林坤寧　馬劍　袁東星　黃勇明　馮思超　吳巧玲

摘要建立了一種無(wú)閥連續(xù)流動(dòng)分析方法和裝置，僅用一臺(tái)多通道蠕動(dòng)泵傳送試劑和樣品，無(wú)需依靠注入閥、電磁閥和定量環(huán)進(jìn)行試劑或樣品的選擇和定量輸入。樣品通過(guò)銅鎘還原柱，將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，然后用重氮偶氮光度法進(jìn)行測(cè)定。研究結(jié)果表明，硝酸鹽的線性范圍為5～180 μmol/L，方法檢出限為0.27 μmol/L，對(duì)10 和80 μmol/L硝酸鹽溶液連續(xù)測(cè)定11次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.4%和1.3%，不同鹽度的實(shí)際水樣加標(biāo)回收率在99.4%～106.1%之間。測(cè)定結(jié)果與流動(dòng)注射分析法相比，無(wú)顯著性差異。與流動(dòng)注射分析相比，無(wú)閥設(shè)計(jì)裝置大大降低了成本，操作更加簡(jiǎn)便，有利于在普通實(shí)驗(yàn)室或現(xiàn)場(chǎng)連續(xù)監(jiān)測(cè)中推廣使用。本方法成功應(yīng)用于廈門西港海水樣品中硝酸鹽的測(cè)定以及九龍江河口區(qū)的硝酸鹽走航式監(jiān)測(cè)。

關(guān)鍵詞 無(wú)閥； 連續(xù)流動(dòng)分析； 海水； 硝酸鹽

1引 言

硝酸鹽作為一種常見(jiàn)的營(yíng)養(yǎng)鹽，廣泛存在于各種水體中。過(guò)多的硝酸鹽進(jìn)入水環(huán)境，會(huì)導(dǎo)致水體富營(yíng)養(yǎng)化[1]，因此檢測(cè)海水中的硝酸鹽含量具有重要意義?！逗Ｑ蟊O(jiān)測(cè)規(guī)范》中規(guī)定，利用手工操作將樣品通過(guò)銅鎘還原柱，將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，然后以重氮偶氮光度法進(jìn)行測(cè)定[2]。該方法的還原效率高，但操作過(guò)程繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，且手工操作帶來(lái)的人為誤差大，不適合大量樣品的快速和現(xiàn)場(chǎng)分析。目前，已有商品化的營(yíng)養(yǎng)鹽自動(dòng)分析儀，如德國(guó)的BRAN+LUEBBE AutoAnalyzer 3、荷蘭的SKALAR等[3，4]，這些儀器基于氣泡間隔連續(xù)流動(dòng)分析（Segmented continous flow analysis， SCFA）技術(shù)，自動(dòng)化程度高，分析速度較快，但儀器價(jià)格昂貴?，F(xiàn)今，流動(dòng)注射分析（Flow injection analysis， FIA）技術(shù)在海水水質(zhì)監(jiān)測(cè)中得到了廣泛開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，基于FIA原理研發(fā)了硝酸鹽測(cè)定系統(tǒng)[5～7]，這些系統(tǒng)均使用了注入閥（Injection valve）或電磁閥（Solenoid valve）進(jìn)行試樣或試劑的定量，以提高分析的精密度以及重現(xiàn)性。但各種閥的價(jià)格較高，且控制程序復(fù)雜，不利于普通實(shí)驗(yàn)室的推廣及應(yīng)用。如能以某種裝置或方式取代閥，一定程度上將降低實(shí)驗(yàn)成本，簡(jiǎn)化控制程序。目前，有研究者利用注射泵定量地將試劑注入樣品，同時(shí)測(cè)定了4種金屬元素，但其利用的化學(xué)反應(yīng)只需單一試劑[8]。而對(duì)于需用銅鎘還原柱還原硝酸鹽的測(cè)定，單一試劑顯然不能滿足分析要求。為了注入多種試劑，閥的使用不可缺少[9，10]。

本課題組研發(fā)了一種無(wú)閥連續(xù)流動(dòng)分析系統(tǒng)[11]，利用連續(xù)流動(dòng)的方式，直接將試劑與樣品混合，不需要閥，但會(huì)在流路中引入大量氣泡； 獨(dú)特的流通池結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)可避免流路中氣泡對(duì)檢測(cè)信號(hào)的影響，已成功應(yīng)用于亞硝酸鹽、磷酸鹽和硅酸鹽的測(cè)定。但對(duì)于采用銅鎘還原柱還原硝酸鹽的測(cè)定，進(jìn)入還原柱的氣泡會(huì)使得鍍?cè)阪k表面的銅發(fā)生氧化，大大影響硝酸鹽的還原效率。本研究對(duì)上述原先的系統(tǒng)進(jìn)行改進(jìn)，在還原柱的前端增加一個(gè)除氣泡裝置，可有效去除切換樣品時(shí)產(chǎn)生的氣泡，避免氣泡進(jìn)入還原柱。改進(jìn)后的系統(tǒng)成功用于廈門西港海水樣品中硝酸鹽的測(cè)定以及九龍江河口區(qū)的硝酸鹽走航式監(jiān)測(cè)。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

USB 2000+光纖光譜儀和LS1LL鹵鎢燈光源（美國(guó)Ocean Optics公司）； BT1001L型六通道蠕動(dòng)泵、內(nèi)徑 0.5 mm和2.0 mm硅橡膠蠕動(dòng)泵泵管（保定蘭格恒流泵有限公司）； 流路管道為內(nèi)徑1.0 mm的聚四氟乙烯管（Polytetrafluoroethylene， PTFE）； 數(shù)據(jù)采集軟件使用Labview 8.2（美國(guó)National Instruments公司）編寫(xiě)； 實(shí)驗(yàn)室自制流通池（光程1.2 cm）。

實(shí)驗(yàn)用水為超純水（電阻率≥18.2 MΩ·cm， MilliQ Element系統(tǒng)， 美國(guó)Millipore公司）。如無(wú)特別說(shuō)明，所用試劑均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)的分析純?cè)噭?00 mmol/L硝酸鹽貯備液：稱取1.0100 g經(jīng)110℃干燥2 h 的KNO3，溶解并定容至100 mL，于4℃保存，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液由此貯備液經(jīng)適當(dāng)稀釋得到?；旌巷@色試劑：2.5 g磺胺（Sulfonamide， SAM）溶于450 mL 5%（V/V）HCl（優(yōu)級(jí)純）中，加入0.25 g鹽酸萘乙二胺（N（1Naphthyl） ethylenediamine dihydrochloride， NED），以5%（V/V）HCl定容至500 mL。人工海水（鹽度35）：稱取31 g NaCl和10 g Mg2SO4，溶于超純水中，并稀釋至1 L，貯存于聚乙烯瓶中，其它鹽度的人工海水由此稀釋得到。NH4ClNaOH緩沖溶液（2.5%， m/V）用5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH 8.3。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

無(wú)閥連續(xù)流動(dòng)分析系統(tǒng)的流路如圖1所示，主要由兩個(gè)蠕動(dòng)泵組成。蠕動(dòng)泵1將樣品以較快流速輸送到除氣泡裝置中，完成一次進(jìn)樣后手動(dòng)切換至超純水，進(jìn)行清洗，切換過(guò)程因蠕動(dòng)泵1持續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)而在管道中引入的氣泡在除氣泡裝置中被除去。除氣泡裝置中存留的樣品溶液由流速較慢的蠕動(dòng)泵2吸取，多余的樣品經(jīng)蠕動(dòng)泵1吸取排出。蠕動(dòng)泵2吸取的樣品溶液與緩沖溶液混合后進(jìn)入銅鎘還原柱，將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。 實(shí)驗(yàn)中使用的流通池為實(shí)驗(yàn)室自行研制[11]， 容積較大，需保證適量試樣充滿流通池進(jìn)行檢測(cè)。但是，若將大量試樣直接通過(guò)銅鎘還原柱，會(huì)降低還原柱的使用壽命?？紤]到江河及近岸海域的硝酸鹽濃度通常較高，對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋后仍可準(zhǔn)確定量，因此，將少量還原后的樣品與超純水混合，稀釋后再與混合顯色劑混合，進(jìn)入置于水浴鍋中的反應(yīng)盤管，最后流入流通池測(cè)定。

2.3樣品采集

廈門西港表層海水樣品于2015年12月26日用PVC采樣桶采集，裝于250 mL聚乙烯瓶并冷藏保存，24 h內(nèi)測(cè)定。

九龍江河口區(qū)域的走航式監(jiān)測(cè)，于2016年4月9日在廈門大學(xué)“海洋2號(hào)”科考船上執(zhí)行，用船上配備的海水采集設(shè)備將表層海水抽至甲板上的自制過(guò)濾裝置中，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后與本套裝置聯(lián)用。走航過(guò)程中，用100 mL聚乙烯瓶人工采集數(shù)個(gè)過(guò)濾后的樣品并冷藏保存，記錄采樣時(shí)間，用于實(shí)驗(yàn)室比對(duì)分析。

3結(jié)果與討論

3.1實(shí)驗(yàn)參數(shù)的優(yōu)化

本裝置用蠕動(dòng)泵作為輸液動(dòng)力，使水樣通過(guò)銅鎘還原柱，將硝酸鹽定量還原為亞硝酸鹽，然后與顯色劑混合。在酸性介質(zhì)中，亞硝酸鹽與顯色劑中的SAM進(jìn)行重氮化反應(yīng)，其產(chǎn)物再與NED偶合生成紅色偶氮染料，于543 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。通過(guò)計(jì)算，得到亞硝酸鹽氮的總量，扣除水樣中原有的亞硝酸鹽含量，得到硝酸鹽含量。本研究中亞硝酸鹽含量由另一通道（不含銅鎘還原柱）測(cè)定得到。實(shí)際環(huán)境監(jiān)測(cè)中，硝酸鹽含量和亞硝酸鹽含量是同時(shí)獲得的。

在前期研究[11]中，已對(duì)亞硝酸鹽測(cè)定的各參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，包括進(jìn)樣時(shí)間、顯色試劑濃度、反應(yīng)盤管長(zhǎng)度、流速、反應(yīng)溫度等，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了進(jìn)樣時(shí)間和顯色試劑濃度。反應(yīng)盤管長(zhǎng)度為2.5 m，反應(yīng)溫度為50℃?？紤]到水樣過(guò)銅鎘柱時(shí)將產(chǎn)生一定柱壓及保證還原效率，流速調(diào)整為9.5 mL/min。 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)以含20 μmol/L 硝酸鹽的純水加標(biāo)試樣作為測(cè)試樣，所有樣品均測(cè)定至少3次，優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)圖2。

保持SAM濃度為5 g/L，NED濃度為0.5 g/L不變，對(duì)樣品進(jìn)樣時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。進(jìn)樣時(shí)間依次為5， 10， 15， 20， 25， 30， 35， 40和45 s，隨著進(jìn)樣時(shí)間延長(zhǎng)，硝酸鹽的信號(hào)吸光值增加，并在35 s后峰高基本保持穩(wěn)定，如圖2A所示。綜合考慮分析速度和峰形等因素，最佳進(jìn)樣時(shí)間選擇為35 s，此時(shí)樣品通過(guò)銅鎘柱的體積為4.0 mL。保持進(jìn)樣時(shí)間為35 s不變，考察顯色試劑濃度對(duì)硝酸鹽的信號(hào)吸光值的影響。隨著試劑濃度增加，信號(hào)吸光值增加，當(dāng)試劑濃度達(dá)到一定量時(shí)，吸光值基本穩(wěn)定。最終選擇顯色試劑濃度分別為： 5 g/L SAM， 0.5 g/L NED（圖2B和2C）。

3.3鹽度的影響

樣品的鹽度越大則離子強(qiáng)度越高，而高離子強(qiáng)度會(huì)影響化學(xué)反應(yīng)速率，從而影響方法靈敏度。為了考察鹽度對(duì)本方法的影響，取鹽度為35的人工海水，用超純水稀釋后得到鹽度分別為0， 7， 14， 21， 28和35的人工海水。以這些不同鹽度的人工海水作為基底，分別配制工作曲線溶液，繪制相應(yīng)的工作曲線。6條工作曲線線性相關(guān)系數(shù)R2在0.9979～0.9995之間，斜率的RSD在±2.5%之內(nèi)，表明鹽度對(duì)本方法的影響可以忽略的，本方法適用于河口及近岸鹽度變化大的區(qū)域，也可用于江、河、湖等地表水中硝酸鹽的分析。

3.4記憶效應(yīng)的影響

在流動(dòng)分析系統(tǒng)中，高濃度樣品的顯色產(chǎn)物若清洗不完全，可能會(huì)對(duì)下一個(gè)樣品的測(cè)定產(chǎn)生影響，故記憶效應(yīng)值得關(guān)注。參照文獻(xiàn)[13]的方法，考察了記憶效應(yīng)對(duì)本方法的影響。取80 μmol/L硝酸鹽為高濃度試樣，連續(xù)測(cè)定3次，平均吸光值為0.4881±0.0031（RSD=0.6%）； 隨后，取10 μmol/L硝酸鹽為低濃度試樣，連續(xù)測(cè)定4次，平均吸光值為0.0538±0.0002（RSD=0.7%）； 再次測(cè)定高濃度試樣，平均吸光值為0.4879±0.0049（RSD=1.0%）； 最后測(cè)定低濃度試樣，平均吸光值為0.0531±0.0005（RSD=1.6%）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，80 μmol/L硝酸鹽前后多次測(cè)定的吸光值為0.4880±0.0036（RSD=0.8%），10 μmol/L硝酸鹽前后多次測(cè)定的吸光值為0.0534±0.0007（RSD=1.3%）。可見(jiàn)，高濃度試樣基本不會(huì)對(duì)下一個(gè)較低濃度試樣的測(cè)定產(chǎn)生影響，記憶效應(yīng)可以忽略。

3.5方法的驗(yàn)證與比對(duì)

用本方法測(cè)定各種實(shí)際水樣中的硝酸鹽，并進(jìn)行基底加標(biāo)，考察基底加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。 加標(biāo)回收率在99.4%±3.4%～106.1%±0.2%之間，說(shuō)明本方法適合用于不同基底樣品的分析，再次證明方法的廣泛適用性。

3.6方法的應(yīng)用

用本方法測(cè)定采自廈門西港的表層海水樣品，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。調(diào)查海域的表層海水中，高潮時(shí)硝酸鹽濃度在59.84～103.2 μmol/L之間，低潮時(shí)硝酸鹽濃度在86.74～177.3 μmol/L之間，低潮時(shí)受九龍江水帶來(lái)的陸源營(yíng)養(yǎng)鹽的影響，硝酸鹽的濃度較高。

2016年4月9日，應(yīng)用本方法與本課題組前期研發(fā)的其它營(yíng)養(yǎng)鹽測(cè)定方法[11]，對(duì)九龍江河口及廈門近岸海域中的硝酸鹽進(jìn)行了走航式監(jiān)測(cè)。走航中同時(shí)采集數(shù)個(gè)水樣，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行比對(duì)測(cè)試。

此次走航式監(jiān)測(cè)同時(shí)獲得了硝酸鹽、亞硝酸鹽、活性磷酸鹽、活性硅酸鹽的高分辨率濃度數(shù)據(jù)，見(jiàn)圖5。監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)表明，各營(yíng)養(yǎng)鹽濃度與鹽度具有良好的相關(guān)性，且各營(yíng)養(yǎng)鹽濃度的變化規(guī)律也較為一致。實(shí)驗(yàn)室分析人工采集的樣品，得到的數(shù)據(jù)與現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定值基本吻合，結(jié)果見(jiàn)圖5。

4結(jié) 論

建立了無(wú)閥連續(xù)分析海水中硝酸鹽的方法，簡(jiǎn)單、快速、實(shí)用，且不受海水鹽度的影響。在優(yōu)化條件下，本方法檢出限為0.27 μmol/L，平行性良好，與流動(dòng)注射法相比，測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異，但成本更低，操作更簡(jiǎn)便。

本方法已成功用于離散樣品測(cè)定以及走航式在線連續(xù)監(jiān)測(cè)，證明其實(shí)用性強(qiáng)，可在普通實(shí)驗(yàn)室推廣使用，有望發(fā)展成為現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)儀器。

AbstractA valvefree continuous flow method and instrument were established， with only a multichannel pump for delivering the sample and reagent， and without any injection or solenoid valves and sample loop for selecting and adding the sample or reagent. Nitrate was reduced to nitrite with CuCd reductant column， and then detected with spectrophotometric detector. The proposed method was suitable for determination of nitrate at normal level in most of estuary and coastal seawaters. With the optimum parameters， the linear range and detection limit were 5-180 μmol/L and 0.27 μmol/L， respectively. The samples of 10 and 80 μmol/L nitrate were continually measured for 11 times， and the relative standard deviations were 1.4% and 1.3%， respectively. The recovery of real samples at different salinity ranged between 99.4% and 106.1%. There was no significant difference in the analytical results between the proposed method and the flow injection analysis （FIA）. In comparison with FIA， the method and instrument were less cost and easy to operate， and was suitable to be applied in general laboratories and field for continuous monitoring. The method was successfully used to measure the nitrate in seawater samples in Xiamen's Western Harbor and monitor nitrate in Jiulongjiang estuary.

KeywordsValvefree； Continuous flow analysis； Seawater； Nitrate