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      高糖條件下鋅對視網(wǎng)膜Müller細胞分泌VEGF的影響

      2017-03-04 02:53:13陳艷艷李愛朋侯璐璐盧伯洋
      中國實驗診斷學 2017年2期
      關(guān)鍵詞:高糖微血管培養(yǎng)液

      陳艷艷,楊 威,李愛朋,侯璐璐,盧伯洋,董 宇

      (吉林大學第一醫(yī)院 眼二科,吉林 長春130021)

      *通訊作者

      高糖條件下鋅對視網(wǎng)膜Müller細胞分泌VEGF的影響

      陳艷艷,楊 威,李愛朋,侯璐璐,盧伯洋,董 宇*

      (吉林大學第一醫(yī)院 眼二科,吉林 長春130021)

      糖尿病性視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病常見且嚴重的微血管并發(fā)癥之一,糖尿病患者視網(wǎng)膜缺血缺氧,導致血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)代償性增加,促進了視網(wǎng)膜新生血管的形成。Müller細胞是視網(wǎng)膜分泌VEGF的主要細胞,在糖尿病患者早期即會產(chǎn)生一系列病理生理的改變,從而導致VEGF的表達增加,在DR的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。鋅本身在抗氧化和抑制糖尿病所致的視網(wǎng)膜損傷上具有多方面生理作用,而糖尿病患者血清鋅水平與血糖呈顯著負相關(guān),本實驗擬通過體外培養(yǎng)視網(wǎng)膜Müller細胞,觀察補鋅能否抑制體外培養(yǎng)的Müller細胞VEGF表達的增加。

      1 材料與方法

      1.1 主要試劑

      DAB顯色劑(武漢博士德公司)、H-DMEM培養(yǎng)基(Gibco BRL Co.)、標準胎牛血清(蘭州民海公司 )、兔抗鼠VEGF 多克隆抗體(武漢博士德公司)、免疫組織化學SP試劑盒(武漢博士德公司)、 TritonX-10(Promega 公司)、胰蛋白酶 (Hylclone Co)。

      1.2 Müller 細胞的原代及傳代培養(yǎng)

      將出生后3-5天大乳鼠(雌雄不限)(吉林大學動物中心提供),用75%酒精浸泡麻醉后,無菌操作取出眼球,PBS液沖洗3遍,沿角膜緣旁約1 mm處環(huán)行剖開眼球,去除晶狀體和玻璃體,留后半眼球壁置于DMEM培養(yǎng)液中輕輕剝離視網(wǎng)膜,去除富含血管及髓放線后將視網(wǎng)膜剪碎成約1 mm×1 mm小片組織。吸取組織塊置于培養(yǎng)瓶中,加足量含20%標準胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,置于5%CO2,37℃恒溫孵箱內(nèi)培養(yǎng)。約7天后,細胞從組織塊周邊爬出并達到80%以上融合,此時進行消化傳代:將培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)液吸出,加入0.1 mol/L PBS輕輕沖洗殘余培養(yǎng)液2次,小心吸出后加入2 ml 0.25%胰蛋白酶37℃下消化,顯微鏡下觀察,當細胞周邊剛剛回縮即停止,加入等量含血清的DMEM培養(yǎng)液,用吸管吹打后吸入離心管中離心800 r/min×5 min,棄上清液,加入培養(yǎng)液重懸沉淀,1∶2-1∶3移入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),第2代細胞供實驗用。

      1.3 Müller細胞的鑒定

      視網(wǎng)膜Müller 細胞的免疫組化染色按試劑盒說明書操作。結(jié)果判定:以在細胞的胞膜、胞漿或胞核部位出現(xiàn)棕黃色顆粒者判定為陽性,陽性細胞在蓋片上分布須均勻一致。

      1.4 實驗分組

      將2代培養(yǎng)細胞分為4組。正常組(N):5 mmol/L葡萄糖DMEM培養(yǎng)液;高糖組(G):25 mmol/L葡萄糖DMEM培養(yǎng)液;正常加鋅組(N+Z):本組僅加5.0 μmol/L ZnSO4。高糖加鋅組(G+Z): 分別加入2.5 μmol/L、5.0 μmol/L、7.5 μmol/L、10 μmol/L ZnSO4。各組加入條件液后繼續(xù)培養(yǎng)6天。

      1.5 結(jié)果判定

      采用Imagepro-Plus軟件進行數(shù)據(jù)分析,應用計算機圖像處理技術(shù)測定染色細胞累積光密度(IOD)。每張片子取五個視野,每個視野選定10個左右細胞測定灰度值。

      1.6 統(tǒng)計學分析

      2 結(jié)果

      高糖組前5天Müller細胞VEGF水平高于高糖加鋅組,到第6天高糖組Müller細胞VEGF水平接近甚至低于高糖加鋅組;高糖組與正常組相比,前5天Müller細胞VEGF水平顯著升高,第6天基本降至正常,Müller細胞VEGF表達在第四天達高峰,高糖組與高糖加鋅組比較,Müller細胞VEGF水平顯著增高,并具有顯著性差異(P<0.01),高糖組與正常組比較Müller細胞VEGF表達水平顯著增高,具有顯著性差異(P<0.01);正常加鋅組、正常組與高糖加鋅組比較Müller細胞VEGF表達水平均無統(tǒng)計學差異(P<0.05)(表1)。

      表1 各組Müller細胞VEGF表達灰度值結(jié)果

      與正常組比較,*P<0.01,與高糖組比較,△P<0.01

      3 討論

      糖尿病是一個糖尿病性視網(wǎng)膜病變(DR)的發(fā)生是由于糖尿病所造成的缺血缺氧的體內(nèi)環(huán)境,致使氧化應激增加,氧自由基增多,氧化產(chǎn)物堆積,損傷了視網(wǎng)膜組織,造成微血管病變并導致血管閉塞,進而導致促血管生成因子和抑制因子的失衡,造成新生血管的形成.而新生血管生成因子中以VEGF研究頻率最高,VEGF能特異作用于視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞,可能是最直接的眼內(nèi)新生血管形成因子。正常條件下表達 VEGF 的細胞有多種細胞,包括神經(jīng)節(jié)細胞、Müller細胞、周細胞和視網(wǎng)膜色素上皮細胞等,糖尿病時Müller 細胞VEGF分泌增加,在DR發(fā)生發(fā)展中起至關(guān)重要的作用[1],本實驗便是從Müller細胞著手,尋找抑制Müller細胞分泌VEGF的有效途徑和方法。

      本實驗中采用25 mmol/L的高糖濃度體外培養(yǎng)Müller細胞,可以模擬糖尿病時體內(nèi)高血糖狀態(tài)[2],正常條件下各時相Müller細胞VEGF的表達一直處于低且平穩(wěn)的水平,上下起伏波動不明顯,而高糖條件下1天、2天、3天、4天Müller細胞VEGF明顯隨著時間延長表達顯著增加,第5天開始下降,但仍明顯高于正常對照組,第6天降至接近甚至低于正常水平,說明了正常條件下視網(wǎng)膜Müller細胞VEGF穩(wěn)定低表達,而高糖條件可以誘導Müller細胞VEGF的表達增加,且第1到第4天表現(xiàn)出明顯的時間依賴性,隨時間延長表達亦顯著增加,直到第5天、第6天細胞出現(xiàn)形態(tài)改變,功能下降,部分細胞失去表達VEGF的功能,導致VEGF逐漸下降到等同甚或低于正常條件組細胞VEGF表達量,此時的細胞狀態(tài)已經(jīng)衰老達不到正常細胞的狀態(tài),在本實驗中,高糖組及高糖加鋅組至第6天時VEGF表達反而下降,可能與此有關(guān)。實驗中發(fā)現(xiàn)在高糖條件下,隨時間延長,VEGF表達增加的現(xiàn)象,與臨床上我們看到的隨糖尿病病程越長,發(fā)生DR的可能性亦逐漸增加相一致。

      目前國外大量體內(nèi)、外研究均證實,鋅在1型和2型糖尿病發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,在T2D患者,隨著血清鋅水平的下降,糖尿病微血管并發(fā)癥發(fā)病率的增加,補鋅可以改善血糖控制、降低糖尿病微血管病的發(fā)生率[3-6]。Moustafa研究表明鋅可以防止糖尿病大鼠視網(wǎng)膜氧化應激過程并控制高血糖[7]。但是鋅缺乏作為糖尿病微血管并發(fā)癥的病因的證據(jù)還有待于更多的臨床研究證實[8]。本實驗通過體外高糖條件下培養(yǎng)的Müller細胞加鋅,研究補鋅對高糖情況下Müller細胞VEGF表達的影響,我們發(fā)現(xiàn)加鋅對高糖條件下培養(yǎng)的Müller細胞VEGF表達有明顯抑制作用,與國外研究結(jié)果相一致。高糖加鋅組同正常組及正常加鋅組比較無差異性(P>0.05),而高糖加鋅組和高糖組細胞比較其VEGF表達水平具有顯著性差異(P<0.01),說明鋅對高糖條件下Müller細胞VEGF的分泌具有抑制效應,試驗中我們發(fā)現(xiàn)高糖加鋅組中5.0 μmol/L鋅濃度下與正常條件下各時相Müller細胞VEGF的表達曲線變化相接近,但因該研究尚處于體外培養(yǎng)細胞研究階段,是否為或接近為臨床最佳治療濃度,仍需大量研究證實,故適用于人類的最佳治療鋅濃度也可能成為未來研究熱點。

      [1]Robbins MA,Cepko CL.Control of Muller glial cell proliferation and activation following retinal injury[J].Nat.Neurosci,2000,3(9):873.

      [2]薛慶善,主編.體外培養(yǎng)的原理與技術(shù)[M].北京:科學出版社,2001.483-484.

      [3]Flannick J,Thorleifsson G,Beer NL,et al.Loss-of-function mutations in SLC30A8 protect against type 2 diabetes[J].Nat Genet,2014,46:357.

      [4]Shan Z,Bao W,Zhang Y,et al.Interactions between zinc transporter-8 gene (SLC30A8) and plasma zinc concentrations for impaired glucose regulation and type 2 diabetes[J].Diabetes,2014,63:1796.

      [5]Wenzlau JM,Frisch LM,Hutton JC,et al.Changes in zinc transporter 8 autoantibodies following type 1 diabetes onset:The type 1 diabetes genetics consortium autoantibody workshop[J].Diabetes Care,2015,38(Suppl 2):S14.

      [6]Ranasinghe P,Pigera S,Galappatthy P,et al.Zinc and diabetes mellitus: understanding molecular mechanisms and clinical implications[J].Daru,2015,23(1):44.

      [7]Moustafa SA.Zinc might protect oxidative changes in the retina and pancreas at the early stage of diabetic rats[J].Toxicol Appl Pharmacol,2004,201:149.

      [8]Ying-Ying Luo,Jie Zhao,Xue-Yao Han,et al.Relationship Between Serum Zinc Level and Microvascular Complications in Patients with Type 2 Diabetes[J].Chin Med J (Engl),2015,128(24): 3276.

      1007-4287(2017)02-0307-03

      2016-04-15)

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