張逸風(fēng)+蘇平+胡添源+周家偉+關(guān)紅雨+高偉+黃璐琦

[摘要]貝殼杉烯酸氧化酶（kaurenoic acid oxidase）是二萜赤霉素生物合成途徑上的關(guān)鍵酶，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育等重要生物學(xué)過(guò)程。該文根據(jù)雷公藤轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)特異性引物，采用PCR技術(shù)克隆得到貝殼杉烯酸氧化酶全長(zhǎng)cDNA序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析；使用實(shí)時(shí)定量PCR（qRTPCR）研究基因的誘導(dǎo)表達(dá)水平?？寺〉玫絋wKAO長(zhǎng)度為1 874 bp，編碼487個(gè)氨基酸，蛋白相對(duì)分子質(zhì)量5602 kDa，理論等電點(diǎn)889；經(jīng)茉莉酸甲酯（MeJA）誘導(dǎo)后，TwKAO基因相對(duì)表達(dá)量在12 h達(dá)到峰值；經(jīng)植株組織表達(dá)分析證實(shí)，TwKAO基因在雷公藤的葉中表達(dá)量最高，根中最低。該研究首次克隆得到雷公藤KAO基因，并分析其mRNA表達(dá)特征，為深入研究雷公藤生長(zhǎng)發(fā)育以及萜類活性成分次生代謝研究奠定基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]雷公藤； 貝殼杉烯酸氧化酶（KAO）； 克??； 生物信息學(xué)分析； 表達(dá)分析

藥用植物雷公藤Tripterygium wilfordii Hook f系衛(wèi)矛科木質(zhì)藤本植物，臨床中多使用其根或根的木質(zhì)部入藥，具有抗炎、神經(jīng)保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等活性，可用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等免疫疾病。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，雷公藤中重要的二萜類成分雷公藤甲素在抗腫瘤尤其是治療胰腺癌[12]方面具有顯著療效。由于其廣泛的藥理活性，對(duì)雷公藤有效成分藥理作用、生物合成等方面的研究得到越來(lái)越多的關(guān)注[35]。

赤霉素是植物生長(zhǎng)發(fā)育中必不可少的激素，參與植物生長(zhǎng)包括種子萌發(fā)，莖伸長(zhǎng)以及開花等過(guò)程。而赤霉素的生物合成過(guò)程中，從ent貝殼杉烯、ent貝殼杉醇、ent貝殼杉醛到ent貝殼杉酸，再到ent7過(guò)羥基貝殼杉烯酸等連續(xù)反應(yīng)都是由 CYP450催化而成[6]。貝殼杉烯酸氧化酶（kaurenoic acid oxidase，KAO）參與從貝殼杉烯酸到GA12的反應(yīng)過(guò)程[7]，其屬于細(xì)胞色素P450中CYP88A亞家族，參與赤霉素生物合成途徑中3步連續(xù)的催化反應(yīng)[8]。目前，KAO基因已從小麥[910]，豌豆[11]，梨[12]等植物中克隆得到，并研究其缺失對(duì)向日葵矮小突變體的影響[13]。

雷公藤中KAO基因尚未克隆得到，因此本研究以雷公藤懸浮細(xì)胞為研究材料，克隆得到長(zhǎng)度為1 874 bp的TwKAO基因，研究其在茉莉酸甲酯（MeJA）誘導(dǎo)后240 h內(nèi)基因的表達(dá)水平，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步研究雷公藤重要活性成分生物合成提供寶貴的基因資源。

1材料

11植物雷公藤懸浮細(xì)胞由首都醫(yī)科大學(xué)中藥資源與分子生藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室繼代保存。培養(yǎng)條件：05 mg·L-1 2，4D + 01 mg·L-1 KT+05 mg·L-1 IBA+MS液體培養(yǎng)基，25 ℃，120 r·min-1避光培養(yǎng)。

12菌株及載體Escherichia coli Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞、pEASYT3 vector購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

13儀器與試劑VeritiTM 96孔梯度PCR儀，TF 7500 型Real Time PCR System為美國(guó) Applied Biosystems 公司，318k型高速冷凍離心機(jī)為SIGMA公司；PhusionHighFidelity PCR Master Mix with HF Buffer購(gòu)自美國(guó)NEB公司；Fast Quant RT Kit （With gDNase）、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、RNA純化試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，EastepSuper總RNA提取試劑盒購(gòu)自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司，其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。引物合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成，測(cè)序服務(wù)由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司完成。

2方法

21RNA提取與純化使用CTAB法提取雷公藤懸浮細(xì)胞總RNA并依據(jù)RNA純化試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行純化，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。

22全長(zhǎng)cDNA克隆與測(cè)序使用Fast Quant RT Kit將雷公藤懸浮細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)雷公藤懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)全長(zhǎng)特異性引物

24TwKAO基因的誘導(dǎo)表達(dá)分析于雷公藤懸浮細(xì)胞繼代培養(yǎng)12 d后，使用茉莉酸甲酯（50 μmol·L-1）誘導(dǎo)，設(shè)置對(duì)照組。于誘導(dǎo)后不同時(shí)間點(diǎn)（0，12，24，48，72，240 h）取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置4個(gè)平行樣品。使用EFLα基因作為內(nèi)參基因，根據(jù)所得TwKAO序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量特異性引物。提取雷公藤懸浮細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行TwKAO基因的誘導(dǎo)表達(dá)分析。實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)體系：10 μL 2×SYBR green Mix，04 μL ROXHigh、正反引物（10 μmol·L-1）各 04 μL，78 μL ddH2O和1 μL cDNA 。反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)重復(fù) 3次，用 2-ΔΔCt法分析其mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

25TwKAO基因的組織表達(dá)分析使用EastepSuper總RNA提取試劑盒，分別提取3株生長(zhǎng)年限相近的雷公藤植株根、莖、葉RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用EFLα基因作為內(nèi)參基因，進(jìn)行TwKAO基因的組織表達(dá)分析。方法同誘導(dǎo)表達(dá)分析方法。

3結(jié)果與分析

31TwKAO基因全長(zhǎng)cDNA獲得對(duì)雷公藤轉(zhuǎn)錄組設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行全長(zhǎng)PCR，克隆獲得長(zhǎng)度為1 874 bp的TwKAO全長(zhǎng)序列，見(jiàn)圖1。

32TwKAO基因序列分析TwKAO全長(zhǎng)序列長(zhǎng)度為1 874 bp，在152～1 615 bp位置具有完整的開放閱讀框（ORF），推測(cè)編碼487個(gè)氨基酸，序列的1～151 bp為5′UTR，1 616～1 874 bp為3′UTR。BLAST結(jié)果顯示，其與板栗Castanea mollissima相似度76%，與可可樹Theobroma cacao相似度76%，與川桑Morus notabilis相似度74%，與蘋果Malus domestica相似度74%，與西洋梨Pyrus communis相似度73%。使用DNAMAN軟件將TwKAO與板栗（AEF32085），川桑（XP_0100977241），蘋果（AGI656301），西洋梨（AGF252661），木豆（KYP520511），毛國(guó)楊（XP_0023194471）KAO氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，結(jié)果表明相似度高達(dá)8220%。結(jié)合Interpro Scan結(jié)構(gòu)域分析，TwKAO存在高度保守區(qū)Cytochrome P450 cysteine hemeiron ligand signature（427～436 aa位）：[FW][SGNH]x{F}[RKHPT]{P}C[LIVMFAP][GAD]，見(jiàn)圖2，亞鐵血紅素活性位點(diǎn)見(jiàn)圖中標(biāo)注。

33TwKAO氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析將TwKAO與GenBank下載的其他物種 KAO氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，利用 MEGA 60軟件采用相鄰連接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，見(jiàn)圖3。選取15種植物（包括13種雙子葉植物，1種單子葉植物，1種蕨類植物）和2種真菌的KAO氨基酸序列，從進(jìn)化樹中可以看出：雙子葉植物、單子葉植物、蕨類植物、真菌聚成單獨(dú)的分支，其中TwKAO歸為雙子葉植物分支。

34TwKAO理化性質(zhì)及3D結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)使用ExPASy在線軟件ProtParamtool預(yù)測(cè)TwKAO蛋白得到其相對(duì)分子質(zhì)量5602 kDa，理論等電點(diǎn)889；帶負(fù)電荷的殘基（Asp+Glu）52，帶正電荷的殘基（Arg+Lys）60；不穩(wěn)定系數(shù)3892，蛋白分類屬于穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)8969，該蛋白為親水性蛋白。信號(hào)肽預(yù)測(cè)表明TwKAO為非分泌蛋白，不具有信號(hào)肽；亞細(xì)胞定位分析顯示其可能位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；同時(shí)跨膜域分析顯示，TwKAO位于膜外，為非膜蛋白。三維同源模型見(jiàn)圖4，以2ve31A蛋白為模板，用于建立模型的氨基酸殘基為36～482位，序列同源性2827%。

35TwKAO基因的誘導(dǎo)表達(dá)分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了MeJA處理后不同時(shí)期雷公藤懸浮細(xì)胞中TwKAOmRNA表達(dá)情況，采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行相對(duì)定量表達(dá)分析，見(jiàn)圖5。結(jié)果顯示，雷公藤懸浮細(xì)胞在受到MeJA刺激后12 h，TwKAO的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值，為同時(shí)期對(duì)照組的242倍，后相對(duì)表達(dá)量迅速降低回復(fù)至正常水平。

36TwKAO基因的組織表達(dá)分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了3株生長(zhǎng)年限相近的雷公藤植株不同組織部位（根、莖、葉）TwKAO基因表達(dá)情況，見(jiàn)圖6。TwKAO基因的表達(dá)量在根、莖、葉中依次升高。葉中表達(dá)量最高，是莖表達(dá)量的149倍，是根中表達(dá)量的396倍。

4討論

植物赤霉素作為重要調(diào)節(jié)激素參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育，而赤霉素缺乏易引起植物發(fā)育不良，出現(xiàn)異于正常生長(zhǎng)的矮小突變株。因此，對(duì)植物赤霉素生物合成途徑的解析及其關(guān)鍵酶的挖掘顯得尤為重要。本研究首次從雷公藤懸浮細(xì)胞中克隆得到雷公藤貝殼杉烯酸氧化酶基因，經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)域分析顯示其含有細(xì)胞色素P450的亞鐵血紅素活性位點(diǎn)，同時(shí)與其他已知物種KAO氨基酸序列相似度較高，因此命名為TwKAO。

KAO基因在不同品種及不同組織部位表達(dá)水平各不相同，在種子、葉等赤霉素合成較為旺盛的組織中表達(dá)量較高[12]。MeJA作為一種常用的誘導(dǎo)子，對(duì)種子萌發(fā)，根生長(zhǎng)，果實(shí)成熟及衰老均有調(diào)節(jié)作用[14]。另外，茉莉酸類成分促使植物防御反應(yīng)以應(yīng)對(duì)蟲害、各種病原體及環(huán)境脅迫，如干旱、低溫和鹽脅迫等。Sophie等[15]通過(guò)MeJA處理擬南芥葉和根，發(fā)現(xiàn)氫過(guò)氧化物含量提高，表明體內(nèi)出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)。他們選擇擬南芥氧化還原反應(yīng)蛋白作為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)比熒光標(biāo)記和蛋白膠，確定大量氧化還原應(yīng)答，MeJA處理后蛋白大量變化以應(yīng)對(duì)，同時(shí)，壓力和防御蛋白也大量表達(dá)。此外，那些參與茉莉酸生物合成、次生代謝反應(yīng)、細(xì)胞壁合成、編碼壓力保護(hù)和防御的基因都可被MeJA誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)[16]。本研究選擇雷公藤懸浮細(xì)胞繼代后12 d作為誘導(dǎo)初始時(shí)間，排除了細(xì)胞生長(zhǎng)及逆境等因素造成植物基因表達(dá)的干擾，細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定，對(duì)照組可見(jiàn)基因相對(duì)表達(dá)量逐漸降低。經(jīng)過(guò)MeJA誘導(dǎo)后，TwKAO相對(duì)表達(dá)量?jī)H在12 h達(dá)到峰值，為同時(shí)期對(duì)照組的242倍，后迅速下降至正常水平，符合MeJA對(duì)于植物誘導(dǎo)引發(fā)的應(yīng)激反應(yīng)規(guī)律。后期可以進(jìn)一步分析赤霉素作為促進(jìn)植物生長(zhǎng)的激素與同樣對(duì)萜類次生代謝具有調(diào)節(jié)作用的MeJA二者生物合成途徑的關(guān)聯(lián)性。本研究成功克隆獲得雷公藤貝殼杉烯酸氧化酶基因，為深入研究雷公藤生長(zhǎng)發(fā)育以及萜類活性成分次生代謝提供寶貴的基因資源。

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