靳正忠,王寧,包慧芳*,侯敏,陳福雙

（1.中國(guó)科學(xué)院新疆生態(tài)地理研究所,新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所 新疆 烏魯木齊 830091；3.福雙果業(yè)有限責(zé)任公司，新疆 伽師 844300)

高產(chǎn)乙醇的釀酒酵母的篩選及性能檢測(cè)

靳正忠1,王寧2,包慧芳2*,侯敏2,陳福雙3

（1.中國(guó)科學(xué)院新疆生態(tài)地理研究所,新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所 新疆 烏魯木齊 830091；3.福雙果業(yè)有限責(zé)任公司，新疆 伽師 844300)

目的是從新疆葡萄酒產(chǎn)地篩選適合當(dāng)?shù)厣车囊吧湍妇N資源。采用可培養(yǎng)方法，分離符合條件的酵母菌株，對(duì)其生理生化、分子生物學(xué)及生長(zhǎng)耐受性等各方面進(jìn)行更細(xì)致研究。從釀酒葡萄鮮果、種植土壤及白蘭地發(fā)酵基質(zhì)中篩選到酵母菌36株，隨后通過(guò)WL瓊脂培養(yǎng)基初篩，獲得符合產(chǎn)酒精特征的菌株10株。對(duì)這10株酵母菌進(jìn)行生長(zhǎng)發(fā)酵能力的復(fù)篩檢測(cè)，編號(hào)為B5、B6、B9的三株菌經(jīng)過(guò)48h的發(fā)酵，酒精發(fā)酵能力較好。進(jìn)而結(jié)合生理生化及分子測(cè)序鑒定，分離的三株菌均屬于釀酒酵母。在對(duì)供試菌株進(jìn)行耐受性檢測(cè)中，B5的酒精耐受性最高可達(dá)16%、B6、B9為14%；B5、B9最高可耐受2.0 mol/L KCl，B6最高可耐受2.25 mol/LKCl，同時(shí)，三株菌均能耐受50%的葡萄糖濃度，具有較廣泛的酸堿適應(yīng)性，熱致死溫度都為61℃～64℃之間，耐受10d饑餓后，仍能良好生長(zhǎng)。獲得3株有良好應(yīng)用潛能的野生釀酒酵母菌株，為保護(hù)該區(qū)微生物資源及開(kāi)發(fā)工業(yè)菌株具有重要意義。

釀酒酵母；乙醇；耐受性

一、引言

新疆天山北麓擁有得天獨(dú)厚的釀酒葡萄種植基地，與同處北緯44°的美國(guó)加州和法國(guó)波爾多并稱(chēng)為“世界三大天堂級(jí)葡萄產(chǎn)區(qū)”，原生態(tài)、零污染的自然條件為釀酒酵母提供了優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)環(huán)境[1]。生產(chǎn)實(shí)踐中對(duì)酵母菌株的生理特性有一定的要求，工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)要求發(fā)酵菌株不僅要具有良好發(fā)酵性能,同時(shí)要能耐受高溫、高糖、高滲透壓,才能夠節(jié)約冷卻用水、降低能耗、縮短發(fā)酵時(shí)間,提高乙醇的生產(chǎn)效率和設(shè)備的利用率。選育適合新疆葡萄酒生產(chǎn)工藝的菌種對(duì)本地酒業(yè)的持續(xù)發(fā)展具有重要意義。人們利用純培養(yǎng)的酵母菌生產(chǎn)葡萄酒已經(jīng)有一個(gè)世紀(jì)的歷史，葡萄酒生產(chǎn)中使用的酵母多種多樣，各具特色。突變、雜交和DNA重組在釀酒酵母育種工作中也取得了廣泛的應(yīng)用[2,3]?，F(xiàn)代葡萄酒的生產(chǎn)和消費(fèi)不僅需要高效率地將葡萄汁中的糖轉(zhuǎn)化為酒精，更希望得到風(fēng)格各異的商品化產(chǎn)品。此目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)不僅依靠工藝的改進(jìn)，具有優(yōu)良特性發(fā)酵菌種的獲得也是生產(chǎn)中極為關(guān)鍵的技術(shù)資源。本研究從新疆葡萄酒產(chǎn)地篩選適合當(dāng)?shù)厣车囊吧湍?，并?duì)其生理生化、分子生物學(xué)及生產(chǎn)應(yīng)用等各方面進(jìn)行更細(xì)致全面的研究，以期獲得改善本地葡萄酒釀造品質(zhì)的菌種資源。

二、材料與方法

（一）材料

1.樣品來(lái)源。2014年10月，從昌吉葡萄種植園采集釀酒葡萄鮮果及土壤，并從伽師縣福雙果業(yè)有限責(zé)任公司采集自然發(fā)酵白蘭地基質(zhì)用于分離酵母菌株。

2.主要試劑及來(lái)源。葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨、瓊脂、蔗糖等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?、dNTPs、Taq酶等試劑均購(gòu)自上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司。

3.培養(yǎng)基。分離培養(yǎng)基:馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA),YPD培養(yǎng)基[3]。

初篩培養(yǎng)基:WL瓊脂培養(yǎng)基。

復(fù)篩發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖30%,酵母膏0.5%,蛋白胨0.5%,氯化銨0.15%,磷酸氫二鉀0.15%,硫酸鎂0.1%,氯化鈣0.28%, 0.06MPa滅菌15 min。

（二）方法

1.產(chǎn)酒精酵母菌株的篩選。酵母菌的分離:將采集到的新鮮樣品適當(dāng)稀釋后涂布于酵母菌分離培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng)2～3d,挑取具有典型酵母菌菌落特征的單菌落,在PDA固體平板上經(jīng)劃線分離純化后鏡檢,初步去重復(fù)，保存?zhèn)溆谩?/p>

產(chǎn)酒精酵母菌株的初篩:將分離獲得的酵母菌接種于YPD液體培養(yǎng)基活化24 h后接種至WL瓊脂培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)5 d后觀察，篩選出菌落顏色為奶油色（淺黃色）至綠色，表面為球形突起，光滑，不透明，奶油狀的菌株。

產(chǎn)酒精酵母菌株的復(fù)篩：將初篩獲得的酵母菌按相同的接種量分別接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn),30℃培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后通過(guò)測(cè)定其總失重、酒精度和殘還原糖,復(fù)篩出性狀良好的酵母菌株。

酒精度的測(cè)定:取100 mL成熟發(fā)酵液到蒸餾瓶中,加入100 mL水,混勻后蒸餾,準(zhǔn)確取餾出液100 mL,用酒精計(jì)(標(biāo)溫20℃)測(cè)酒精度(下緣為準(zhǔn)),同時(shí)測(cè)定溫度,然后換算成20℃時(shí)的酒精度[4]。

CO2失重量的測(cè)定：將活化后的菌液轉(zhuǎn)接到100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng),以空白的發(fā)酵液作對(duì)照。每隔12 h稱(chēng)重一次,以相鄰2次的質(zhì)量差值作為CO2失重量。當(dāng)CO2失重量小于0.1g時(shí)發(fā)酵結(jié)束。

殘還原糖測(cè)定:菲林試劑直接滴定法[4]。

2.酵母菌的分類(lèi)鑒定。生理生化鑒定：糖發(fā)酵、碳源同化、氮源同化試驗(yàn)，具體參見(jiàn)文獻(xiàn)[5]。

分子生物學(xué)鑒定：挑取新鮮單菌落置于30μl 0.2%SDS中；漩渦混勻器上混勻15秒；90℃熱激4min；4℃13000rpm×1min，離心，取上清液20μl至新的無(wú)菌離心管中，-20℃保藏。利用通用引物（ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3′ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：10×ExTaq Buffer 5μl，dNTPs 4μl，ExTaq酶0.5μl，模板DNA1μl，引物各2μl，加超純水至50μl。反應(yīng)程序?yàn)?5℃5min；94℃1min；52℃1min；72℃1min20s，循環(huán)36次；72℃延伸8min。

3.供試酵母菌耐性實(shí)驗(yàn)[6,7]。酒精耐受性測(cè)定：將滅菌后的YPD瓊脂培養(yǎng)基降溫至40℃左右，按10%、12%、14%、16%、18%(v/v)的濃度加入乙醇，接種新鮮單菌落在YPD固體平板進(jìn)行生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，一周后以生長(zhǎng)狀況表征其酒精耐受性。

滲透脅迫耐受性測(cè)定:配制終濃度為1.0mol/L、1.5 mol/L、1.75 mol/L、2.0 mol/L、2.25 mol/L、2.5 mol/LKCl到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，接種新鮮單菌落培養(yǎng)2d，以生長(zhǎng)狀況表征其滲透脅迫耐受性。

高糖耐受性測(cè)試：在含有10%、20%、30%、40%、50%的葡萄糖的YPD斜面培養(yǎng)基進(jìn)行生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，以生長(zhǎng)狀況表征其對(duì)不同濃度糖的耐受性。培養(yǎng)兩周后觀察生長(zhǎng)差異。

熱致死溫度測(cè)定：將接種后的YPD液試管浸入水浴鍋中,以不接種的空白試管作為對(duì)照,其中插入溫度計(jì),當(dāng)空白管的溫度達(dá)到40℃時(shí),開(kāi)始記錄時(shí)間,并保持10 min,然后立即拿出,在冷水中冷卻至室溫,最后將試管置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。同法測(cè)定45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃下的活菌數(shù)。

營(yíng)養(yǎng)饑餓耐受性測(cè)定：將各菌株在無(wú)菌水中30℃分別靜置饑餓5d、6d、7d、8d、9d、10d，在YPD液體培養(yǎng)基進(jìn)行生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)2d后以活菌數(shù)表征其營(yíng)養(yǎng)饑餓耐受性。

酸堿耐受性測(cè)試：配制不同pH值(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)的發(fā)酵培養(yǎng)基,接種后于30℃培養(yǎng)48h,測(cè)定不同pH值條件下酵母菌的OD600值及發(fā)酵力。

三、結(jié)果與分析

（一）釀酒酵母的初篩及復(fù)篩結(jié)果

利用PDA培養(yǎng)基對(duì)10份樣品（5份鮮果、3份土壤、2份發(fā)酵基質(zhì)）進(jìn)行酵母菌的篩選，通過(guò)形態(tài)觀察及鏡檢結(jié)果，初步去重，共篩選酵母菌36株，多數(shù)為多端出芽的橢球型菌株。隨后將分離的所有酵母菌株經(jīng)YPD固體培養(yǎng)基活化，24h后接種到WL瓊脂培養(yǎng)基上，各菌株分別作三個(gè)重復(fù)，獲得符合產(chǎn)酒精特征的菌株10株，即菌落顏色為奶油色（淺黃色）至綠色，球形突起，光滑，不透明，編號(hào)為B1-B10。對(duì)這10株酵母菌進(jìn)行生長(zhǎng)發(fā)酵能力的復(fù)篩檢測(cè)，編號(hào)為B5、B6、B9的三株菌經(jīng)過(guò)48h的發(fā)酵，酒精發(fā)酵能力較好，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 復(fù)篩發(fā)酵結(jié)果比較

（二）釀酒酵母菌的分類(lèi)鑒定

對(duì)復(fù)篩獲得的3株酵母菌進(jìn)行生理生化檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2。在氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別加入葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖，檢測(cè)菌株的糖發(fā)酵能力，結(jié)果顯示所有菌均能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖，不能發(fā)酵乳糖；在對(duì)碳源同化的檢測(cè)中，均能同化半乳糖、棉籽糖，不能同化鼠李糖、纖維二糖、菊糖、肌醇、L-阿拉伯糖、D-木糖、可溶性淀粉和山梨糖。在碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別加入硫酸銨、天門(mén)冬素、硝酸鉀和亞硝酸鈉，檢測(cè)三株菌的氮源同化能力，結(jié)果表明所有菌均能發(fā)酵硫酸銨、天門(mén)冬素，不能同化硝酸鉀和亞硝酸鈉。對(duì)糖發(fā)酵、碳源同化、氮源同化的結(jié)果與菌種鑒定手冊(cè)中釀酒酵母鑒定結(jié)果一致。

表2 三株酵母菌的生理生化特性比較

進(jìn)一步對(duì)酵母菌進(jìn)行ITS區(qū)分子鑒定，將所測(cè)結(jié)果提交至Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性比較，與這3株菌相似性最高的菌株均屬于Saccharomyces cerevisiae，相似性為99%～100%，因此，將分離的菌株鑒定為Saccharomyces cerevisiae，Genebank注冊(cè)號(hào)為：KR063021-KR063023。圖1為與選定的同源性較高的相關(guān)菌株26Sr RNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。生理生化檢測(cè)及分子鑒定結(jié)果均證明分離的菌株應(yīng)屬于釀酒酵母。

圖1 各菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)狀關(guān)系

（三）釀酒酵母耐受性實(shí)驗(yàn)

酵母菌在發(fā)酵液中發(fā)酵,到某一時(shí)刻即停止,其最大原因是由于乙醇濃度增大所致,高乙醇濃度對(duì)酵母的生長(zhǎng)繁殖有延滯作用,會(huì)抑制其發(fā)酵活性。因此,酵母的發(fā)酵能力在很大程度上取決于它們自身對(duì)乙醇耐受力的大小。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到B5的酒精耐受性最高可達(dá)16%、B6、B9為14%，高于此濃度均不能生長(zhǎng)。

在自然繁殖或工業(yè)培養(yǎng)過(guò)程中，酵母常常會(huì)受到高鹽、高糖等條件的影響，所以細(xì)胞自身的滲透調(diào)節(jié)是其非常重要的生物學(xué)反應(yīng)。發(fā)酵醪的滲透壓高可引起細(xì)胞內(nèi)水分活度、細(xì)胞質(zhì)組成發(fā)生顯著變化，從而抑制酵母的生長(zhǎng)和發(fā)酵。因此，酵母具有耐高滲和耐高糖性能就可以很好地為生產(chǎn)服務(wù)。經(jīng)檢測(cè)，B5、B9最高可耐受2.0 mol/LKCl，B6最高可耐受2.25 mol/LKCl，三株菌均能耐受50%的葡萄糖濃度。

液態(tài)培養(yǎng)的微生物,在某溫度下10 min即被殺死,此溫度稱(chēng)為微生物的熱致死溫度。通常情況下以測(cè)得的能發(fā)酵的最高溫度加1～2℃為該菌的熱致死溫度。通過(guò)活菌計(jì)數(shù)，三株菌均能在60℃生長(zhǎng)，不能在65℃以上的溫度生長(zhǎng)。因此，B5、B6、B9的熱致死溫度為61～64℃之間。

隨著發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗會(huì)影響微生物發(fā)酵能力，釀酒酵母對(duì)營(yíng)養(yǎng)饑餓耐受性好是發(fā)酵工藝特別是連續(xù)發(fā)酵工藝所要求的良好性質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)中，各菌株在25℃溫箱分別靜置饑餓培養(yǎng)10d后，均能良好生長(zhǎng)。

酵母菌進(jìn)行繁殖的適宜環(huán)境根據(jù)不同的菌株而有所區(qū)別，通過(guò)測(cè)定不同pH值條件下菌株的生物量及發(fā)酵力,以確定其耐酸堿性。結(jié)果表明，B5在pH值1.0～9.0范圍內(nèi)生長(zhǎng)良好,B6的pH耐受范圍為2.0～8.0，B9為2.0～9.0。相比之下，B5具有更廣泛的酸堿適應(yīng)性，尤其pH4.0時(shí)發(fā)酵力最強(qiáng)。

四、討論

在葡萄汁和葡萄酒中存在著很多不同的酵母種類(lèi)，其分類(lèi)地位、形態(tài)特征和生物、化學(xué)特征各有不同，其中有的有利于葡萄酒釀造，有的則不利于葡萄酒釀造[8]。與葡萄酒釀造相關(guān)的酵母中以酵母屬最為重要，通常使用該屬的酵母有釀酒酵母和貝酵母等種的菌株。從自然生境中篩選對(duì)釀造有利的菌株必須先對(duì)篩選到的菌株進(jìn)行分類(lèi)地位的確定。傳統(tǒng)的鑒定方法是通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化性狀等對(duì)釀酒酵母進(jìn)行鑒定，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)進(jìn)行對(duì)比得出鑒定結(jié)論，但存在繁瑣耗時(shí)費(fèi)力，操作不方便，因?qū)嶒?yàn)條件不同，重現(xiàn)性不好的缺陷。分子生物學(xué)方法因可快速鑒定，目前得到廣泛使用，兩種鑒定方法結(jié)合可使結(jié)果更加準(zhǔn)確。

在酵母酒精發(fā)酵過(guò)程中，由于發(fā)酵作用和其他代謝活動(dòng)同時(shí)存在，酵母除了將葡萄汁92%～95%的糖發(fā)酵生成酒精、CO2和熱量外，還能夠利用剩余的糖產(chǎn)生一系列的其他化合物，稱(chēng)為酒精發(fā)酵副產(chǎn)物[9]。酵母菌的代謝副產(chǎn)物不僅影響著葡萄酒的風(fēng)味和口感，而且有些副產(chǎn)物如辛酸還會(huì)對(duì)酵母的生長(zhǎng)具有抑制作用。本研究中篩選獲得的菌株發(fā)酵后期均顯示符合發(fā)酵成熟曲指標(biāo)且有較好的生長(zhǎng)耐受性，但是否能改善葡萄酒的特色和風(fēng)味尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

五、結(jié)論

從釀酒葡萄鮮果、種植土壤及白蘭地發(fā)酵基質(zhì)中篩選到酵母菌36株，隨后通過(guò)WL瓊脂培養(yǎng)基初篩，獲得符合產(chǎn)酒精特征的菌株10株。對(duì)這10株酵母菌進(jìn)行生長(zhǎng)發(fā)酵能力的復(fù)篩檢測(cè)，編號(hào)為B5、B6、B9的三株菌經(jīng)過(guò)48h的發(fā)酵，酒精發(fā)酵能力較好。進(jìn)而與菌種鑒定手冊(cè)比較糖發(fā)酵、碳源同化、氮源同化試驗(yàn)結(jié)果，確認(rèn)篩選的3株菌為釀酒酵母，通過(guò)26Sr RNA基因序列測(cè)序分析，使用Blast在線軟件進(jìn)行相似性分析,測(cè)序結(jié)果查詢(xún)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，得到結(jié)果證實(shí)篩選出的酵母的確是釀酒酵母。

對(duì)篩選的3株釀酒酵母菌株進(jìn)行一系列耐受性檢測(cè)，結(jié)果檢測(cè)到B5的酒精耐受性最高可達(dá)16%；B6、B9為14%；B5、B9最高可耐受2.0 mol/L KCl，B6最高可耐受2.25 mol/L KCl，B5在pH值1.0～9.0范圍內(nèi)生長(zhǎng)良好,B6的pH耐受范圍為2.0～8.0，B9為2.0～9.0。相比之下，B5具有更廣泛的酸堿適應(yīng)性；同時(shí)，三株菌均能耐受50%的葡萄糖濃度，熱致死溫度都為61～64℃之間，在25℃溫箱分別靜置饑餓培養(yǎng)10d后，均能良好生長(zhǎng)。因此，這三株菌（尤其B5）具有良好的應(yīng)用開(kāi)發(fā)潛能，可進(jìn)一步擴(kuò)大發(fā)酵檢測(cè)的規(guī)模。

[1]周婷婷,金恭璽,岳永亮,等.釀酒葡萄種質(zhì)資源抗葡萄霜霉病鑒定[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014,(10):1845-1850.

[2]Pretorius I.S.,Curtin C.D.,&Chambers P.J.(2012).The w inemaker′s bug:From ancient w isdom to opening new vistas w ith frontier yeast science.Bioeng Bugs,(3):147-156.

[3]薛軍俠.釀酒酵母的篩選鑒定及耐受性初步研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2007.

[4]宋瑤,繆禮鴻,高素芹,等.耐高溫酒精酵母菌株的篩選及發(fā)酵能力比較[J].中國(guó)釀造,2009,(5):38-42.

[5]Pinu F.R.,Edw ards P.J.,G ardner R.C.,&V illas-Boas S.G.(2014).N itrogen and carbon assimilation by Saccharomyces cerevisiae during Sauvignon blanc juice fermentation.FEM S Y east,(8):1206-1222.

[6]湯曉宏,胡文效,魏彥鋒,等.葡萄酒野生釀酒酵母的篩選及其生物特性的研究[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào).2014，(3):12-17.

[7]宋丹,喻子牛,蔡皓.耐高溫產(chǎn)乙醇釀酒酵母菌S-13的特性研究[J].化學(xué)與生物工程,2011,(6):63-67.

[8]de Ponzzes-G omes C.M.,de M élo D.L.,Santana C.A.,Pereira G.E.,M endon?a M.O.,G omes F.C.,O liveira E.S.,Barbosa A.M. Jr,Trindade R.C.,&Rosa C.A.(2014).Saccharomyces cerevisiae and non-Saccharomyces yeasts in grape varieties of the S?o Francisco V alley.Braz J M icrobiol,(2):411-416.

[9]Cordente A.G.,Curtin C.D.,V arela C.,&Pretorius I.S.(2012).Flavour-active w ine yeasts.A ppl M icrobiol Biotechnol,(3): 601-618.

（編輯：魏翔）

S641.2

A

1673-9019(2017)01-0034-04

2016-5-10

靳正忠（1978-），男，甘肅環(huán)縣人，副研究員，主要從事微生物多樣性研究；

包慧芳（1978-），女，湖南華容人，副研究員，主要從事發(fā)酵工程研究。