益源生物技術有限公司，北京 100089；4.云南皇氏來思爾乳業(yè)有限公司，大理 671000）

益生菌的重要功能之一是對腸道菌群的調節(jié)。動物雙歧桿菌乳亞種A6（Bifidobacteirum animalis subsp． lactis A6）菌株已被證實具有良好的生理功能，為進一步評價該菌株對青年人群腸道菌群的影響，本研究募集52名18～26歲的健康青年志愿者，將其隨機等分為兩組，開展人群口服試驗：兩組先服用1周安慰劑；組A繼續(xù)服用安慰劑4周，組B服用A6樣品（添加有A6活菌牛奶，活菌濃度約為1010CFU/50mL）4周；停服2周；組A服用A6樣品4周，組B服用安慰劑4周。服用劑量為每天50mL。在每一階段末期采集一次糞便樣品（共5次），以種屬特異性引物定量PCR檢測其中的腸道菌群數(shù)量。腸道菌群數(shù)量的檢測結果表明，與基線期和對照期相比，連續(xù)口服A6 4周后，腸道中潛在致病性大腸桿菌的數(shù)量顯著下降（P＜0．01），有益菌乳酸菌、雙歧桿菌的數(shù)量則出現(xiàn)上升（P＜0．01）。試驗表明，LC-01樣品對健康青年人群腸道菌群具有調節(jié)作用，有利于腸道健康的維持與改善。

雙歧桿菌A6；健康青年人群；腸道菌群

近年來，隨著生活節(jié)奏的加快、生活壓力的加大，亞健康人群比例逐步增大。亞健康及相關疾病成為當今社會的重大問題。人們對健康的追求已經(jīng)從疾病的治療轉為預防，保健品及功能性食品的需求也越來越大。其中益生菌類食品及保健品得到了飛速的發(fā)展。乳制品是益生菌良好的載體，含有益生菌的發(fā)酵酸乳和發(fā)酵乳飲料在乳制品中的比重在逐年上升。

益生菌最重要的作用是調節(jié)腸道菌群、改善腸道環(huán)境。腸道菌群能夠影響人體的營養(yǎng)代謝和能量供應。腸道菌群主要通過發(fā)酵、甲烷化硫還原和甲烷化進行物質和能量代謝，具有促進食物消化吸收、生成維生素等基本營養(yǎng)作用[1]。2008 年，Li等人的研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群結構的變化和人體代謝水平的變化形成響應，并報道了腸道菌群中多個可對人體多條代謝通路有影響的成員[2]。也有研究表明，腸道菌群是人體代謝過程的直接參與者，是人體正常生命活動不可或缺的部分[3]。其次，腸道菌群能維持人體腸道內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。多項研究表明，相對普通動物，無菌動物的腸壁血管、膜細胞結構、肌肉層結構、消化道酶活性、細胞因子產(chǎn)量等都出現(xiàn)不同程度的發(fā)育不良或損傷。而同等體重條件下，無菌動物需要攝入更多能量才能維持基本生命活動，對各類疾病的抵抗力也更差[4]。同時，正常腸道菌群的動物可以通過競爭和分泌細菌素等方式對外源致病性微生物的侵入起到屏障作用[5]。第三，腸道菌群對人體免疫功能很可能具有重要的調節(jié)作用。腸道黏膜被認為是人體最大的免疫系統(tǒng)，腸道也是人體最大的免疫器官，在外源致病物質入侵時，腸道菌群可以誘導黏膜免疫反應的發(fā)生，參與多位置、多種功能的免疫相關基因的激活或者關閉，誘導免疫細胞的活化[6]。還有研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群具有正負向調節(jié)炎癥反應的潛能[7]。因此腸道菌群與正常免疫功能的維持和運行緊密相關。近年來的研究顯示，腸道菌群結構還與人類的衰老、肥胖、糖尿病、心血管疾病、腫瘤甚至心理疾病的發(fā)生、發(fā)展和治療有關[8,9]。雖然現(xiàn)有的研究并未完全了解腸道菌群與宿主之間錯綜復雜的互作方式，但不可否認的是，腸道菌群與人體健康狀況是密切相關的。

本研究通過用高靈敏度、高通量和高特異性的實時熒光定量PCR技術，檢測連續(xù)攝入雙歧桿菌A6四周后，受試者糞便中多種腸道微生物的數(shù)量變化情況，尋找發(fā)生顯著性變化的細菌，探究A6對腸道菌群的調節(jié)效果。

1 材料與方法

1．1 菌株

動物雙歧桿菌乳亞種A6（Bifidobacterium animalis subsp. lactis A6）(CGMCC No.9273) ，由中國農(nóng)業(yè)大學功能乳品實驗室提供。

1．2 主要儀器設備

低溫高速離心機（Sigma 3K30），德國Satorious公司；紫外可見分光光度計（UV-2102PC），尤尼柯上海儀器有限公司；PCR儀（PTC-200），美國BIORAD公司；萬分之一電子天平（TP-214），美國丹佛儀器公司。

1．3 主要試劑與耗材

瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，電泳級SYBR Green I熒光染料（10000×）、DL2000 DNA Marker、RNAse A（10mg/mL），購自北京天根生化公司；SYBR Premix Ex Taq熒光定量PCR試劑、Premix Ex Taq PCR試劑、λDNA溶液（0.31μg/μL），購自大連TaKaRa寶生物工程公司；Tris飽和酚、酚/仿/異丙醇（25∶24∶1）、乙醇（分析純），購自藍弋公司；其余未注明試劑為國產(chǎn)生化或分析純試劑；

定量PCR專用96孔板，香港帝恩生物科技公司；直徑分別為0.1mm和2～3mm的玻璃珠，世紀華林公司；50mL帶勺采樣管，上海好迪公司。

1．4 培養(yǎng)基與試劑配制

MRS培養(yǎng)基、PBS、RAN later、TE、50xTAE、Tris-SDS、3mol/L乙酸鈉按試驗規(guī)格配制。

1．5 試驗設計

1.5.1 志愿者招募和人群試驗情況

表1 志愿者招募標準

將招募的60名志愿者（招募標準見表1）以BMI [體重（kg）/身高2（m2）]為標準，隨機分為人數(shù)均等的兩組（組A和組B），并保證年齡、性別比例基本一致。按照圖1的設計進行隨機、平行、安慰劑對照的交叉人群試驗。第1周為導入期，兩組志愿者均服用安慰劑（無益生菌添加的植物蛋白飲料）；第2周至第5周為試驗期I，組A依然服用安慰劑，組B服用A6樣品；第6、7周為洗脫期，兩組志愿者停止服用任何受試樣品；第8周至第11周為試驗期II，組A服用A6樣品，組B服用安慰劑。服用劑量均為50mL /次，1次/d。A6活菌制劑存放于-20℃冰箱。A6樣品和安慰劑在每天上午同一時刻制備，并在4℃冰箱存放。監(jiān)督志愿者服用飲料時設立為雙盲，志愿者和服務人員均無法區(qū)分A6樣品和安慰劑。

采樣前向每名志愿者發(fā)放經(jīng)編號、稱重、滅菌的50mL采樣管各兩只（A管和B管），A管裝有7mL RNA later。在試驗開始前（T0）和每個試驗周期結束時（T1、T2、T3和T4）各采集一次志愿者的糞便樣品，每次每人采集兩管，4h內交試驗室保存。A管存放于4℃并在一周內提取DNA，B管存放于-80℃用于其他指標的檢測。共采集5次。

本試驗采用臨床上常用的交叉試驗（cross-over trial）設計，這是結合了自身比較和組間比較的一種經(jīng)典設計思路[10]，該設計屬于雙處理、雙序列、雙時期的2×2交叉試驗。導入期的設置是為了使受試者更好地適應試驗流程、觀察有無不良反應和排除試驗前有關行為的干擾；洗脫期的設置是為了盡量排除前一階段的“殘留”（residual）影響。與一般的試驗組加對照組的平行試驗設計相比，交叉實驗能夠更有效地消除實驗時期差異和個體差異對結果的影響，可以節(jié)省樣本量，或在樣本容量相同時增加試驗結果的精度與效能[11]。

圖1 人群實驗流程

1.5.2 腸道菌群檢測

表2 各PCR組所用引物序列、產(chǎn)物大小和退火溫度

1.5.2.1 糞便樣品DNA的提取

將上交的糞便采集管稱重，用漩渦振蕩器勻漿后，按試驗規(guī)程進行DNA的提取。

1.5.2.2 特異性引物和定量PCR條件的確立

試驗中涉及的腸道微生物組見表2的“PCR組”一欄。根據(jù)參考文獻查找對應組的特異性引物，并結合普通PCR、瓊脂糖凝膠電泳檢測、熒光定量PCR等技術進行驗證，確立引物序列和定量PCR反應條件。

PCR反應體系見表3。

表3 熒光定量PCR反應體系

反應體系為20μL。隨機選擇多個已提出的糞便DNA樣品作為模板，分別將9個PCR組的特異性引物按照表2加樣完畢后，將96孔板置于專用離心機離心30s混勻并除去氣泡，小心放入Quantica熒光定量PCR儀，按照以下程序進行定量PCR反應：95℃預變性5 min；95℃ 15s、退火30s、72℃延伸30s，80℃～85℃5s檢測SYBR Green及ROX（校正染料）熒光信號，進行40次循環(huán)。

為了檢測PCR產(chǎn)物特異性，在進行定量PCR時設置從60℃逐漸升溫至95℃（每個循環(huán)0.5℃），每次循環(huán)過程末期檢測SYBR Green信號，繪制融解曲線。每個樣品重復三次。Ct值閾值線統(tǒng)一設定為第3～8個循環(huán)熒光信號標準偏差的10倍。將得到的終產(chǎn)物用EB染色，經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳后，用紫外凝膠成像儀對產(chǎn)物進行進一步檢驗。

1.5.2.3 標準DNA模板的獲得及拷貝數(shù)濃度的確定

使用確認的特異性引物對糞便樣品DNA進行實時熒光定量PCR，將產(chǎn)物上樣進行2%的瓊脂糖凝膠電泳，用無菌手術刀將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下，放入干凈的2mL離心管中，用潔凈的移液器吸頭小心地將凝膠搗碎，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行膠回收，即可獲得對應PCR組的標準DNA模板。

獲得標準DNA模板后，使用SYBR Green I熒光染料，以λDNA為標準品，于熒光儀測定標準DNA模板的濃度，再根據(jù)其大?。▔A基數(shù)），計算對應的拷貝數(shù)。

SYBR Green I工作液的配置：10mL TE緩沖液中加入2μL 10000× SYBR Green I熒光染料，室溫避光保存，24h內使用完畢。

標準曲線的測定：將Green模塊（激發(fā)波長495-525nm）安裝在Modulus 9200熒光儀中。將λDNA溶液以TE緩沖液進行梯度稀釋，分別制成3.875ng/mL、7.75ng/mL、15.5ng/mL、31ng/mL、77.5ng/mL、155ng/mL、310 ng/mL和775ng/mL的稀釋度標品，每個濃度設三個平行。依次取50μL不同稀釋度的標品于熒光比色皿中，加入50μL SYBR Green I工作液，移液器混勻，立即測定熒光值。用TE緩沖液代替標品液作為空白。測定結束后，以λDNA終濃度為橫坐標，熒光值為縱坐標繪制標準曲線。

標準DNA模板拷貝數(shù)的測定：將各標準PCR組的標準DNA模板用TE緩沖液稀釋至合適濃度，測定其熒光值，利用標準曲線計算DNA的質量濃度。根據(jù)1μg 1000 bp 雙鏈DNA = 1.52 pmol = 9.1 × 1011拷貝數(shù)[18]以及標準DNA大小，計算出每個PCR組的標準DNA模板的拷貝數(shù)濃度，即對應菌的相對數(shù)量。

1.5.2.4 糞便樣品中腸道菌群數(shù)量的測定和分析

分別以不同的特異性引物，將志愿者的糞便DNA樣品和標準DNA模板，用熒光定量PCR儀同時進行擴增和檢測。以標準DNA模版拷貝數(shù)濃度的log值和Ct值建立標準曲線及線性方程，同時計算擴增效率。根據(jù)糞便DNA樣品的Ct值，由標準曲線方程計算得出對應菌的拷貝數(shù)濃度。

1.5.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用Office Excel 2007軟件計算每克糞便樣品中各細菌組和總菌的拷貝數(shù)，同時計算不同志愿者組的平均值及標準差。利用SPSS17.0軟件對結果進行統(tǒng)計分析，用Kolmogorov-Smirnow test對每組數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，用重復測量方差分析法比較安慰劑和LC-01干預對受試者腸道菌群的影響，用t檢驗比較志愿者組內腸道菌群的變化，顯著性水平定為P＜0.05。

2 結果

2．1 志愿者招募和人群試驗情況

于2015年3月在中國農(nóng)業(yè)大學食品學院招募志愿者共60名。 采樣人群的分組情況見表4。

表4 采樣人群分組情況

試驗過程中先后有8名志愿者退出試驗， 最終A組25人，B組27人。

2．2 特異性引物和定量PCR條件的確立

用9組特異性引物對糞便樣品DNA進行定量PCR反應預實驗，定量PCR產(chǎn)物電泳結果見圖2。

圖2 9組特異性引物的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

如圖2所示，9種引物對糞便DNA樣品PCR產(chǎn)物的電泳條帶單一、清晰；參照D2000 DNA Marker條帶，產(chǎn)物的分子量大小也和表2中所列相符，說明引物對腸道菌群相應種屬基因組的擴增堿基區(qū)段具有特異性，PCR條件滿足擴增要求。

2．3 標準DNA模板的獲得及拷貝數(shù)濃度的確定

SYBR Green I熒光法繪制梯度稀釋的標品λDNA的熒光值，以λDNA濃度為橫坐標，扣除0濃度的校準熒光值為縱坐標，繪制標準曲線，如圖3所示。

圖3 λDNA標準曲線

標準曲線相關系數(shù)為0.999，說明在標準液濃度范圍內，DNA濃度和熒光值線性關系良好。

2．4 標準DNA模板定量PCR標準曲線的建立

以Ct值為縱坐標，拷貝數(shù)濃度為橫坐標，繪制各組標準DNA模板的定量PCR反應標準曲線，并計算擴增效率。相關情況見表5。

表5 定量PCR擴增效率及標準曲線相關系數(shù)

本研究中，9個PCR組的擴增效率在87.0%～98.9%之間，Rinttila等在對腸道菌群的研究中同樣報道過，不同PCR組引物可能會出現(xiàn)擴增效率差異較大的情況，如其研究的菌群中Atopobium組的擴增效率僅有78%，但并不影響定量分析[18]。本研究中，所使用各個特異性引物均在文獻被大量引用或有明確的特異性研究報道，且在正式定量之前，已經(jīng)在普通PCR反應中進行了條件優(yōu)化及特異性檢驗，定量PCR標準曲線的相關系數(shù)均在0.995以上，完全滿足對腸道菌群的定量需求。

表6 兩組受試人群糞便中菌群變化情況

采用配對t檢驗，分別比較試驗期I前后（T1期與T2期）、洗脫期前后（T2期和T3期）和試驗期II前后（T3期和T4期），同一組內受試者糞便中各細菌組的拷貝數(shù)濃度的均值。結果見表6。

結果發(fā)現(xiàn)，組A和組B的受試者在服用安慰劑前后（組A的T1期與T2期，組B的T3期與T4期）糞便中各細菌組的數(shù)量均未出現(xiàn)顯著性的變化（P＞0.05），而在服用A6樣品前后（組A的T3期與T4期，組B的T1期與T2期），糞便中的大腸桿菌、乳酸菌和羅斯氏腸道菌三個細菌組的數(shù)量均出現(xiàn)了顯著性的差異，說明服用A6樣品對腸道中上述三個細菌組數(shù)量的影響顯著；組A和組B的受試者糞便中雙歧桿菌的數(shù)量變化趨勢一致，組A由8.08 lgc/g升高到8.67 lgc/g，有顯著性差異；組B則由7.94 lgc/g 升高到8.13 lgc/g，說明服用A6提升腸道中雙歧桿菌的數(shù)量。

3 討論

本研究顯示，相比基線期，服用A6樣品四周后，受試者糞便中Lactobacillus和Bifid obacterium的數(shù)量顯著上升，Escherichia coli的數(shù)量則顯著下降，已有研究表明，腸道內的Lactobacillus和Bifidobacterium對維持良好的腸道環(huán)境起著關鍵作用，而大腸桿菌等潛在致病菌比例的提高則會給宿主健康帶來潛在危害。本研究結果說明連續(xù)口服A6四周可以調節(jié)人體腸道菌群，這種調節(jié)作用對人體健康有利。

腸道菌群的平衡與變化是十分復雜的，其與益生菌和人體環(huán)境之間的互作關系尚未探明。短鏈脂肪酸和氨都是腸道菌群中的特征代謝物質，是通過腸道菌群的代謝過程產(chǎn)生的，腸道菌群的改變對短鏈脂肪酸和胺的影響可能是腸道菌群對腸道環(huán)境改變的原因。腸道內的短鏈脂肪酸主要來自腸道菌群對碳水化合物的發(fā)酵降解，而氨既屬于某些菌群成員對內源性蛋白質和尿素的降解產(chǎn)物，也可以作為氮源被大部分腸道菌群利用。腸道內短鏈脂肪酸濃度升高引起的酸度上升，可以促進以氨為氮源的腸道菌群對氨的利用，從而引起氨濃度降低腸道內的Bifidobacterium 和Lactobacillus以碳水化合物作為主要的發(fā)酵底物，代謝產(chǎn)物為多種短鏈脂肪酸，主要是乳酸。腸道內的Escherichia coli以蛋白質類物質作為主要的發(fā)酵底物，是人體內的氨產(chǎn)生菌之一；而Bifidobacterium的代謝主要以氨作為氮源，可以減少腸道中的氨。本研究顯示，服用A6樣品四周后，受試者糞便中Bifidobacterium的數(shù)量有一定程度的提高，Escherichia coli的數(shù)量和氨的濃度則出現(xiàn)了顯著下降。此結果說明，腸道中Bifidobacterium 數(shù)量的上升和Escherichia coli數(shù)量的下降，可能降低腸道中氨的濃度。本研究發(fā)現(xiàn)引用A6能改變腸道菌群組成，腸道菌群對腸道環(huán)境的影響有待進一步研究。

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Efects of Bifdobacteirum Animalis Subsp Lactis A6 on Intestinal Flora in Healthy Young Adults

GE Shao-yang1, WANG Na2, LIU Zhi-lin3, YANG Zi-biao4, WU Yong-chao3, SANG Yue3, ZHAO Liang2
(1.Postdoctoral Working Station, Beijing Resources Asia-Pacifc Feed Technology Co. Ltd. , Beijing 102600; 2.College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Animal Product, Beijing 100083;3 Beijing Heyiyuan Biotechnology Co. Ltd., Beijing 100089;4. Yunnan Huangshi Lesson Dairy Co. Ltd., Dali 671000)

One of the key beneficial functions of probiotics is to modulate the human intestinal microflora. Bifidobacteirum animalis subsp. lactis A6 has good physiological function activity. To evaluate the effect of the bacterium on young human intestinal microfora, a human administration trial was carried out. Totally 52 healthy adult (18～26 years old) volunteers were randomized equally to two groups. After a 1-week placebo-runin period, one group consumed vegetable protein drink supplemented with 1010colony forming units of A6 each day for the 4-week treatment period, then consumed placebo in the next treatment period, separated by a 2-week washout. The other group followed the reverse order. Group-specifc real-time PCR was used in analyses of fecal samples collected at the end of every period, to determine intestinal bacterial composition. Compared to baseline and placebo period, a signifcant inhibition in potentially pathogenic fecal Escherichia coli (P＜0.001) and increase in benefcial Lactobacillus, Bifidobacterium and Roseburia intestinalis (P=0.006; 0.098; 0.010, respectively) were observed after consumption of A6. The results indicated a modulation efect of A6 on intestinal microfora of young adults, suggesting a benefcial efect on bowel health.

Bifdobacterium animalis subsp. lactis A6; Healthy young people; Intestinal fora

TS252.1

A

1004-4264（2017）01-0052-07

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.01.014

第二屆“牛人”攝影大賽作品 《美麗園區(qū)》——謝井林 首農(nóng)畜牧

2016-12-10

云南省科技計劃生物重大專項（奶業(yè)專項）（2014ZA001）；北京市教育委員會中央在京高校重大成果轉化項目“益生菌生產(chǎn)關鍵技術科技成果轉化”項目。

葛紹陽（1986-），男，漢族，博士后。

趙亮（1983-），男，漢族，副教授，研究方向為益生菌科學。