馬春林，吳紅彥，2，3，李海龍，2，陳杰，張宣，李紅亮

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中醫(yī)方藥挖掘和創(chuàng)新轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省中藥新產(chǎn)品創(chuàng)制工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000

參芪抑瘤方藥物血清對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞增殖的影響

馬春林1，吳紅彥1，2，3，李海龍1，2，陳杰1，張宣1，李紅亮1

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中醫(yī)方藥挖掘和創(chuàng)新轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省中藥新產(chǎn)品創(chuàng)制工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000

目的觀察參芪抑瘤方藥物血清對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞增殖的影響，探討其相關(guān)機(jī)制。方法以參芪抑瘤方不同濃度藥物血清干預(yù)胃癌MGC-803細(xì)胞后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，qRT-PCR檢測(cè)CDKN1B、CDKN1C基因表達(dá)，Western blot檢測(cè)p27、p57蛋白表達(dá)。結(jié)果3%、5%、10%藥物血清作用于MGC-803細(xì)胞24、48、72 h，細(xì)胞增殖水平顯著降低（P＜0.01），且與時(shí)間和劑量呈依賴關(guān)系；3%、5%、10%藥物血清作用于MGC-803細(xì)胞24 h后，G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少；qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組和空白血清組比較，藥物血清各劑量組MGC-803細(xì)胞CDKN1B、CDKN1C mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）；Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，藥物血清各劑量組MGC-803細(xì)胞p27、p57蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）。結(jié)論參芪抑瘤方藥物血清可抑制胃癌MGC-803細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)CDKN1B、CDKN1C mRNA和蛋白表達(dá)，進(jìn)而干預(yù)細(xì)胞周期。

參芪抑瘤方；藥物血清；胃癌細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞周期

參芪抑瘤方臨床用于腫瘤的治療，具有益氣扶正、養(yǎng)血活血、化痰散結(jié)、清熱利濕、解毒散結(jié)、通絡(luò)止痛等功效。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上[1-3]，進(jìn)一步探索優(yōu)化后的組方——參芪抑瘤方藥物血清對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞增殖的影響，探討其相關(guān)機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物

參芪抑瘤方（苦參、黃芪、當(dāng)歸、貝母等），飲片由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院楊錫倉(cāng)主任藥師鑒定符合2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定。

1.2 細(xì)胞株

胃癌MGC-803細(xì)胞株受贈(zèng)于甘肅省中醫(yī)方藥挖掘和創(chuàng)新轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)SD雌性大鼠50只，6～8周齡，體質(zhì)量（200±20）g，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)2001000000198。飼養(yǎng)于室溫20～25 ℃、濕度45%～55%的清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，喂標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水。

1.4 試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco），四季青胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司），胰蛋白酶（Gibco），噻唑藍(lán)（Sigma），二甲基亞砜（DMSO，Sigma)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Roche），擴(kuò)增試劑盒（韓國(guó)BIONEER），RIPA裂解液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司），化學(xué)發(fā)光液（美國(guó)Thermo），一抗、二抗（艾菲生物技術(shù)有限公司）。

1.5 儀器

流式細(xì)胞儀（美國(guó)COULTER，EPICS XL），細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海力申科學(xué)儀器有限公司，HF212），倒置顯微鏡（日本OLYMPUS，CKX41+DP21），連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)BIO-RAD），電泳槽、轉(zhuǎn)印槽及配套電源（美國(guó)BIO-RAD），CFX96型PCR儀、凝膠成像儀（美國(guó)BIO-RAD）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 中藥湯劑制備

采用傳統(tǒng)水煎方法。將稱(chēng)好的藥材混合，先用10倍量水冷浸1 h，加熱，待煮沸后，再持續(xù)煎煮40 min，濾出煎液，剩余藥渣中再加6倍量水，至沸后繼續(xù)煎煮30 min，濾出煎液，2次煎液合并，70 ℃水浴濃縮至含原藥材5.7 g/mL水提液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 藥物血清制備

將50只SPF級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為參芪抑瘤方組和空白組。給藥組按3 mL/200 g予5.7 g原藥材/mL湯劑灌胃（用藥量為人等效劑量5倍），空白組予等量飲用水灌胃，每日2次，連續(xù)7 d，于末次給藥1 h后，股動(dòng)脈采血，4 ℃、3000 r/min離心10 min，將所采2組血清分別混合，-80 ℃冷藏備用，臨用前56 ℃、30 min滅活。

2.3 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)

復(fù)蘇MGC-803胃癌細(xì)胞株，用含10%小牛血清DMEM培養(yǎng)液接種于無(wú)菌培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中單層貼壁培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底后，棄去培養(yǎng)液，0.25%胰蛋白酶消化，吹打成細(xì)胞懸液后接種傳代。

2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞抑制率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制備成密度為5×104/mL細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，使每孔加入的細(xì)胞懸液為100 μL，待細(xì)胞貼壁后，設(shè)對(duì)照組、空白血清組和參芪抑瘤方藥物血清低、中、高劑量組（藥物血清低、中、高劑量組），每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組予常規(guī)培養(yǎng)液；空白血清組和藥物血清低、中、高劑量組予常規(guī)培養(yǎng)液的同時(shí)，每孔分別加非藥物大鼠血清20、10、6、0 μL和藥物大鼠血清0、6、10、20 μL，使各孔終體積為200 μL，各組所加大鼠血清占總培養(yǎng)液體積的10%。分別取經(jīng)血清干預(yù)24、48、72 h的96孔培養(yǎng)板，每孔加5 g/L MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)基，每孔加DMSO 150 μL，搖床震蕩10 min，于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定吸光度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率（%）＝（對(duì)照孔OD值－給藥孔OD值）÷對(duì)照孔OD值×100%。

2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板中，增殖為80%時(shí)，按“2.4”項(xiàng)分組，加入不同濃度的藥物血清處理24 h，檢測(cè)前用胰酶消化，1500 r/min離心5 min，吸棄上清液，PBS洗2次，70%乙醇固定，4 ℃過(guò)夜。用PBS配制成單細(xì)胞懸液，50 μg/mL碘化丙啶染色液室溫染色30 min，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。

2.6 qRT-PCR檢測(cè)CDKN1B、CDKN1C基因表達(dá)

按Trizol法分別提取培養(yǎng)24 h后不同組別胃癌MGC-803細(xì)胞的總RNA，檢測(cè)純度后，用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按試劑盒說(shuō)明操作，-20 ℃保存?zhèn)溆?。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成，其序列見(jiàn)表1。按照熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明操作，擴(kuò)增反應(yīng)在CFX96 Real-Time熒光PCR儀上進(jìn)行。分析融解曲線，確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，以2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表1 PCR反應(yīng)基因序列

2.7 Western blot檢測(cè)p27、p57蛋白表達(dá)

低溫下分別提取培養(yǎng)24 h后不同組別胃癌MGC-803細(xì)胞的蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，并把各組蛋白濃度調(diào)整一致，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。每孔上樣10 μL，15%聚丙烯酰胺凝膠100 V恒壓電泳分離約2 h；經(jīng)200 mA、2 h轉(zhuǎn)至PVDF膜；含5%脫脂奶粉的封閉液封閉1.5 h后，分別加入一抗p27（1∶500）、p57（1∶500）抗體4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗2次，TBS洗1次×5 min；再用抗兔辣根過(guò)氧化物酶耦聯(lián)的二抗室溫孵育1 h，TBST洗2次，TBS洗1次×5 min；加ECL工作液，凝膠成像儀下曝光成像。運(yùn)用ImageJ2X專(zhuān)業(yè)圖像軟件分析目的蛋白條帶灰度值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 參芪抑瘤方藥物血清對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞增殖的影響

不同濃度參芪抑瘤方藥物血清對(duì)MGC-803細(xì)胞增殖有抑制作用，藥物血清組OD值明顯低于對(duì)照組。MGC-803細(xì)胞藥物血清干預(yù)24 h高、中、低劑量組細(xì)胞抑制率分別為31.43%、16.98%、5.84%，MGC-803細(xì)胞藥物血清干預(yù)48 h高、中、低劑量組抑制率分別為30.32%、22.67%、16.09%，MGC-803細(xì)胞藥物血清干預(yù)72 h高、中、低劑量組抑制率分別為41.06%、23.27%、17.63%（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組胃癌MGC-803細(xì)胞不同時(shí)點(diǎn)增殖水平比較（±s，OD值）

表2 各組胃癌MGC-803細(xì)胞不同時(shí)點(diǎn)增殖水平比較（±s，OD值）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 n 24 h 48 h 72 h對(duì)照組 6 1.05±0.03 1.26±0.02 0.91±0.04空白血清組 6 1.04±0.03 1.15±0.02 0.80±0.03藥物血清低劑量組 6 0.99±0.04*1.06±0.04*0.75±0.04**藥物血清中劑量組 6 0.87±0.04**0.97±0.05**0.70±0.02**藥物血清高劑量組 6 0.69±0.03**0.88±0.04**0.52±0.02**

4.2 參芪抑瘤方藥物血清對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞周期的影響

不同濃度藥物血清處理MGC-803細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組比較，低劑量組G0/G1期比例由41.8%上升至53.4%，S期比例由50.8%下降至33.2%；中劑量組G0/G1期比例由41.8%上升至59.2%，S期比例由50.8%下降到27.2%；高劑量組G0/G1期比例由41.8%上升至70.6%，S期比例由50.8%下降至15.3%。結(jié)果見(jiàn)表3、圖1。

表3 各組胃癌MGC-803細(xì)胞周期分布比較（%）

圖1 各組胃癌MGC-803細(xì)胞流式細(xì)胞圖

4.3 參芪抑瘤方藥物血清對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞CDKN1B、CDKN1C基因表達(dá)的影響

參芪抑瘤方藥物血清干預(yù)胃癌MGC-803細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組和空白血清組比較，藥物血清各劑量組抑癌基因CDKN1B、CDKN1C表達(dá)量明顯上調(diào)（P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表4。

4.4 參芪抑瘤方藥物血清對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞p27、p57蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，藥物血清各劑量組p27、p57蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表5、圖2。

表4 各組胃癌MGC-803細(xì)胞CDKN1B、CDKN1C mRNA表達(dá)比較（±s，2-ΔΔCt值）

表4 各組胃癌MGC-803細(xì)胞CDKN1B、CDKN1C mRNA表達(dá)比較（±s，2-ΔΔCt值）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白血清組比較，##P＜0.01

組別 n CDKN1B CDKN1C對(duì)照組 6 1.00±0.00 1.00±0.00空白血清組 6 1.27±0.19*1.44±0.22*藥物血清低劑量組 6 2.64±0.23**##2.57±0.29**##藥物血清中劑量組 6 4.27±0.34**##3.40±0.41**##藥物血清高劑量組 6 7.47±0.32**##9.67±0.20**##

表5 各組胃癌MGC-803細(xì)胞p27、p57蛋白表達(dá)比較（±s，平均灰度值）

表5 各組胃癌MGC-803細(xì)胞p27、p57蛋白表達(dá)比較（±s，平均灰度值）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01；與空白血清組比較，##P＜0.01

組別 n p27 p57對(duì)照組 3 0.641±0.001 0.329±0.110空白血清組 3 0.614±0.006**0.571±0.024**藥物血清低劑量組 3 0.782±0.002**##0.613±0.001**藥物血清中劑量組 3 1.049±0.002**##0.838±0.083**##藥物血清高劑量組 3 1.267±0.008**##1.183±0.117**##

圖2 各組p27、p57蛋白表達(dá)免疫印跡電泳圖

5 討論

參芪抑瘤方由苦參、黃芪、當(dāng)歸、貝母等組成，現(xiàn)代藥理研究表明，方中各味中藥有效成分對(duì)多種癌細(xì)胞均有明顯的抑制作用[4-6]。

CDKN1B即p27kip基因定位于染色體12p13上，外顯子和內(nèi)顯子各2個(gè)，屬cip/kip家族成員之一，是重要的細(xì)胞周期素依賴激酶抑制因子，通過(guò)與細(xì)胞周期蛋白結(jié)合，產(chǎn)生對(duì)大多數(shù)Cyclin-CDK復(fù)合物（包括Cyclin E2-CDK在內(nèi)）激酶活性的抑制作用，發(fā)揮負(fù)調(diào)控細(xì)胞周期的功能。而Cyclin E2很可能是細(xì)胞周期G1期的限速因子。p27kip既能抑制被激活Cyclin-CDK的活性，也可對(duì)CDK的激活過(guò)程進(jìn)行干預(yù)，最終使細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)變受到抑制。

CDKN1C即p57kip2基因定位于染色體11p15.5上，也是cip/kip家族成員之一，屬細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子。在它的C末端有一核定位信號(hào)，近氨基末端有一介導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的抑制的保守區(qū)。它可以抑制某些G1期和S期激酶復(fù)合物，如Cyclin E-CDK2、Cyclin A-CDK2及Cyclin D-CDK2等，阻滯細(xì)胞由G1期向S期的轉(zhuǎn)變，停滯細(xì)胞于G1期，近而發(fā)揮負(fù)調(diào)控細(xì)胞周期的作用。

現(xiàn)代研究表明，胃癌組織p27kip1和p57kip2的陽(yáng)性表達(dá)明顯低于正常胃組織，提示胃癌的發(fā)生可能與p27kip1和p57kip2蛋白的低表達(dá)或缺失有關(guān)[7-9]，其機(jī)理可能是胃癌組織p27kip蛋白表達(dá)降低，增加Cyclin-CDK2復(fù)合物的活性，加速細(xì)胞由G期向S期的過(guò)渡，促使細(xì)胞過(guò)度增殖而形成腫瘤；或是p57Kip2的缺乏導(dǎo)致Cyclin D/CDK6的聚集，Rb蛋白活性受到抑制，促使E2F因子的釋放，進(jìn)而激活相關(guān)應(yīng)答基因轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞開(kāi)始增殖，導(dǎo)致Cyclin E/CDK2激酶復(fù)合物的持續(xù)激活，加速細(xì)胞周期G1向S期的進(jìn)程，導(dǎo)致Cyclin A/CDK2激酶復(fù)合物的持續(xù)激活，升高Cyclin A的表達(dá)水平，進(jìn)而利于細(xì)胞更快地進(jìn)入S期。

本研究結(jié)果表明，參芪抑瘤方藥物血清可抑制胃癌MGC-803細(xì)胞的增殖，且對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞由G1期向S期的轉(zhuǎn)化有一定阻滯作用，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)CDKN1B和1C的表達(dá)，促使其與細(xì)胞周期蛋白結(jié)合，抑制Cyclin-CDK2等復(fù)合物的活性，發(fā)揮負(fù)調(diào)控細(xì)胞周期的功能。

[1] 石金鳳,李海龍,吳紅彥,等.當(dāng)歸貝母苦參丸含藥血清對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901和侵襲轉(zhuǎn)移能力和周期的影響[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2014,16(10)：30-33.

[2] 吳紅彥,榮倩倩,李海龍,等.當(dāng)歸貝母苦參丸含藥血清對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901抑制作用機(jī)制的研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2016,22(2)：137-141.

[3] 馬春林,吳紅彥,李海龍,等.參芪抑瘤方藥物血清對(duì)胃癌MKN-45細(xì)胞周期阻滯及抗侵襲轉(zhuǎn)移的影響[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志,2016,23(4)：64-66.

[4] 劉寶瑞,錢(qián)曉萍,孟憲志,等.阿魏酸鈉對(duì)人大腸癌Moser細(xì)胞和乳腺癌MCF7細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志,2002,22(特刊)：188-190.

[5] 吳素珍,李加林,陳水親,等.硫酸酯化當(dāng)歸多糖抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2012,23(2)：319-320．

[6] 張裴,顧政一,孫玉華,等.貝母素乙逆轉(zhuǎn)SGC-7901/VCR細(xì)胞株多藥耐藥的初步研究[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2012,35(4)：452-456.

[7] 劉娟妮,張中冕,陳琛.ERCC1、P27kip1、CyclinE在胃癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[J].腫瘤防治研究,2010,37(5)：540-543.

[8] 張也頻.Cip/Kip家族的獨(dú)特成員p57Kip2的研究進(jìn)展[J].中國(guó)腫瘤生物治療雜志,2011,18(15)：574-580.

[9] LI G, DOMENICO J, LUCAS J J, et al. Identification of multiple cell cycle regulatory functions of p57Kip2 in human T lymphocytes [J]. J Immunol,2004,173(4)：2383-2391.

Effects of Medicinal Serum of Shenqi Yiliu Formula on Proliferation of Gastric Cancer MGC-803 Cells

MA Chun-lin1, WU Hong-yan1,2,3, LI Hai-long1,2, CHEN Jie1, ZHANG Xuan1, LI Hong-liang1
(1. Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China; 2. State Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Excavation Innovation and Transformation of Gansu Province, Lanzhou 730000, China; 3. Laboratory for TCM New Products Development Engineering of Gansu Province, Lanzhou 730000, China)

ObjectiveTo investigate the inhibitory effects of medicinal serum of Shenqi Yiliu Formula on cell proliferation of gastric cancer MGC-803 cells; To discuss relevant mechanism.MethodsAfter treated with different concentrations of medicinal serum of Shenqi Yiliu Formula, gastric cancer MGC-803 cells were tested by the following methods: MTT was employed to test the proliferation of gastric cancer MGC-803 cells; Flow cytometry was used to detect cell cycle; qRT-PCR was used to detect the genetic expressions of CDKN1B and CDKN1C; Western blot was employed to test the protein expressions of p27 and p57.ResultsWhen 3%, 5% and 10% medicinal serum of Shenqi Yiliu Formula was treated to MGC-803 cells for 24 h, 48 h and 72 h, proliferation of cells decreased significantly (P＜0.01), with time- and dosage-dependent relationship. When 3%, 5% and 10% medicinal serum of Shenqi Yiliu Formula was treated to MGC-803 cells for 24 h, cells in G0/G1 increased, decreased in S. qRT-PCR results showed that compared with the blank control group and the negative control group, mRNA expressions of CDKN1B and CDKN1C of MGC-803 cells in medicinal serum all dose group increased significantly (P＜0.01). Western blot results showed that compared with the blank control group, protein expressions of p27 and p57 of MGC-803 cells in medicinal serum all dose group increased significantly (P＜0.01).ConclusionMedicinal serum of Shenqi Yiliu Formula can inhibit MGC-803 cells proliferation and the mechanism may be through adjusting CDKN1B, CDKN1C mRNA and proteins expression to intervene in the cell cycle.

Shenqi Yiliu Formula; medicinal serum; gastric cancer cell; cell proliferation; cell cycle

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.03.013

R285.5

A

1005-5304(2017)03-0053-04

2016-04-07）

（

2016-04-24；編輯：華強(qiáng)）

甘肅中醫(yī)藥大學(xué)研究生創(chuàng)新基金（2015CX11）；蘭州市人才創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)扶持項(xiàng)目（2015-RC-24）

吳紅彥，E-mail：wuhy@163.com