張瑞珺，王曉雯，萬喆，李若瑜

北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科, 北京大學(xué)真菌與真菌病研究中心, 皮膚病分子診斷北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100034

·論著·

播散性暗色絲孢霉病患者CARD9突變及相關(guān)免疫學(xué)研究

張瑞珺，王曉雯，萬喆，李若瑜

北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科, 北京大學(xué)真菌與真菌病研究中心, 皮膚病分子診斷北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100034

暗色絲孢霉病是指由暗色真菌引起的皮膚、皮下組織乃至深部組織臟器的感染。本研究探討1例由皮膚及皮下組織暗色絲孢霉病逐漸進(jìn)展為播散性暗色絲孢霉病患者的遺傳背景及其抗真菌免疫功能。收集患者10余年病情進(jìn)展的臨床資料及真菌檢查結(jié)果，進(jìn)行臨床資料及真菌學(xué)研究；對(duì)外周血DNA采用Sanger測(cè)序，進(jìn)行遺傳學(xué)研究；提取患者及正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，采用蛋白免疫印跡法、流式細(xì)胞術(shù)、化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等進(jìn)行免疫學(xué)研究。結(jié)果顯示，患者胱天蛋白酶募集域蛋白9(caspase recruitment domain-containing protein 9，CARD9)基因存在新的復(fù)合雜合錯(cuò)義突變(p.R35Q和p.E81K)，CARD9蛋白表達(dá)正常，外周血淋巴細(xì)胞(peripheral blood lymphocyte，PBL)Th1和Th17細(xì)胞比例均降低；PBMC抗疣狀瓶霉感染存在天然及適應(yīng)性免疫缺陷。本研究首次報(bào)道1例播散性暗色絲孢霉病患者存在CARD9基因新發(fā)錯(cuò)義突變，同時(shí)發(fā)現(xiàn)患者PBMC抗真菌的天然及適應(yīng)性免疫存在缺陷，提示CARD9蛋白在暗色絲孢霉病發(fā)病中可能發(fā)揮重要作用。

播散性暗色絲孢霉?。籆ARD9；疣狀瓶霉；外周血單個(gè)核細(xì)胞；免疫缺陷

暗色真菌是條件性致病真菌，廣泛存在于浴室、腐木、土壤等潮濕和營(yíng)養(yǎng)匱乏的環(huán)境中。其細(xì)胞壁含有黑色素，可侵犯免疫正常及免疫缺陷宿主，引起著色芽生菌病、暗色絲孢霉病、足菌腫等多種皮下或播散性感染[1-2]。在我國，有代表性的高致病性暗色真菌主要包括疣狀瓶霉(Phialophoraverrucosa，P.verrucosa)、棘狀外瓶霉、裴氏著色霉等。

暗色絲孢霉病是指由一組暗色真菌所致的皮膚、皮下等淺表組織乃至深部臟器的感染。臨床表現(xiàn)多種多樣，可由原發(fā)感染灶播及鼻腔、咽部、鼻旁竇(副鼻竇)、肺部、骨骼、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等好發(fā)部位，其中危害最重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)暗色絲孢霉病?？晌＜盎颊呱?duì)于頑固性感染，手術(shù)切除及多種抗真菌藥物治療往往收效甚微，且無法治愈，因此急需尋求快速、有效的治療方法。

隨著對(duì)真菌感染易感性遺傳與免疫機(jī)制的認(rèn)識(shí)逐漸深入，關(guān)于皮膚黏膜真菌病和侵襲性真菌感染的免疫缺陷病的研究取得了突破性進(jìn)展。例如，以慢性皮膚黏膜念珠菌病為代表的難治性慢性真菌感染已確定與胱天蛋白酶募集域蛋白 9(caspase recruitment domain-containing protein 9，CARD9)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子 1(signal transducer and activator of transcription 1，STAT1)、STAT3等重要分子的基因突變相關(guān)[3]。本課題組還發(fā)現(xiàn)CARD9 缺陷亦可導(dǎo)致以疣狀瓶霉為代表的暗色真菌易感性增加[4]。CARD9 是細(xì)胞C型凝集素受體 (C-type lectin receptor，CLR)下游的關(guān)鍵連接蛋白，被形象地稱為是“連接天然免疫與適應(yīng)性免疫的重要分子”[5]， CARD9依賴的信號(hào)途徑在抗真菌感染免疫中起重要作用。

本研究報(bào)道1例由疣狀瓶霉引起的皮膚及皮下組織暗色絲孢霉病逐漸進(jìn)展為播散性暗色絲孢霉病的患者及其近10余年病程遷延進(jìn)展。遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)該患者存在CARD9基因新發(fā)錯(cuò)義突變；免疫學(xué)研究證實(shí)CARD9突變的外周血單個(gè)核細(xì)胞 (peripheral blood mononuclear cell，PBMC)抗真菌的天然及適應(yīng)性免疫存在缺陷，導(dǎo)致病原性真菌無法清除，病程遷延進(jìn)展。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 抽取存在CARD9錯(cuò)義突變的暗色絲孢霉病患者及健康對(duì)照者外周血，通過密度梯度離心法提取PBMC。1.1.2 菌株 將疣狀瓶霉臨床分離株(BMU07163)接種于燕麥瓊脂(oatmeal agar，OA)培養(yǎng)基，28 ℃孵箱培養(yǎng)14 d。用生理鹽水沖洗真菌斜面，孢子過濾器過濾菌懸液，除去菌絲和培養(yǎng)基成分，制成孢子密度為1×109CFU/mL的菌懸液備用。熱滅活疣狀瓶霉腫脹孢子(heat-killedPhialophoraverrucosaswollen conidia，HK-P.verrucosaswollen conidia)制備：將孢子按1×107CFU/mL接種于RPMI 1640液體培養(yǎng)基中，在30 ℃搖床上200 r/min持續(xù)搖16 h，此時(shí)>95%的孢子發(fā)生腫脹，收集腫脹孢子；將腫脹孢子懸液煮沸30 min滅活，調(diào)整孢子懸液密度為5×108CFU/mL。

1.1.3 主要試劑 燕麥瓊脂購自美國BD Biosciences公司，胎牛血清購自澳洲Hyclone公司，RelaxGene血液基因組DNA提取系統(tǒng)購自Tiangen公司。CARD9引物合成、測(cè)序由天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司完成。兔抗人 CARD9 單克隆抗體(簡(jiǎn)稱單抗)購自英國Abcam公司，兔抗人 GAPDH單抗購自美國Cell Signaling Technology公司，酵母聚糖(zymosan)、魯米諾(luminol)購自美國Sigma公司，抗人CD3抗體、抗人CD28抗體、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC) 抗人CD4、PE抗人γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)、PerCP-Cy5.5抗人白細(xì)胞介素4(interleukin 4，IL-4)、APC抗人IL-17A及同型對(duì)照抗體購自美國BD Biosciences公司，人腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、IL-1β、IL-6、 IFN-γ、IL-17A、IL-22、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自美國R&D Systems公司。

1.2 方法

1.2.1 病原學(xué)研究 參考該患者以前的病理、真菌鏡檢、培養(yǎng)和測(cè)序結(jié)果[6]，對(duì)患者皮損部位多次重復(fù)取材進(jìn)行真菌直接鏡檢和培養(yǎng)，并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

1.2.2 分子遺傳學(xué)研究 本課題組曾發(fā)現(xiàn)4例疣狀瓶霉感染的暗色絲孢霉病患者皆為CARD9缺陷[4]。因此，當(dāng)發(fā)現(xiàn)本研究中患者無人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染、腫瘤、免疫抑制劑使用等誘因時(shí)，考慮對(duì)其CARD9基因進(jìn)行檢測(cè)。抽取患者及其父母的外周血3 mL并提取DNA(按試劑盒說明書操作)，進(jìn)行CARD9基因外顯子擴(kuò)增，即Sanger測(cè)序。

1.2.3 蛋白提取和蛋白免疫印跡檢測(cè) 抽取患者及3名健康對(duì)照者的外周血，通過密度梯度離心法提取PBMC，采用 RIPA液(添加1% protease inhibitor cocktail)提取蛋白質(zhì)，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，其中分離膠10%，濃縮膠5%，恒壓120 V，電泳至分離膠底部。恒流200 mA，2 h，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(nitrocellulose，NC)膜上, 用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加兔抗人CARD9單抗，4 ℃搖床過夜，用含吐溫20的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline with Tween 20，PBST)洗3次，每次5 min。再加入山羊抗兔辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記 IgG，室溫?fù)u床1 h，PBST洗3次,每次5 min。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑顯色、曝光，并進(jìn)行掃描、拍照。

1.2.4 ECL檢測(cè)PBMC中活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成 分別提取患者及6名健康對(duì)照者的PBMC，重懸于含10%自體血清的Hank平衡鹽溶液 (Hank’s balanced salt solution，HBSS)中，細(xì)胞懸液密度為2×106/mL，轉(zhuǎn)至96孔板，每孔100 μL。加入50 μL Zymosan(100 μg/mL)或活的疣狀瓶霉孢子懸液(細(xì)胞∶孢子=1∶4)，立即加入40 μL Luminol(88.5 μg/mL),振蕩后利用Automated LB96V MicroLumat Plus Luminometer(EG&G Berthold，Germany)于37 ℃連續(xù)監(jiān)測(cè)60 min。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞(peripheral blood lymphocyte，PBL)中T細(xì)胞分化 分別提取患者及8名健康對(duì)照者的PBMC，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，密度為 1×106/mL。在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入抗人CD3(1 μg/mL)和抗人CD28 (2 μg/mL)抗體，3 d后更換新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)補(bǔ)充抗人CD3抗體繼續(xù)培養(yǎng)。第4天收取活化的細(xì)胞，加入提前配制的刺激培養(yǎng)基重懸PBMC，即每毫升完全培養(yǎng)基中加入PMA(100 ng/mL)、離子霉素(500 ng/mL)及Golgistop(含莫能霉素0.7 μL/mL)。調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液密度至2×106/mL，加至24孔板，每孔500 μL，繼續(xù)于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育5 h。

T細(xì)胞的胞內(nèi)染色：培養(yǎng)結(jié)束后取出細(xì)胞，1 200 r/min離心5 min，棄上清液；Stain buffer 洗1次，離心，棄上清液，加入一定濃度的 FITC抗人CD4或其同型對(duì)照抗體，4 ℃避光孵育30 min；Stain buffer 洗1次，離心，棄上清液；每管加入250 μL Fixation/Permeabilization solution，混勻，4 ℃避光孵育20 min；加入2 mL Perm/WashTMbuffer，室溫避光孵育10 min，1 200 r/min離心5 min，棄上清液；分別加入PE抗人IFN-γ、PerCP-Cy5.5抗人IL-4、APC抗人IL-17A及所有同型對(duì)照抗體，4 ℃避光孵育30 min；加入2 mL Perm/WashTMbuffer洗滌，1 200 r/min離心5 min，棄上清液，400 μL Stain buffer重懸，用BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀CellQuest Pro軟件獲取數(shù)據(jù)，F(xiàn)lowJo 7.6軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.6 ELISA 抽取患者及6名健康對(duì)照者的外周血并提取PBMC，轉(zhuǎn)至96孔板。將疣狀瓶霉刺激物與PBMC于37 ℃孵育(細(xì)胞∶孢子=1∶4)，分別于24 h和6 d時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按ELISA說明書操作，檢測(cè)天然免疫相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6，適應(yīng)性免疫相關(guān)細(xì)胞因子IL-17A、IL-22、IFN-γ及GM-CSF的分泌水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad Prism 6作圖，SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以mean±SD表示。采用單因素方差分析及t檢驗(yàn)比較兩組間差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料

該34歲漢族青年女性患者感染疣狀瓶霉18年，由皮膚及皮下組織暗色絲孢霉病逐漸加重發(fā)展為播散性暗色絲孢霉病。患者于1998年6月發(fā)現(xiàn)左耳后出現(xiàn)一個(gè)直徑約1.5 cm的無痛紅色結(jié)節(jié)，1998年11月經(jīng)北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科會(huì)診，真菌培養(yǎng)出疣狀瓶霉，考慮為皮膚及皮下組織暗色絲孢霉病[6]，曾予伊曲康唑 400 mg/d聯(lián)合特比萘芬250 mg/d治療，結(jié)合局部熱療?；颊咂ふ顣r(shí)有加重，逐漸進(jìn)展。2006年患者皮損局限于雙側(cè)耳周(圖1A)，2009年皮損逐漸發(fā)展至面部、右耳及背部(圖1B)，予兩性霉素B(總量達(dá)500 mg)，癥狀稍改善。2011年皮損范圍進(jìn)一步擴(kuò)大，面部、背部及上肢明顯(圖1C)，口服藥物加量為伊曲康唑 800 mg/d聯(lián)合特比萘芬 500 mg/d，并輔以胸腺五肽肌內(nèi)注射，效果不佳。2013年患者癥狀進(jìn)一步加重，皮損表面出現(xiàn)破潰、黑色結(jié)痂，接受皮下注射IFN治療，效果欠佳，出院后繼續(xù)予口服伊曲康唑、特比萘芬治療。

A: In 2006, the lesions were located in the left ear. B: In 2009, the lesions extended to the face, ear and back. C: In 2011, the infection lesions could be found in the face, back, left upper limb and chest. D: In 2015, septate hyphae were visible in the oral cavity and maxillary secretions of the patient (direct microscopic examination, ×400).

圖1 患者皮膚及皮下組織暗色絲孢霉病的臨床進(jìn)展照片及真菌直接鏡檢結(jié)果

Fig.1 Clinical manifestations of the skin and subcutaneous phaeohyphomycosis over the past ten years and direct microscopic examination results of fungi

2016年患者感染播散至全身，進(jìn)展為播散性暗色絲孢霉病。頭面部、背部、四肢等可見大小不等的暗紅色至黑色浸潤(rùn)性斑塊，以面部為重，表面有破潰、膿液、黑色結(jié)痂；口腔內(nèi)上顎廣泛糜爛面；左耳郭缺如，左外耳道皮疹覆蓋(圖2A)。輔助檢查結(jié)果如下。頭顱磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)：左側(cè)內(nèi)囊膝、蒼白球及尾狀核頭軟化灶；雙側(cè)額葉皮層下白質(zhì)脫髓鞘病灶(圖2B、2C)。頭顱MRI增強(qiáng)：左側(cè)內(nèi)囊膝、鄰近尾狀核頭及丘腦異常信號(hào)灶、軟化灶？真菌感染？雙側(cè)額葉皮層下白質(zhì)脫髓鞘病灶；左耳周圍、左顳部、雙側(cè)額頂部、鼻部、頜面部皮膚及皮下改變，左側(cè)咬肌受累，左側(cè)顴骨及顳骨受累可能；雙側(cè)上頜竇及篩竇、右側(cè)蝶竇炎癥(圖2D)。腦脊液常規(guī)、生化、病原學(xué)檢查及腦脊液病原學(xué)培養(yǎng)陰性，腦脊液G試驗(yàn)83.24 pg/mL，GM試驗(yàn)陰性。耳鼻喉科會(huì)診示：患者面部多發(fā)大量黑色壞死性結(jié)痂，鼻尖部可見2.5 cm×2.5 cm 黑色干痂，鼻中隔穿孔，硬腭部分骨質(zhì)壞死，與鼻腔相通，周邊多量黑色結(jié)痂，黏膜肉芽及潰瘍性改變；舌體及會(huì)厭舌面、下咽后壁可見多發(fā)潰瘍面；雙聲帶窺視不清。神經(jīng)內(nèi)科會(huì)診考慮顱內(nèi)病變性質(zhì)待定，不除外中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染。綜上，考慮診斷為“播散性暗色絲孢霉病”。予輸注兩性霉素B(累積量407.5 mg)和GM-CSF (300×104u/d)皮下注射3周，療效仍不佳。患者對(duì)兩性霉素B不良反應(yīng)不耐受，院外改為伊曲康唑注射液 400 mg/d靜脈輸注，配合特比萘芬 500 mg/d口服治療，皮損略有好轉(zhuǎn)，目前仍在隨訪中。

A：Patient’s infection lesions spread to the head, face, nose pharynx ministry, back and limbs. B-D：Brain magnetic resonance imaging of the patient. T1 (B) and T2 (C) axial MR imaging showed encephalomalacia. Coronal T1WI enhancement (D) imaging showed the left masseter muscle involvement, left zygomatic bone and temporal bone involvement; bilateral maxillary sinus and ethmoid sinus, right sphenoid sinus inflammation.

圖2 患者播散性暗色絲孢霉病的臨床表現(xiàn)及頭顱MRI平掃和增強(qiáng)

Fig.2 The clinical manifestations and brain magnetic resonance imaging of the patient with disseminated phaeohyphomycosis

2.2 真菌學(xué)研究

患者真菌培養(yǎng)和測(cè)序結(jié)果鑒定為疣狀瓶霉，病理符合暗色絲孢霉病表現(xiàn)[6]。此外，對(duì)患者耳后皮膚、耳后淋巴結(jié)、背部、口腔上顎、面部等感染部位進(jìn)行多次真菌鏡檢，皆為陽性(圖1D)，真菌培養(yǎng)多次陽性，鑒定為疣狀瓶霉。最初分離的菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果為：氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、兩性霉素B、特比萘芬的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)或最低有效濃度(minimum effective concentration，MEC)分別為 64、0.5、0.5、4、0.25 μg/mL，后續(xù)分離培養(yǎng)菌株藥物敏感性無明顯變化[6-7]。

2.3CARD9基因遺傳學(xué)檢測(cè)

Sanger測(cè)序結(jié)果顯示，患者CARD9存在兩個(gè)復(fù)合雜合突變(exon2: c.104G>A, p.R35Q和exon3: c.241G>A, p.E81K)，分別來自患者的父親和母親(圖3A)。同時(shí)在220種族匹配的對(duì)照組中未發(fā)現(xiàn)這些突變檢測(cè)。

2.4 CARD9蛋白表達(dá)檢測(cè)

不同于以前報(bào)道過的無義突變或移碼突變引起CARD9缺陷，該錯(cuò)義突變患者PBMC中CARD9蛋白表達(dá)未見缺乏(圖3B)。

A:CARD9 gene sequencing scheme of the patient and her parents. The arrows point to the mutation sites. B: Immunoblot analysis of CARD9 protein in three healthy donors and the patient.

圖3CARD9基因測(cè)序圖譜及蛋白表達(dá)情況

Fig.3 Sequencing and protein expression profiles of CARD9

A: ROS production tested by luminol-enhanced chemiluminescence. The patient’s and control PBMCs were stimulated with zymosan (100 μg/mL) or aliveP.verrucosaresting conidia, then luminol was immediately added and chemiluminescence was measured at 37 ℃ for 3 min during 1 h. B: Pro-inflammatory cytokine productions tested by ELISA. The patient’s and control PBMCs were incubated with HK-P.verrucosaswollen conidia for 24 h, then the concentrations of TNF-α, IL-1β and IL-6 in culture supernatants were assessed. The bars represent the mean±SD and are representative of two independent experiments, 6 healthy control subjects tested in parallel.*P<0.05,**P<0.01. n.s., not significant.

圖4CARD9突變對(duì)患者天然免疫功能的影響

Fig.4 Effect ofCARD9 mutations on innate immune function

2.5 免疫學(xué)功能檢測(cè)

2.5.1 PBMC中抗真菌感染免疫的ROS生成 在酵母來源的Zymosan顆?；蝠酄钇棵够铈咦哟碳ず?，患者與健康對(duì)照組PBMC中ROS生成均增加，但兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖4A)。

2.5.2 PBL中Th細(xì)胞分化比例 鑒于CARD9在抗真菌免疫中的關(guān)鍵作用，本研究評(píng)估了患者和8名健康對(duì)照者的Th1和Th17細(xì)胞比例。結(jié)果顯示，與健康對(duì)照者相比，患者的Th1和Th17細(xì)胞比例明顯減少，分別為0.88%和0.94%；而有抑制抗真菌作用的Th2細(xì)胞比例為9.18%，明顯高于健康者(圖5A)。

2.5.3 PBMC中抗真菌感染免疫相關(guān)細(xì)胞因子的分泌水平 宿主抗真菌感染免疫依賴天然免疫和適應(yīng)性免疫。利用熱滅活疣狀瓶霉腫脹孢子刺激PBMC 24 h后，發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照者相比，患者PBMC中對(duì)下游適應(yīng)性免疫有重要影響的天然免疫相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α(P<0.01)、IL-1β(P<0.05)、IL-6(P<0.05)的分泌均表現(xiàn)出明顯缺失，幾乎與未刺激狀態(tài)持平(圖4B)。而刺激6 d后，細(xì)胞因子GM-CSF(圖6)，Th1細(xì)胞效應(yīng)因子IFN-γ 及Th17細(xì)胞效應(yīng)因子IL-17A、IL-22的表達(dá)與健康對(duì)照者相比也出現(xiàn)缺失，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖5B～5D)。

A: PBMCs of 8 healthy donors and the patient were activated by anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody, and the proportions of Th1 cells (CD4+/ IFN-γ+), Th17 cells (CD4+/IL-17A+) and Th2 cells (CD4+/IL-4+) in PBLs were analyzed by using fluorescence-activated cell sorting. B: Adaptive immune-related cytokine productions tested by ELISA. The patient’s and control PBMCs were incubated with HK-P.verrucosaswollen conidia for 6 d, then the concentrations of IL-17A, IL-22 and IFN-γ in culture supernatants were assessed. Results are mean±SD of two independent experiments, 6 healthy control subjects tested in parallel.*P<0.05. n.s., not significant.

圖5CARD9突變對(duì)患者適應(yīng)性免疫功能的影響

Fig.5 Effect ofCARD9 mutations on adaptive immune function

After stimulation by HK-P.verrucosaswollen conidia for 6 d, the production of GM-CSF was decreased detected by ELISA. Results are mean±SD of two independent experiments.*P<0.05. n.s., not significant.

圖6CARD9突變患者PBMC中GM-CSF分泌缺乏

Fig.6 Impaired response of GM-CSF in PBMCs of the patient withCARD9 mutations

3 討論

暗色絲孢霉病包括從淺表到深部器官的多種感染，其中皮膚和皮下組織暗色絲孢霉病最為常見。致病菌包括外瓶霉、瓶霉等，臨床主要表現(xiàn)為孤立性的皮下膿腫或化膿性肉芽腫。系統(tǒng)性暗色絲孢霉病在國內(nèi)外均鮮見報(bào)道，文獻(xiàn)報(bào)道包括暗色真菌性鼻竇炎、咽部暗色絲孢霉病、肺部暗色絲孢霉病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)暗色絲孢霉病等，常表現(xiàn)為化膿性、肉芽腫性炎性損傷，可有組織壞死。其中引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的致病菌有斑替枝孢霉、皮炎外瓶霉等。Keyser等[8]報(bào)道1例心臟移植后出現(xiàn)播散性斑替枝孢霉感染致死病例，患者皮膚、腦及肺均受累，采取手術(shù)切除聯(lián)合大劑量伊曲康唑治療無效。我國也有皮炎外瓶霉、甄氏外瓶霉[9]等引起系統(tǒng)性暗色絲孢霉病的報(bào)道，其中3例皮炎外瓶霉感染患者合并中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染[10]，但無全身皮膚感染播散，病程較短，病情進(jìn)展迅速，患者很快出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀并死亡。本例患者由疣狀瓶霉感染引起皮膚及皮下組織暗色絲孢霉病，病程達(dá)18年，遷延難治，造成耳郭缺如、毀容等損毀性改變，感染不斷加重，呈全身播散征象，并侵犯鼻咽部，出現(xiàn)顱內(nèi)病灶，進(jìn)展為播散性暗色絲孢霉病。中樞神經(jīng)系統(tǒng)暗色絲孢霉病可由鼻旁竇感染直接蔓延或由肺部或皮膚感染灶經(jīng)過血行播散導(dǎo)致，而本研究中患者頭面部及鼻咽部均出現(xiàn)真菌感染，因此其顱內(nèi)病灶不排除為感染直接蔓延所致，治療棘手，危及生命，給臨床工作帶來極大挑戰(zhàn)。

既往報(bào)道疣狀瓶霉感染引起播散性暗色絲孢霉病與宿主免疫缺陷有關(guān)，包括HIV感染、長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素及T細(xì)胞免疫功能受損等[11]。近年來，CARD9在抗真菌感染中的重要作用受到廣泛關(guān)注。除無義突變、移碼突變導(dǎo)致CARD9蛋白表達(dá)缺失而發(fā)生真菌感染外，CARD9錯(cuò)義突變導(dǎo)致蛋白功能缺失引起患者真菌感染的報(bào)道也逐漸增多。Drewniak等[5]發(fā)現(xiàn)1例都柏林念珠菌性腦膜炎患者CARD9發(fā)生了復(fù)合雜合錯(cuò)義突變(p.Gly72Ser和p.Arg373Pro)。Lanternier等[12-14]、Grumach等[15]和Alves de Medeiros等[16]相繼報(bào)道了與CARD9純合錯(cuò)義突變R101C、R18W、R70W、R35Q相關(guān)的難治性皮膚癬菌病、播散性皮炎外瓶霉病、白念珠菌性腦膜腦炎、光滑念珠菌性腦膜腦炎，以及腸炎、慢性皮膚黏膜念珠菌病等疾病。結(jié)合患者臨床表現(xiàn)和既往CARD9相關(guān)研究，考慮該患者存在遺傳免疫缺陷問題，檢測(cè)CARD9基因發(fā)現(xiàn)兩個(gè)復(fù)合雜合錯(cuò)義突變(p.R35Q和p.E81K)，其父母CARD9基因均為雜合突變，符合孟德爾遺傳定律，CARD9蛋白表達(dá)不缺失。

CARD9存在于人體多種組織中，如肝、脾、外周血、骨髓，并高度表達(dá)于骨髓來源巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞等髓系細(xì)胞中[17]。 CARD9作為CLR、Nod樣受體等模式識(shí)別受體的下游重要連接蛋白，可與胞內(nèi)B細(xì)胞淋巴瘤因子10( B cell lymphoma 10，BCL10)及胃腸黏膜相關(guān)淋巴組織1(mucosa-associated lymphoid tissue 1，MALT1)結(jié)合形成CBM復(fù)合物，激活天然免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，發(fā)揮抗真菌免疫作用[18]。本課題組Wang等[4]曾報(bào)道4例頑固性難治皮下型暗色絲孢霉病，患者存在CARD9基因無義和(或)移碼突變，造成CARD9蛋白缺失。體外實(shí)驗(yàn)提示，CARD9基因缺陷樹突細(xì)胞誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化的能力降低，導(dǎo)致患者皮下疣狀瓶霉感染遷延不愈。Liang等[19]研究CARD9基因缺陷患者，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示CARD9參與中性粒細(xì)胞抗疣狀瓶霉過程中細(xì)胞因子TNF-α、IL-8、IL-6的表達(dá)。Wu等[20]利用CARD9基因敲除小鼠建立疣狀瓶霉感染的暗色絲孢霉病模型，模擬CARD9缺陷患者的疣狀瓶霉感染，發(fā)現(xiàn)CARD9基因敲除小鼠疣狀瓶霉易感性明顯增加，感染后期還可發(fā)生腦、肺、肝、脾、腎、淋巴結(jié)等全身多系統(tǒng)播散，死亡率為100%。本例患者疣狀瓶霉感染逐漸播散至全身，發(fā)生播散性暗色絲孢霉病，CARD9基因?yàn)樾掳l(fā)錯(cuò)義突變，CARD9蛋白表達(dá)不缺失，免疫學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)外周血中Th1和Th17細(xì)胞比例減少，CARD9突變的PBMC中疣狀瓶霉孢子刺激后的ROS生成雖不缺乏，但天然免疫細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6，以及適應(yīng)性免疫細(xì)胞因子IFN-γ、IL-17、IL-22分泌缺陷，GM-CSF分泌減少，清除真菌能力減弱，導(dǎo)致患者真菌感染癥狀進(jìn)行性加重。

隨著人們對(duì)CARD9基因缺陷等免疫缺陷病的真菌易感性的認(rèn)識(shí)不斷提高，嘗試通過免疫治療來糾正免疫缺陷患者難治性真菌感染的報(bào)道相繼出現(xiàn)。Gavino等[21]采用皮下注射GM-CSF成功緩解了1例CARD9缺陷的白念珠菌性腦膜腦炎患者癥狀。Celmeli等[22]采用皮下注射粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)，也使CARD9缺陷的難治性白念珠菌性腦膜腦炎患者痊愈；與使用GM-CSF相比，治療時(shí)間縮短且效果持續(xù)。本例患者曾接受皮下注射IFN、GM-CSF等免疫治療措施，但未見明顯效果。治療效果的差異可能與感染的菌種特異性、器官特異性及患者免疫狀況相關(guān)。盡管免疫治療應(yīng)用于此類頑固性難治暗色真菌感染還有很長(zhǎng)的路要走，但相信隨著對(duì)不同真菌成分及毒力的進(jìn)一步研究，對(duì)宿主抗真菌免疫的深入認(rèn)識(shí)及遺傳學(xué)的不斷發(fā)展，未來會(huì)研發(fā)出新的疫苗、細(xì)胞因子制劑等免疫治療及基因治療方法，為患者健康帶來福音。

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. LI Ruoyu, E-mail: mycolab@126.com

CARD9 mutations and related immunological research of one case with disseminated phaeohyphomycosis

ZHANG Ruijun, WANG Xiaowen, WAN Zhe, LI Ruoyu

DepartmentofDermatologyandVenereology,PekingUniversityFirstHospital,ResearchCenterforMedicalMycology,PekingUniversity,BeijingKeyLaboratoryofMolecularDiagnosisofDermatoses,Beijing100034,China

Phaeohyphomycosis is a collection of superficial cutaneous, subcutaneous and(or) systemic infections caused by diverse dematiaceous fungi. The clinical records and clinical samples collected from a patient with a diagnosis of skin and subcutaneous phaeohyphomycosis progressed to disseminated phaeohyphomycosis were subjected to assays for potential genetic and immune defects that might associate with the infection. Two new compound heterozygous missense mutations on caspase recruitment domain-containing protein 9 gene (CARD9) (p.R35Q and p.E81K) were detected. Compared with the healthy donors, the proportions of Th1 and Th17 cells in the patient’s peripheral blood lymphocytes (PBLs) were low and the patient’s peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) had impaired innate and adaptive immune responses againstPhialophoraverrucosa(P.verrucosa). The results indicated that CARD9 protein may play an important role in the pathogenesis of phaeohyphomycosis.

Disseminated phaeohyphomycosis;CARD9;Phialophoraverrucosa; Peripheral blood mononuclear cell; Immunodeficiency

國家自然科學(xué)基金(81472890)，北京大學(xué)“985工程”臨床醫(yī)院合作專項(xiàng)(2014-1-3)

李若瑜

2016-11-11)