朱伶俐　葉迅

[摘要] 目的 通過觀察雷公藤內(nèi)酯醇（TP）對高糖刺激下ILK、MMP9、NEPH1蛋白表達的影響，探討TP抑制足細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化（EMT）治療糖尿病腎病的可能機制。 方法 將培養(yǎng)分化成熟的足細(xì)胞分為對照組（D-葡萄糖5 mmol/L）、高糖組（D-葡萄糖25 mmol/L）、低TP組（25 mmol/L D-葡萄糖+8 ng/mL TP）、中TP組（25 mmol/L D-葡萄糖+16 ng/mL TP）以及高TP組（25 mmol/L D-葡萄糖+ 32 ng/mL TP）。體外培養(yǎng)48 h后，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，并采用PCR半定量分析技術(shù)檢測ILK、MMP9、NEPH1的表達。 結(jié)果 高糖刺激下足細(xì)胞NEPH1的表達較對照組顯著減少（P<0.01），而ILK、MMP9的mRNA表達較對照組顯著升高（P<0.01）。各劑量TP組足細(xì)胞NEPH1 mRNA的表達均較高糖組明顯上調(diào)（P<0.01），ILK、MMP9 mRNA的表達較高糖組明顯下降（P<0.01），其中以中TP組的干預(yù)作用最顯著（P<0.01）。 結(jié)論 TP可能通過抑制ILK信號通路來抑制足細(xì)胞EMT。

[關(guān)鍵詞] 雷公藤內(nèi)酯醇；足細(xì)胞；高糖；上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化

[中圖分類號] R197 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）31-0001-04

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是一類以進行性腎臟纖維化為特征的疾病，是糖尿病最主要的微血管并發(fā)癥之一。其最主要的臨床表現(xiàn)為蛋白尿，而腎小球纖維化是產(chǎn)生蛋白尿的組織學(xué)基礎(chǔ)。足細(xì)胞通過已分化上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（Mesenchymal transdifferentiation，EMT），是影響腎小球濾過屏障功能和結(jié)構(gòu)，使腎小球纖維化的重要因素[1]。其特點為失去上皮細(xì)胞特征如足細(xì)胞裂孔膜蛋白（nephrin）和NEPH1～3等，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞特殊蛋白l（fibroblast-specific protein 1，F(xiàn)SP-1）、整合素連接激酶（ILK）、細(xì)胞外基質(zhì)纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）和基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）等間充質(zhì)細(xì)胞樣表型標(biāo)志物表達上調(diào)[2]。已發(fā)現(xiàn)的介導(dǎo)足細(xì)胞EMT的主要信號通路有TGF-β/smad、integrin/ILK和Wnt/β-acatenin三條。三條通路既有各自的信號傳導(dǎo)路徑，又在不同層面相互連接、整合，組成錯綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)控足細(xì)胞的EMT過程。其中，ILK信號通路在足細(xì)胞EMT的過程中起重要的調(diào)節(jié)作用[3]。

雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.F.，TwHF）是藤本植物雷公藤的干燥塊根，中藥學(xué)認(rèn)為其味苦、辛，性寒，有大毒，歸肝、腎經(jīng)。功能祛風(fēng)除濕 、通絡(luò)止痛，兼殺蟲解毒。臨床主要用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎臟疾病等炎性和自身免疫性疾病。其用于治療腎病已有30余年歷史 ，從最初的生藥煎劑到雷公藤提取物，取得了令人矚目的療效[4]。雷公藤內(nèi)酯醇（triptolide，TP）是從其中分離所得的一種二萜類化合物，可通過靶向轉(zhuǎn)錄因子、激酶或抑制泛素/蛋白酶體等機制發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖和促腫瘤細(xì)胞凋亡等抗腫瘤作用[5]。大量體內(nèi)外研究均證實，雷公藤內(nèi)酯醇具有保護足細(xì)胞、抑制蛋白尿的作用[6，7]。本研究觀察TP通過對ILK信號通路的調(diào)節(jié)作用，干預(yù)高糖誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞EMT，探討TP對高糖環(huán)境下受損足細(xì)胞的可能保護機制。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 細(xì)胞 本研究采用的小鼠腎小球足細(xì)胞為英國倫敦大學(xué)國王學(xué)院Guy's 醫(yī)院贈送。

1.1.2 藥物 葡萄糖（中國大冢制藥有限公司），雷公藤內(nèi)酯醇（杭州達文生物技術(shù)有限公司）。

1.2 儀器與試劑

超凈工作臺，空氣過濾器（北京市昌平長城空氣凈化設(shè)備公司），恒溫 CO2培養(yǎng)箱（B5060EK/CO2德國產(chǎn)），450 型自動酶標(biāo)儀（MuLtiskan Ascent V1. 24345-00627T），伯樂PCR 儀，凝膠成像系統(tǒng)（ BIO-RAD），RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清（美國GIBCO公司），γ-干擾素（美國PEPROTECH公司），Trizol提取試劑盒（美國Invitrogen公司），RT-PCR試劑盒（日本TaKaRa公司），引物合成（PRIMER5.0引物軟件設(shè)計，上海生物工程公司合成），SDS-PAGE凝膠試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇后的小鼠足細(xì)胞加入含有5 mL 10% FCS1640培養(yǎng)液的50 mL培養(yǎng)瓶中，每瓶加入500 U γ-干擾素。置33℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育，細(xì)胞增殖傳代后，轉(zhuǎn)移入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱（含有5 mL 10%FCS1640培養(yǎng)液，不加干擾素）分化成熟（細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)為“樹枝狀”）。

1.3.2 實驗分組 將分化成熟的足細(xì)胞接種至50 mL 細(xì)胞培養(yǎng)瓶，采用RandA 1.0軟件完全隨機分組法分為5 組，每組5 瓶細(xì)胞，對照組（Control Group：D-葡萄糖5 mmol/L）、高糖組（HG：D-葡萄糖25 mmol/L）、低TP組（LTP：25 mmol/L D-葡萄糖+8 ng/mL TP）、中TP組（MTP：25 mmol/L D-葡萄糖+16 ng/mL TP）和高TP組（HTP：25 mmol/L D-葡萄糖+32 ng/mL TP）。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育48 h后倒置顯微鏡下觀察足細(xì)胞形態(tài)變化，并檢測各組足細(xì)胞ILK、MMP9 和NEPH1的表達。

1.3.3 RT -PCR 半定量法檢測ILK、MMP9、NEPH1 RNA 表達 Trizol 試劑和氯仿抽提足細(xì)胞總 RNA ，微量核酸測量儀測定每個RNA樣品濃度（單位為μg/mL）；逆轉(zhuǎn)錄酶M-MuLV 催化下合成 cDNA；在DNA 自動擴增儀上進行 PCR 反應(yīng)。25 μL反應(yīng)體系中含10×buffer 2.5 μL，dNTP 0.5 μL，引物正反義鏈各10 pmol，TaqDNA 聚合酶（購自上海博亞）1.5 U，cDNA 1 μL，加去離子水至終體積25 μL，石蠟油封閉。陰性對照以雙蒸水替代cDNA。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）引物均根據(jù)已知的小鼠ILK、MMP9、NEPH1和GAPDH 的基因序列由 PRIMER 5.0 引物軟件設(shè)計，由上海生物工程公司合成。見表 1。

1.3.4 擴增反應(yīng)條件 在94℃ 2 min進行預(yù)變性后：（1）NEPH1：94℃30 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，進行35個循環(huán)。（2）ILK：95℃ 3 min，進入34個循環(huán)，94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 60 s，進行34個循環(huán)。（3）MMP9： 94℃30 s、56℃ 30 s、72℃ 60 s，進行33個循環(huán)。（4）GAPDH：94℃ 30 s、59.8℃ 30 s、72℃ 30 s，進行25個循環(huán)。完成循環(huán)后，在72℃ 2 min進行終延伸。各PCR產(chǎn)物與DNA Marker（購自上海生物工程公司）在1.7%瓊脂糖凝膠（含0.5 μg/mL溴化乙錠），0.5%TBE液中電泳（100 V，30 min），用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)成像，凝膠定量軟件Quantity-one分析其光密度值，以GAPDH為內(nèi)參照基因，比較各目的基因條帶與內(nèi)參照基因條帶的光密度比值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）進行統(tǒng)計學(xué)描述，對高糖組與對照組行t檢驗，高糖組與其余各組行單因素方差分析（ANOVA），方差齊時，兩兩比較采用LSD檢驗，方差不齊時用Tamhane檢驗，α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 小鼠足細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變

倒置顯微鏡（放大倍數(shù)400倍）觀察足細(xì)胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)對照組足細(xì)胞呈“分支狀”，分步均勻，細(xì)胞與細(xì)胞之間以“樹枝狀”足突相連，生長旺盛；高糖刺激48 h后，足細(xì)胞足突短少，局部聚集；低TP組可見足細(xì)胞形態(tài)尚可，足突較對照組短少，貼壁一般，生長尚可；中TP組足細(xì)胞足突較對照組少，但較高糖組多，細(xì)胞生長旺盛；高TP組足細(xì)胞形態(tài)尚可，足突粗短，部分細(xì)胞聚集。由封三圖1可見，對照組足細(xì)胞形態(tài)呈分化成熟的“樹枝狀”，生長旺盛，而高糖組足細(xì)胞足突短少，且有部分細(xì)胞死亡。與高糖組比較，細(xì)胞形態(tài)上，TP各組細(xì)胞足突均增多，尤以中TP組明顯；細(xì)胞生長方面，低TP組和中TP組細(xì)胞生長旺盛，高TP組細(xì)胞部分聚集，與高糖組相似。

2.2 對高糖刺激下足細(xì)胞ILK、MMP9、NEPH1 mRNA表達的影響

與對照組比較，高糖組ILK mRNA及MMP9 mRNA表達顯著升高（P<0.01），NEPH1 mRNA的表達顯著降低（P<0.01）。與高糖組比較，不同劑量的TP均能顯著降低ILK mRNA及MMP9 mRNA的表達（P<0.01），其中以中TP組的降低最明顯（P<0.01）。與高糖組比較，不同劑量的TP均能顯著上調(diào)NEPH1 mRNA的表達（P<0.01），其中以中TP組的升高最明顯（P<0.01）。見表2、3，封三圖 2、3。

3 討論

糖尿病腎?。―N）是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，其特征性的臨床表現(xiàn)即蛋白尿，而蛋白尿的形成與腎小球濾過屏障功能和結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。足細(xì)胞EMT是影響腎小球濾過屏障功能的關(guān)鍵病理學(xué)變化，是引發(fā)早期蛋白尿的主要原因[8]。研究表明，通過抑制足細(xì)胞的EMT，可使足細(xì)胞能恢復(fù)至正常的上皮細(xì)胞表型[9]。

已發(fā)現(xiàn)的介導(dǎo)足細(xì)胞EMT的主要信號通路有TGF-β/smad、integrin/ILK和Wnt/β-acatenin三條。ILK信號通路中，ILK是一種存在于細(xì)胞胞質(zhì)中的絲/蘇氨酸蛋白激酶，是參與細(xì)胞內(nèi)外信號傳導(dǎo)通路形成的重要介質(zhì)，調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、生存、分化和凋亡，在維持足細(xì)胞生物學(xué)特性上有重要意義[3]。ILK可與nephrin相互作用，從而建立起連接細(xì)胞-基質(zhì)integrin信號通路與細(xì)胞-細(xì)胞信號通路的分子橋梁，可直接磷酸化下游幾個重要的激酶，包括Akt和GSK-313，導(dǎo)致β-catenin的穩(wěn)定[10，11]。有研究發(fā)現(xiàn)激活的ILK能直接磷酸化糖原合成酶激酶-3（glyeogen synthase kinase-3，GSK-3），后者的磷酸化可激活活化蛋白-1（activatorprotein-1，AP-1），使MMP9的表達增加[12]。目前認(rèn)為[13]ILK信號通路的失調(diào)，是引起慢性腎炎以及腎臟纖維化的重要原因。通過抑制ILK來達到延緩或逆轉(zhuǎn)EMT成為研究熱點。Huber MA等[14]通過研究體內(nèi)給予ILK小分子抑制劑可減少白蛋白尿，能減少足細(xì)胞上間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA和MMP9的表達，恢復(fù)足細(xì)胞特異性標(biāo)志物nephrin的表達，保護足細(xì)胞免受損傷，從而保護腎小球濾過屏障功能。

腎小球足細(xì)胞發(fā)生EMT后間充質(zhì)細(xì)胞的表面標(biāo)志物之一的MMP9，是以Ⅳ型膠原為主要降解底物的明膠酶。足細(xì)胞發(fā)生EMT時，MMP9的表達顯著增高，造成基底膜Ⅳ型膠原合成和分解失平衡，進而引發(fā)腎小球濾過膜、腎小球系膜病理學(xué)改變。

腎小球足細(xì)胞相關(guān)蛋白1（NEPH1）是一種在足細(xì)胞裂孔隔膜上表達的跨膜蛋白，具有組成濾過屏障和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能。它與nephrin有密切的相互作用，極可能與nephrin有同源性或相似性[15]。與nephrin類似，NEPH1能以相互交錯的形式形成拉鏈樣結(jié)構(gòu)，起到分子屏障作用，是維持裂孔隔膜的完整性及濾過屏障的重要蛋白[16]。研究表明，NEPH1可以有效保護足細(xì)胞，防止損害。調(diào)節(jié)NEPH1的表達，已成為保護足細(xì)胞的治療新法[17]。

雷公藤制劑治療糖尿病腎病已在臨床上廣泛應(yīng)用，而其作用機制尚需探討。已有研究證實，雷公藤甲素可上調(diào)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞nephrine 和podocin mRNA及其蛋白表達[18]。此外，TP還通過調(diào)節(jié)Smad信號途徑減輕腎臟纖維化程度[19]。也有研究發(fā)現(xiàn)，TP能夠有效遏制p-38 MAPK信號通路的活化，顯著降低p-38 MAPK的磷酸化水平，從而保護足細(xì)胞[20-24]。然而，目前尚缺乏對TP調(diào)節(jié)ILK信號通路體外干預(yù)足細(xì)胞EMT的研究。本實驗通過研究其對高糖誘導(dǎo)下足細(xì)胞的ILK、MMP9、NEPH1的表達調(diào)節(jié)的影響，進一步了解雷公藤治療糖尿病腎病的機制。

本研究發(fā)現(xiàn)，在25 mmol/L高糖誘導(dǎo)下足細(xì)胞發(fā)生了EMT，表現(xiàn)為NEPH1表達明顯降低，而足細(xì)胞的ILK、MMP9的表達顯著升高，提示足細(xì)胞的EMT過程中，ILK通路被過度激活，使MMP9表達升高，破壞基底膜Ⅳ型膠原合成和分解平衡，影響了足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。使用不同劑量TP干預(yù)高糖誘導(dǎo)下的足細(xì)胞與高糖組比較，ILK、MMP9的表達均有不同程度的下調(diào)，NEPH1的表達則呈不同程度的上調(diào)；尤以中TP組（16 ng/mL）的表達變化最顯著。

本研究表明TP可通過有效降低ILK表達，抑制ILK信號通路的活性，從而減少ILK參與其他誘導(dǎo)足細(xì)胞EMT信號通路的影響，進而降低MMP9的表達，維持足細(xì)胞基底膜的完整性，同時上調(diào)受高糖影響而被抑制的NEPH1表達。提示TP可通過調(diào)節(jié)ILK、MMP9和NEPH1表達來抑制足細(xì)胞受高糖誘導(dǎo)的EMT，從而保護高糖環(huán)境下受損的足細(xì)胞，減少蛋白尿的產(chǎn)生，延緩糖尿病腎病的進展。而本研究提示以中劑量TP干預(yù)效果最明顯，并非呈劑量依賴性。高劑量TP的療效反而減弱，這是否與其細(xì)胞毒性有關(guān)，尚需進一步研究證實。

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（收稿日期：2016-07-11）