王玲，劉輝國

1.武漢大學(xué)醫(yī)院，湖北 武漢 430071；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院，湖北 武漢 430030

金雀異黃素對脂多糖誘導(dǎo)人肺泡上皮細(xì)胞A549炎癥及凋亡的影響

王玲1，劉輝國2

1.武漢大學(xué)醫(yī)院，湖北 武漢 430071；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院，湖北 武漢 430030

目的觀察金雀異黃素對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)人肺泡上皮細(xì)胞A549發(fā)生炎癥與凋亡的影響，探討其改善肺損傷的作用機(jī)制。方法CCK-8法檢測不同濃度金雀異黃素和/或LPS干預(yù)細(xì)胞12 h后的活力；RT-PCR檢測金雀異黃素對LPS誘導(dǎo)的炎性因子白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達(dá)；TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡；Western blot檢測信號通路的變化。結(jié)果金雀異黃素（1、5、10 μmol/L）對細(xì)胞活力無明顯影響，LPS（1 μg/mL）可顯著降低細(xì)胞活力，而金雀異黃素與LPS共同干預(yù)則細(xì)胞活力呈濃度依賴性升高；RT-PCR結(jié)果顯示，LPS可顯著提高炎性因子的基因表達(dá)，而金雀異黃素則可呈濃度依賴和時間依賴抑制其表達(dá)；TUNEL染色結(jié)果顯示，金雀異黃素（10 μmol/L）與LPS聯(lián)合干預(yù)12 h可顯著減少LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；Western blot結(jié)果顯示，金雀異黃素（10 μmol/L）與LPS（1 μg/mL）協(xié)同刺激A549細(xì)胞30 min可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的IκBα、p65信號通路的磷酸化水平。結(jié)論金雀異黃素可抑制LPS誘導(dǎo)的人肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生炎癥和凋亡，從而發(fā)揮保護(hù)作用。

金雀異黃素；急性肺損傷；A549細(xì)胞；炎癥；細(xì)胞凋亡

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）的死亡率較高，其主要特點(diǎn)為中性粒細(xì)胞的聚集、間質(zhì)水腫、肺泡上皮細(xì)胞完整性破壞及大量炎性因子的產(chǎn)生[1]。雖然近些年來對ALI的發(fā)病機(jī)制研究已經(jīng)有了長足進(jìn)步，但目前的治療并未降低ALI患者死亡率及增加幸存者生活質(zhì)量[2]。脂多糖（LPS）為革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的組成成分，可誘導(dǎo)炎性反應(yīng)繼而導(dǎo)致免疫功能障礙[3]。LPS氣管內(nèi)給藥可造成嚴(yán)重肺損傷模型，近年來已經(jīng)成為共識[4]。因此，我們采用LPS體外干預(yù)肺泡上皮細(xì)胞模擬肺損傷模型。核因子-κB（NF-κB）在調(diào)控炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]。多項(xiàng)研究表明，NF-κB信號通路在肺部損傷疾病中發(fā)揮重要調(diào)控作用，其誘導(dǎo)的細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）在ALI的發(fā)病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]。

金雀異黃素（genistein，GEN）是一種存在于豆科植物和齒狀植物中的天然異黃酮化合物，研究表明，其具有抗癌、抗炎、抗氧化等作用[7-8]，但其是否影響ALI中肺泡上皮細(xì)胞的炎性反應(yīng)尚未見報道。本實(shí)驗(yàn)觀察GEN對肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞在LPS誘導(dǎo)下發(fā)生上皮損傷的影響，探討其改善ALI的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物及制備

GEN，上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，貨號446-72-0，純度＞98%。取2.7 mgGEN溶于1 mL二甲基亞砜（DMSO）中配制實(shí)驗(yàn)所用的母液。

1.2 細(xì)胞

A549人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞株，中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，細(xì)胞培養(yǎng)和干預(yù)刺激均在獨(dú)立的細(xì)胞房中進(jìn)行，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長達(dá)次融合狀態(tài)時0.25%胰蛋白酶消化，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要接種于不同的培養(yǎng)皿中。分組誘導(dǎo)前以無血清培養(yǎng)基饑餓24 h，以減少血清對刺激因素的影響。

1.3 主要試劑與儀器

高糖DMEM basic（1×）培養(yǎng)基、新生小牛血清（New born serum，NBS）、胰酶，Gibco公司；CCK-8試劑盒，日本同仁化學(xué)研究所；LPS，Sigma公司；RT-PCR試劑盒，Roche公司；p-IκBα、p-p65、IκBα、p65、GAPDH（Rabbit IgG），Cell Signaling Technology公司。多功能微孔板檢測系統(tǒng)Synergy HT（美國BioTek公司），紫外分光光度計(jì)NANODROP 2000c（Thermo scientific），實(shí)時定量PCR儀Light Lycler 480（Roche公司），RT反轉(zhuǎn)錄儀Veriti 96 well Thermal Lycler（Applied Biosystems公司），倒置相差顯微鏡（日本OLYMPUS），恒溫培養(yǎng)箱（日本SANYO公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞處理和分組

待A549細(xì)胞貼壁生長密度達(dá)80%時，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗，加入饑餓液，置于溫箱8 h后置換為含有LPS（1 μg/mL）的饑餓液，重新置于溫箱中培養(yǎng)，收取蛋白質(zhì)和RNA樣本。實(shí)驗(yàn)分為對照組、LPS組、LPS＋GEN 1 μmol/L組、LPS＋GEN 5 μmol/L組、LPS＋GEN 10 μmol/L組和GEN 10 μmol/L組。

2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞活力

細(xì)胞被接種至96孔板，每孔100 μL，密度大約為2×105個/mL，置于溫箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，將培養(yǎng)基更換為無血清的培養(yǎng)基饑餓24 h，采用不同處理因素干預(yù)72 h后，將96孔板中培養(yǎng)基換為含10 μL CCK-8的無血清培養(yǎng)基100 μL，溫箱中孵育2～2.5 h后于酶標(biāo)儀波長450 nm處進(jìn)行測定。

2.3 Western blot檢測信號通路磷酸化水平

冰上裂解細(xì)胞10 min，置于1.5 mL離心管中，超聲裂解儀5 kHz裂解10～15 s，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，上清液移至離心管中，BCA定量檢測蛋白濃度并將蛋白濃度調(diào)整一致后置于煮沸儀上將其變性。每組樣本混勻后取10 μL行10%SDS-PAGE凝膠電泳，檢測內(nèi)參指標(biāo)GAPDH，根據(jù)各樣本的光密度值調(diào)整上樣劑量，使其與GAPDH的光密度值保持一致，后每組以校正后的上樣劑量進(jìn)行凝膠電泳，將蛋白以100 V、90 min移至PVDF膜上，用一抗封閉液封閉12 h，一抗包括p-IκBα、p-p65、IκBα、p65，再用TBST洗3次，將其放入對應(yīng)的加有二抗的稀釋液中避光孵育1 h，二抗為Alexa Fluor?488 goat anti-Rabbit IgG，再用TBST洗3次，放入熒光檢測儀中，檢測目的條帶，應(yīng)用Odyssey圖像分析軟件檢測各組蛋白的光密度值，作為蛋白表達(dá)水平。

2.4 RT-PCR檢測炎性因子基因表達(dá)

細(xì)胞以不同因素處理后，棄去培養(yǎng)基，以Trizol法提取細(xì)胞總RNA，采用紫外分光光度法測定其含量與純度。根據(jù)樣本所測濃度，取適當(dāng)劑量，將各樣本濃度調(diào)整一致后反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以GAPDH為內(nèi)參照，采用20 μL體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94 ℃、2 min，1個循環(huán)，94 ℃、40 s，25～35個循環(huán)，50～65 ℃、40 s，72 ℃、1 min，72 ℃、5 min，1個循環(huán)。引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

2.5 TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡

將細(xì)胞接種至爬片上，調(diào)整密度為1×105個/mL，饑餓18 h，加入不同干預(yù)因素處理細(xì)胞12 h，PBS洗3次，1%多聚甲醛固定10 min，再用乙醇/乙酸2∶1混合液-20 ℃固定5 min，PBS清洗3 min。加入平衡液室溫孵育10 s后滴加TdT酶工作液，37 ℃孵育1 h。加入工作液，振蕩15 s后孵育10 min，PBS洗3次，吸干液體，滴加Anti-Digoxigenin Fluorescein工作液，避光孵育30 min，PBS再洗3次，DAPI封片，鏡下觀察拍照。正常細(xì)胞核被染為藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核被染為綠色，每組隨機(jī)選擇8個視野，計(jì)算細(xì)胞凋亡率（凋亡細(xì)胞數(shù)÷細(xì)胞總數(shù)×100%），取其平均值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 金雀異黃素對A549細(xì)胞活力的影響

與對照組比較，GEN（1、5、10 μmol/L）單獨(dú)干預(yù)A549細(xì)胞對其活力無影響；GEN（1、5、10 μmol/L）與LPS同時干預(yù)A549細(xì)胞則細(xì)胞活力明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果見表2。

表2 各組A549細(xì)胞GEN和/或LPS不同濃度干預(yù)細(xì)胞活力比較（s）

表2 各組A549細(xì)胞GEN和/或LPS不同濃度干預(yù)細(xì)胞活力比較（s）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 n 0 μmol/L 1 μmol/L 5 μmol/L10 μmol/L GEN組 5 1.0±0.1 1.0±0.1 1.0±0.11.0±0.1 LPS＋GEN組 5 0.7±0.1 0.8±0.1*0.8±0.1*0.9±0.1**對照組 5 1.0±0.1 1.0±0.1 1.0±0.11.0±0.1

4.2 金雀異黃素對脂多糖誘導(dǎo)A549細(xì)胞炎性因子的影響

與對照組比較，LPS（1 μg/mL）處理12 h后A549細(xì)胞炎性因子IL-1β、IL-6及TNF-α基因表達(dá)顯著增加（P＜0.01）；GEN（1、5、10 μmol/L）與LPS同時干預(yù)炎性因子基因表達(dá)較LPS組顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），且呈濃度依賴性；GEN（10 μmol/L）單獨(dú)干預(yù)A549細(xì)胞則對炎性因子的基因表達(dá)無影響。結(jié)果見表3。

表3 各組A549細(xì)胞炎性因子基因表達(dá)比較（±s）

表3 各組A549細(xì)胞炎性因子基因表達(dá)比較（±s）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與LPS組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 n劑量/（μmol/L）IL-1β IL-6 TNF-α對照組 9 1.0±0.1 1.0±0.11.0±0.1 LPS組 9 15.2±2.6**11.3±1.5**9.5±1.0**LPS＋GEN組 9 1 12.5±2.4#8.6±1.1##7.8±1.1#LPS＋GEN組 9 5 8.3±1.6##6.8±0.9##4.6±0.6##LPS＋GEN組 9 10 4.3±0.9##3.5±0.1##2.5±0.4##GEN組 9 10 1.1±0.1 1.0±0.90.9±0.1

與對照組比較，LPS干預(yù)3、6、12 h后A549細(xì)胞炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α基因表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；GEN（10 μmol/L）與LPS同時干預(yù)炎性因子mRNA表達(dá)較LPS組顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果見表4。

表4 各組A549細(xì)胞不同時點(diǎn)炎性因子基因表達(dá)比較（±s，n＝9）

表4 各組A549細(xì)胞不同時點(diǎn)炎性因子基因表達(dá)比較（±s，n＝9）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與LPS組比較，##P＜0.01

指標(biāo)0 h 3 h 6 h 12 h對照組 LPS組 LPS＋GEN組 對照組 LPS組LPS＋GEN組 對照組LPS組 LPS＋GEN組 對照組 LPS組 LPS＋GEN組IL-1β 1.0±0.1 1.0±0.1 1.0±0.1 1.0±0.1 4.8±0.7**3.2±0.4##1.0±0.110.6±1.8**6.3±0.9##1.0±0.1 15.0±2.6**4.3±0.9##IL-6 1.0±0.1 1.0±0.8 1.0±0.8 1.0±0.1 3.4±0.7**2.5±0.6##1.0±0.1 7.9±1.1**3.6±0.7##1.0±0.1 11.3±1.5**3.5±0.6##TNF-α 1.0±0.1 1.0±0.1 1.0±0.1 1.0±0.1 4.2±0.7**2.5±0.4##1.0±0.1 8.3±1.6**3.6±0.2##1.0±0.1 11.2±1.9**3.0±0.6##

4.3 金雀異黃素對脂多糖誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的影響

與對照組比較，LPS（1 μg/mL）干預(yù)細(xì)胞12 h后凋亡率為42.3%，GEN（10 μmol/L）與LPS同時干預(yù)A549細(xì)胞后凋亡率降為13.6%，GEN（10 μmol/L）單獨(dú)干預(yù)A549細(xì)胞對細(xì)胞凋亡無影響。結(jié)果見圖1。

圖1 各組A549細(xì)胞凋亡形態(tài)

4.4 金雀異黃素對脂多糖誘導(dǎo)A549細(xì)胞IκBα、p65信號通路磷酸化水平的影響

GEN（10 μmol/L）與LPS（1 μg/mL）協(xié)同刺激A549細(xì)胞30 min可顯著抑制LPS誘導(dǎo)IκBα、p65信號通路的磷酸化水平（P＜0.01），GEN（10 μmol/L）單獨(dú)干預(yù)A549細(xì)胞對以上信號通路則無影響。結(jié)果見圖2、表5。

圖2 各組A549細(xì)胞信號通路蛋白表達(dá)免疫印跡圖

表5 各組A549細(xì)胞IκBα、p65信號通路磷酸化水平比較（±s，OD值）

表5 各組A549細(xì)胞IκBα、p65信號通路磷酸化水平比較（±s，OD值）

注：與LPS組比較，##P＜0.01

組別 n 劑量/（μmol/L） p-IκBα p-p65對照組 3 1.0±0.1 1.0±0.1 LPS組 3 2.1±0.2 2.3±0.2 LPS＋GEN組 3 10 1.2±0.1##1.2±0.1##GEN組 3 10 1.0±0.1 1.0±0.1

5 討論

本研究結(jié)果顯示：LPS連續(xù)刺激A549細(xì)胞12 h可誘導(dǎo)其產(chǎn)生大量炎性因子且細(xì)胞凋亡率上升；RT-PCR結(jié)果提示，GEN可呈濃度依賴性及時間依賴性逆轉(zhuǎn)炎性因子的上調(diào)；TUNEL染色結(jié)果提示，其亦可降低細(xì)胞凋亡率。Western blot檢測結(jié)果顯示，GEN可能是通過抑制NF-κB信號通路中的IκBα及p65的磷酸化而發(fā)揮保護(hù)作用。

有研究顯示，GEN在急性和慢性炎癥中均可發(fā)揮顯著調(diào)控作用，作用靶點(diǎn)是通過抑制NF-κB及STAT信號通路的活化[9]。馮贊杰等[10]研究顯示，GEN可抑制人血管平滑肌細(xì)胞中NF-κB的激活從而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用，其亦可抑制大鼠關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞中IL-1β、TNF-α等炎癥因子的產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)選擇GEN對ALI的體外細(xì)胞模型進(jìn)行干預(yù)，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇了3個藥物濃度（1、5、10 μmol/L）來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

天然免疫在機(jī)體預(yù)防病原體侵襲發(fā)揮首當(dāng)其沖的作用，LPS與之細(xì)胞膜上對應(yīng)的Toll樣受體相結(jié)合后可觸發(fā)天然免疫反應(yīng)，NF-κB信號通路的活化需要κB（IκBα和IκBβ）的磷酸化與降解。NF-κB主要由2個亞基（p65和p50）組成。IκBα與p65在細(xì)胞質(zhì)中相結(jié)合，抑制NF-κB的細(xì)胞核轉(zhuǎn)位，一旦NF-κB入核，其可調(diào)控細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄細(xì)胞因子如IL-1β、IL-6、TNF-α及COX-2等。此外，LPS可增加細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，增加線粒體膜電位的通透性，繼而誘發(fā)內(nèi)源性凋亡通路Caspase9的激活，細(xì)胞本身產(chǎn)生的TNF-α亦可作用于細(xì)胞膜，誘導(dǎo)外源性凋亡通路Caspase8的活化，2組凋亡通路均可通過Caspase3的活化而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GEN可顯著抑制IκBα及p65的磷酸化水平，抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位，其下游的炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA水平均被GEN所抑制，TUNEL染色提示LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡也明顯減少。因此，我們認(rèn)為GEN可能通過抑制IκBα及p65的磷酸化從而發(fā)揮抗細(xì)胞炎癥及凋亡的作用。

綜上，GEN可抑制LPS誘導(dǎo)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞發(fā)生炎癥與凋亡，為下一步動物在體研究提供了一定基礎(chǔ)，但本研究對信號通路的具體機(jī)制闡述尚不明確，對線粒體膜電位及活性氧的產(chǎn)生亦未能明確，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，以明確GEN的具體作用機(jī)制。

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（修回日期：2016-05-18；編輯：華強(qiáng)）

Effects of Genistein on Inflammation and Apoptosis of Human Alveolar Epithelial Cell A549 Induced by Lipopolysaccharide

WANG Ling1, LIU Hui-guo2
(1. The Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, China; 2. Tongji Hospital Affiliated to Tongji Medical College of HUST, Wuhan 430030, China)

ObjectiveTo investigate the effects of Genistein (GEN) acting on human lung adenocarcinoma A549 cells induced by LPS; To discuss its action of mechanism for improving injuries of lung.MethodsThe activity of cell treated with different concentrations of Genistein was detected by CCK-8 method and / or LPS intervention for 12 h. The expressions of inflammatory cytokines IL-1β, IL-6, and TNF-α induced by LPS were detected by RT-PCR. TUNEL was used to detect apoptosis, and Western blot was used to detect the changes of signal pathway.ResultsGEN (1, 5, 10 μmol/L) alone had no effects on cell activity; LPS (1 μg/mL) reduced cell viability significantly, while co-treated the A549 cells with GEN and LPS could reverse this condition in a concentration-dependent manner; RT-PCR results showed that LPS could significantly increase the level of gene expression of inflammatory factors, while GEN could inhibited this phenomenon in both concentration-and time-dependent manner; the results of TUNEL staining showed that GEN (10 μmol/L) combined with LPS for 12 h could significantly decrease the apoptosis rate; the results of Western blot showed that GEN possibly inhibited the inflammation and apoptosis through inhibiting the phosphorylation of IκBα, p65 signaling pathways.ConclusionGEN has anti-inflammation and anti-apoptosis effects on A549 cells induced by LPS, so as to play a protective rate.

Genistein; acute lung injury; A549; inflammation; apoptosis

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.03.014

R285.5

A

1005-5304(2017)03-0057-04

2016-04-21）