醋制對(duì)商陸及商陸正丁醇部位中皂苷類成分含量的影響

郁紅禮+張程超+吳皓+王奎龍+王衛(wèi)+單雪蓮

[摘要]為研究醋制對(duì)商陸及商陸正丁醇部位皂苷類成分的影響，比較商陸中主要毒性成分商陸皂苷B（EsB）和商陸皂苷C（EsC）醋制前后含量的變化，依據(jù)商陸《中國(guó)藥典》醋炙工藝，將商陸正丁醇部位進(jìn)行模擬醋制；采用液質(zhì)聯(lián)用法對(duì)商陸正丁醇部位醋制前后皂苷類成分進(jìn)行研究；采用HPLCELSD方法檢測(cè)毒性成分EsC和EsB在商陸生品、醋制品中的含量，考察商陸醋制前后的含量變化。結(jié)果顯示，商陸正丁醇部位中除商陸皂苷甲（EsA）以外，各商陸皂苷類成分含量均不同程度下降，皂苷類化合物組成顯著變化，但醋制后未見新化合物生成；含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)生商陸中EsC和EsB的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為012%，020%，醋制后下降為048%，0094%。表明醋制能夠顯著改變商陸及商陸正丁醇部位中皂苷類成分的組成，顯著降低毒性皂苷EsC和EsB的含量，表明商陸采用醋制法炮制的科學(xué)性。

[關(guān)鍵詞]商陸； 商陸皂苷； 液質(zhì)聯(lián)用； HPLC； EsC； EsB；

商陸科有毒中藥商陸Phytolacca acinosa Roxb或垂序商陸P americama L有逐水消腫的功能，主治水腫脹滿、二便不通，臨床應(yīng)用廣泛。但自《神農(nóng)本草經(jīng)》以來歷代本草醫(yī)書均記載為有毒，故臨床使用其炮制品，以降低毒性緩和藥性[1]。臨床誤服鮮品或生品，毒性表現(xiàn)中最為常見的腹痛、腹瀉[24]，是商陸的主要毒副作用，但其毒性作用機(jī)制未明，而醋制后毒性明顯下降[5]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)商陸正丁醇萃取部位具有強(qiáng)烈的刺激性，并能引起炎癥和導(dǎo)致腸道腹瀉，是商陸的主要毒性部位，其他部位未見明顯毒性[67]。進(jìn)一步研究表明正丁醇部位中多種皂苷類成分如商陸皂苷B、商陸皂苷C具有顯著的致炎毒性[6]，能引起腸道水通道蛋白表達(dá)變化[8]。且可能與其引起腸道腹瀉相關(guān)[911]。商陸有毒，歷版《中國(guó)藥典》亦以醋炙法炮制商陸，以緩和峻下逐水的作用。故本實(shí)驗(yàn)采用液質(zhì)聯(lián)用及HPLC研究醋制對(duì)商陸正丁醇部位皂苷類成分及主要毒性成分EsB和EsC醋制前后含量的影響，以期闡釋商陸醋制解毒機(jī)制。

1材料

液質(zhì)聯(lián)用：20DXR HPL系統(tǒng)（SHIMADZU公司，日本）；Triple TOFTM5600質(zhì)譜儀（美國(guó)AB SCIEX公司）配有電噴霧離子源（ESI）。

Waters e2695高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司），Alltech 2000ES ELSD檢測(cè)器；Purospher C18色譜柱（46 mm×250 mm，5 μm）；Labconco（6 L）冷凍干燥機(jī)（美國(guó)Labconco公司）SpringS15i超純水發(fā)生器；KQ500DE型醫(yī)用數(shù)控超聲清洗器；Rotavapor R210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BUCHI）；HH2K4二列四孔智能水浴鍋（南京科爾儀器設(shè)備有限公司）；BP211D電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；美的電磁爐。

鎮(zhèn)江香醋（江蘇恒順醋業(yè)股份有限公司，總酸550～599 g·L-1，批號(hào)20150723/A3）；羧甲基纖維素鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20140122）；色譜甲醇（Scharlau公司，批號(hào)67561）。其余試劑均為分析純。水為超純水。

生商陸飲片購自精華制藥亳州康普有限公司（云南產(chǎn)，批號(hào)131201）。飲片經(jīng)江蘇省食品藥品檢驗(yàn)所胡皓彬主任藥師鑒定為商陸科植物垂序商陸P americana的干燥根。

2方法與結(jié)果

21樣品制備

商陸正丁醇部位浸膏的制備：將生商陸10 kg，置于中藥提取罐中，加入8倍量70%乙醇回流提取2 h，取出提取液，殘?jiān)尤?倍量70%乙醇回流提取1 h，重復(fù)上述操作，合并3次提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，得醇浸膏。將商陸70%乙醇浸膏用適量水溶解，分別先以石油醚、二氯甲烷萃取，母液再加入4倍量水飽和正丁醇，萃取數(shù)次，合并萃取液，回收溶劑，凍干，得正丁醇浸膏。

醋制正丁醇部位浸膏的制備：取正丁醇浸膏100 g，根據(jù)商陸飲片炮制加醋量（每100 kg生商陸加醋30 kg）和正丁醇部位浸膏的得率（20%），故加150 g食醋，100 ℃煮30 min，減壓濃縮，冷凍干燥后得到醋制后正丁醇部位。

醋商陸飲片自制，按照2015年版《中國(guó)藥典》中醋炙法制得，即取凈商陸100 g，加入30 g醋拌勻，悶潤(rùn)至醋被吸盡，文火炒干，晾涼。

商陸皂苷（esculentoside，Es）A，B，C，D，F(xiàn)均為實(shí)驗(yàn)室自制。

22醋制對(duì)商陸正丁醇部位中皂苷類成分含量的影響

221供試品溶液的制備取商陸正丁醇部位浸膏、醋制正丁醇部位浸膏適量，加甲醇制成1 g·L-1。

222色譜條件及質(zhì)譜條件Purospher C18色譜柱；流動(dòng)相甲醇（A）01%甲酸水溶液（B）；梯度洗脫（0～5 min，35%～45%A；5～15 min，45%～60%A；15～25 min，60%A；25～30 min，60%～65%A；30～40 min，65%～80%A；40～55 min，80%A；55～56 min，80%～35%A；56～60 min，35%A）；流速為1 mL·min-1；柱溫30 ℃。

采用電噴霧負(fù)離子模式檢測(cè)，一級(jí)質(zhì)譜參數(shù)：離子源氣155 V；離子源氣255 V；氣簾氣 40 V；離子源溫度 550 ℃；TSVF -4 500V；除簇電壓-60 V；碰撞能量-35 V；碰撞能量補(bǔ)償 15 V。質(zhì)譜掃描范圍m/z 100～1 200。氮?dú)鉃楸Ｗo(hù)氣和噴霧氣。

223數(shù)據(jù)采集分析使用PeakviewTM軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析，得到精確的質(zhì)量、母離子和碎片離子。通過比較目標(biāo)對(duì)照品相對(duì)分子質(zhì)量和保留時(shí)間對(duì)色譜峰進(jìn)行鑒定，使用提取離子色譜圖（XIC）功能對(duì)各色譜峰進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，醋制可改變商陸正丁醇部位中不同皂苷的含量。商陸正丁醇部位醋制后，除EsA其余各皂苷類化合物峰面積均不同程度下降，商陸皂苷的組成發(fā)生明顯變化，但未見新成分生成。

EsB含量變化趨勢(shì)與質(zhì)譜分析結(jié)果中顯示醋制后的正丁醇部位中EsC和EsB相對(duì)含量顯著下降一致。

3討論

國(guó)內(nèi)外對(duì)商陸中皂苷類成分的研究大多局限于EsA，認(rèn)為EsA是商陸中的藥效成分[1214]，《中國(guó)藥典》以EsA作為商陸及其飲片醋商陸的含量測(cè)定指標(biāo)。眾所周知，商陸中除EsA外還有多種皂苷類成分，但到目前為止，未見有商陸醋制前后，除EsA以外的其他皂苷類成分的變化研究。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)商陸中的具有炎癥刺激性及腸道毒性刺激的物質(zhì)基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)皂苷類成分與商陸炎癥刺激和腸道腹瀉相關(guān)[58，16]。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，以質(zhì)譜及HPLC分析商陸飲片及其正丁醇部位醋制前后皂苷類成分的含量變化。液質(zhì)聯(lián)用分析發(fā)現(xiàn)商陸正丁醇部位醋制后未見新化合物的生成，除EsA其余各皂苷類化合物峰面積均不同程度下降；HPLC分析發(fā)現(xiàn)，醋制后商陸中毒性成分EsB，EsC的含量明顯下降。醋制前后商陸飲片中EsC和EsB含量變化趨勢(shì)與正丁醇部位醋制前后EsB，EsC質(zhì)譜測(cè)定的相對(duì)含量變化趨勢(shì)一致，2種毒性成分的含量均大幅下降。而有研究顯示，商陸炮制后EsA的含量上升[1618]，表明醋制過程中皂苷類成分可能存在相互轉(zhuǎn)化。

因課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，商陸皂苷類成分具有顯著的致炎作用，且EsB，EsC的致炎效應(yīng)顯著高于EsA，EsC致炎毒性最強(qiáng)[6]。且EsB和EsC能夠顯著降低HT29細(xì)胞內(nèi)AQP3 mRNA和蛋白的表達(dá)，可能導(dǎo)致腸道水代謝障礙，導(dǎo)致腹瀉，且EsC的作用最強(qiáng)，而EsA無明顯作用[7]，表明商陸皂苷類成分中，不同種的皂苷，因結(jié)構(gòu)差異其毒性也具有顯著差異。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)醋制后商陸生品及其正丁醇部位中各種皂苷類成分的組成發(fā)生明顯變化，且毒性成分EsB和EsC的含量顯著下降。其毒性成分的含量下降與醋制后毒性作用顯著下降呈正相關(guān)，表明商陸采用醋制法炮制的科學(xué)性，為商陸醋制工藝優(yōu)化和質(zhì)量控制研究奠定基礎(chǔ)。

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