施毅，史家欣

(1.解放軍南京總醫(yī)院呼吸與危重癥科，南京 210002；2.連云港市第一人民醫(yī)院呼吸科，江蘇連云港 222002)

肺真菌病的臨床診斷與實(shí)驗(yàn)室檢查進(jìn)展

施毅1，史家欣2

(1.解放軍南京總醫(yī)院呼吸與危重癥科，南京 210002；2.連云港市第一人民醫(yī)院呼吸科，江蘇連云港 222002)

肺真菌病是臨床上一種常見病，其發(fā)病率不斷增加，但臨床診斷和治療依然較為困難，病死率居高不下。肺真菌病的診斷，特別是早期診斷一直是臨床研究的熱點(diǎn)。肺真菌病目前主要采取分級(jí)診斷和治療。肺部真菌感染以曲霉、念珠菌及隱球菌多見。實(shí)驗(yàn)室檢查主要以痰和分泌物的涂片和培養(yǎng)、穿刺標(biāo)本的病理檢查、真菌抗原和抗體檢測以及核酸檢測等方法為主。一些新的檢查技術(shù)，如宏基因組檢測和現(xiàn)場快速評(píng)估技術(shù)(ROSE)等也在進(jìn)一步探索當(dāng)中。病原快速檢測指導(dǎo)目標(biāo)治療技術(shù)也是今后的發(fā)展方向。

肺真菌?。辉\斷；實(shí)驗(yàn)室檢查；病原體

隨著免疫抑制人群的增多，抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，肺真菌病的發(fā)病率不斷增加，但臨床診斷和治療依然較為困難，導(dǎo)致病死率居高不下。因此，肺真菌病的診斷，特別是早期診斷仍然是臨床研究的熱點(diǎn)。本文對(duì)近年來肺真菌病的臨床和實(shí)驗(yàn)室診斷進(jìn)展作一介紹。

1 肺真菌病的臨床診斷

根據(jù)2007年中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)制定的《肺真菌病診斷與治療專家共識(shí)》[1]，中國侵襲性肺真菌病(invasive pulmonary fungal diseases, IPFD)工作組經(jīng)反復(fù)討論，參照歐美國家的相關(guān)診斷和治療指南，結(jié)合中國國情，制定出 IPFD的診斷標(biāo)準(zhǔn)和治療原則與專家共識(shí)，明確提出臨床診斷IPFD時(shí)要充分結(jié)合宿主因素，除外其他病原體所致的肺部感染和類似臨床表現(xiàn)的肺部疾病，并將診斷分為確診(proven)、臨床診斷(probable)及擬診(possible)3個(gè)級(jí)別。其目前仍然是指導(dǎo)中國真菌感染診治的主要參考依據(jù)，要點(diǎn)如下。

1.1診斷依據(jù) (1)宿主因素：外周血中性粒細(xì)胞減少(<0.5×109/L，且持續(xù)>10 d)，或體溫>38 ℃，或<36 ℃，伴有近期內(nèi)中性粒細(xì)胞減少、曾接受或正在接受免疫抑制藥治療、有免疫缺陷病或應(yīng)用免疫抑制藥病史。(2)臨床特征：主要為侵襲性肺曲霉感染的特征性胸部影像學(xué)改變，肺孢子菌肺炎兩肺出現(xiàn)毛玻璃樣肺病變征象，伴有低氧血癥；次要特征為肺部感染的癥狀和體征、新出現(xiàn)肺部浸潤影、積極抗菌治療無效的發(fā)熱等。(3)微生物學(xué)檢查：如合格痰液、支氣管肺泡灌洗液(BALF)直接鏡檢發(fā)現(xiàn)菌絲，真菌培養(yǎng)2次陽性，發(fā)現(xiàn)肺孢子菌包囊、滋養(yǎng)體或囊內(nèi)小體；血液標(biāo)本半乳甘露聚糖(GM)和1，3-β-D-葡聚糖(G)試驗(yàn)檢測連續(xù)2次陽性；血液、胸腔積液標(biāo)本隱球菌莢膜多糖抗原陽性等。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn) (1)確診：至少符合1項(xiàng)宿主因素，肺部感染的1項(xiàng)主要或2項(xiàng)次要臨床特征，血培養(yǎng)或無菌腔液真菌培養(yǎng)陽性，或組織病理學(xué)改變。(2)臨床診斷：至少符合1項(xiàng)宿主因素，肺部感染的1項(xiàng)主要或2項(xiàng)次要臨床特征，1項(xiàng)微生物學(xué)檢查改變。(3)擬診：至少符合1項(xiàng)宿主因素，肺部感染的1項(xiàng)主要或2項(xiàng)次要臨床特征。

1.3新的指南問世 近年來，歐洲感染病學(xué)會(huì)更新了真菌感染診治指南。美國感染性疾病學(xué)會(huì)(IDSA)沒有發(fā)布統(tǒng)一的真菌感染診治指南，而是分別制定了念珠菌、曲霉、隱球菌感染診治指南。其要點(diǎn)體現(xiàn)在“從經(jīng)驗(yàn)走向目標(biāo)”：如果作為血液系統(tǒng)惡性腫瘤，由于存在高危因素(主要是嚴(yán)重的中性粒細(xì)胞缺乏)，真菌感染發(fā)病率高，應(yīng)盡早做出診斷，強(qiáng)調(diào)早期經(jīng)驗(yàn)性治療以降低病死率，而非粒細(xì)胞缺乏患者，由于不同真菌病原體感染有不同的臨床表現(xiàn)和相對(duì)特異的診斷方法，因而更強(qiáng)調(diào)明確診斷后的目標(biāo)治療。

2 肺真菌病的危險(xiǎn)因素及常見致病真菌

絕大多數(shù)肺真菌病患者有免疫功能異常，在經(jīng)典高危人群如白血病、艾滋病、骨髓干細(xì)胞移植及實(shí)體器官移植等患者中，IPFD的發(fā)病率高達(dá)20%～40%[2]。還有一部分內(nèi)、外科危重病患者，屬于非經(jīng)典高危人群，由于嚴(yán)重的基礎(chǔ)疾病、心血管疾病等手術(shù)指征和范圍的擴(kuò)大、各種導(dǎo)管的體內(nèi)介入與留置，以及廣譜抗菌藥物和糖皮質(zhì)激素的廣泛應(yīng)用等，導(dǎo)致患者免疫屏障受損與功能障礙而引發(fā)IPFD。值得注意的是，非粒細(xì)胞缺乏患者肺部真菌感染者也不在少數(shù)。表觀正常人隱球菌感染常見，甚至有患者體檢發(fā)現(xiàn)肺部病灶，最后活檢才確診為隱球菌病。Meersseman等[3]報(bào)告，長期使用糖皮質(zhì)激素治療、慢性阻塞性肺病(COPD)、肝壞死、實(shí)體器官腫瘤、HIV感染、肺移植術(shù)后、長期接受免疫抑制藥治療的系統(tǒng)性疾病等均為曲霉感染的危險(xiǎn)因素，其危險(xiǎn)程度雖不及粒細(xì)胞缺乏那么嚴(yán)重，但更為廣泛和常見，涉及的人群也更多。其他危險(xiǎn)程度較低的因素還有嚴(yán)重?zé)齻⑵渌麑?shí)體器官移植術(shù)后、使用糖皮質(zhì)激素治療、長期滯留ICU、營養(yǎng)不良和心臟手術(shù)后等。特別需要強(qiáng)調(diào)的是，COPD患者由于存在嚴(yán)重的結(jié)構(gòu)性病變，黏液纖毛清除功能受損，加之長期接受糖皮質(zhì)激素和廣譜抗生素治療，氣道內(nèi)容易發(fā)生曲霉定植，而我國多數(shù)醫(yī)院都存在不間斷的基礎(chǔ)建設(shè)或改建形成的環(huán)境因素，故COPD已被認(rèn)為是IPFD的重要危險(xiǎn)因素，而且病死率非常高[4]。

根據(jù)我國目前的流行病學(xué)資料，在非血液惡性疾病患者中肺真菌病主要有肺曲霉病(37.9%)，肺念珠菌病(34.2%)，肺隱球菌病(15.6%)，肺孢子菌病(4.8%)，肺毛霉病(2.1%)，肺馬爾尼菲藍(lán)狀菌病和組織胞漿菌病[5]。

3 肺真菌病的臨床實(shí)驗(yàn)室檢查

3.1痰和分泌物的涂片和培養(yǎng) 痰是呼吸道感染病原學(xué)診斷最常用的臨床標(biāo)本，而痰標(biāo)本采集方法的正確與否、痰標(biāo)本是否合格同樣是真菌培養(yǎng)能否檢出病原菌的關(guān)鍵。痰可行革蘭染色或相關(guān)特殊染色(如熒光染色)進(jìn)行鏡檢。革蘭染色法是非特異性的真菌染色方法，可在一定程度上提高菌絲的識(shí)別率。某些特異性染色，如六胺銀染色(GMS)和過碘酸-希夫染色(PAS染色)可應(yīng)用于曲霉、毛霉和念珠菌等真菌病原體染色，且兩者聯(lián)合染色能夠進(jìn)一步提高真菌病原體的檢出率[6]。呼吸道標(biāo)本如發(fā)現(xiàn)曲霉或毛霉菌絲臨床意義較大。念珠菌由于在口腔定植非常常見，涂片發(fā)現(xiàn)念珠菌假菌絲和出芽孢子時(shí)應(yīng)特別注意排除口腔局部定植或感染，如果考慮將其作為下呼吸道感染病原學(xué)的診斷依據(jù)時(shí)須非常謹(jǐn)慎，必須與臨床危險(xiǎn)因素、血清標(biāo)志物(如G試驗(yàn))和培養(yǎng)結(jié)果等相結(jié)合進(jìn)行綜合判斷。

經(jīng)纖支鏡引導(dǎo)保護(hù)性毛刷(PSB)技術(shù)可減少標(biāo)本污染，有更好的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性[7]。還可經(jīng)纖支鏡取得BALF進(jìn)行鏡檢、真菌標(biāo)志物檢測及培養(yǎng)等。但需要特別提醒臨床和實(shí)驗(yàn)室高度注意的是，直接纖支鏡檢和灌洗時(shí)如果患者口腔準(zhǔn)備做的不好或是沒做，則下鏡時(shí)極易將口腔定植菌帶入支氣管腔內(nèi)而導(dǎo)致假陽性結(jié)果。因此，行纖支鏡檢查時(shí)務(wù)必做好口腔處理，如常規(guī)給予銀爾通等漱口并清理鼻腔，可大大減少口腔定植菌帶入支氣管內(nèi)的風(fēng)險(xiǎn)，提高檢測結(jié)果的可靠性。

痰培養(yǎng)念珠菌陽性往往難以區(qū)分定植或感染，故臨床意義有限，其陽性結(jié)果解釋須慎重，即使經(jīng)纖支鏡下PSB取得的標(biāo)本培養(yǎng)陽性也不能作為診斷侵襲性念珠菌感染的依據(jù)。但在合格痰標(biāo)本、誘導(dǎo)痰或BALF中，直接鏡檢發(fā)現(xiàn)大量出芽菌體和念珠菌菌絲，再結(jié)合培養(yǎng)陽性結(jié)果，可以提示臨床此時(shí)念珠菌處于快速繁殖期而有可能作為感染致病原，有一定的臨床指導(dǎo)意義。

合格痰標(biāo)本、氣管內(nèi)吸引物、BALF或刷檢標(biāo)本鏡檢發(fā)現(xiàn)較為特異的曲霉菌絲，痰標(biāo)本培養(yǎng)連續(xù)2次分離到同種曲霉及BALF的單次培養(yǎng)陽性，可作為診斷肺曲霉病的微生物學(xué)依據(jù)[8]，但臨床醫(yī)生仍應(yīng)注意將結(jié)果與宿主因素和臨床特征相結(jié)合來判定其臨床意義。需要指出的是，曲霉涂片結(jié)果遠(yuǎn)不如培養(yǎng)的陽性率高。

隱球菌感染以新型隱球菌常見，常用染色方法包括HE染色法、墨汁染色法、PAS染色法和GMS染色法等。墨汁染色通常用于檢查腦脊液或分泌物涂片中的隱球菌，是涂片中檢查隱球菌感染的首選方法，也可用于快速排查，但該方法不適合用于黏稠的呼吸道分泌物。痰液、氣管吸引物培養(yǎng)隱球菌陽性可以作為診斷的重要依據(jù)。但需要注意的是，由于新型隱球菌可以寄居于健康人群，因此，同樣應(yīng)結(jié)合臨床具體情況判斷是否為感染。

與其他真菌不同，肺孢子菌肺炎(PCP)的診斷較為困難，因?yàn)榉捂咦泳鸁o法通過可靠的培養(yǎng)方法檢出，所以其感染的主要確診方式是通過多種染色技術(shù)直接觀察到病原體，其具有很高的特異性。目前常用于肺孢子菌包囊和滋養(yǎng)體檢測的染色方法有GMS染色法、瑞-吉姆薩染色法、巴氏染色法、免疫熒光染色法等。其中最常用的是GMS染色法、免疫熒光染色法，均敏感且特異。PCP診斷最可靠的依據(jù)是在BALF或誘導(dǎo)痰中直接鏡檢發(fā)現(xiàn)病原體[9]。

3.2穿刺標(biāo)本的病理診斷 組織病理學(xué)檢查是確診真菌感染的重要手段，被稱為“金標(biāo)準(zhǔn)”，可通過經(jīng)皮肺穿刺活檢、細(xì)針抽吸、開胸肺活檢、經(jīng)纖支鏡肺活檢、經(jīng)纖支鏡防污染毛刷獲取標(biāo)本。

3.2.1曲霉感染 病變?cè)缙跒閺浡詽B出性改變；晚期為壞死、化膿和肉芽腫形成。病灶內(nèi)可找到大量菌絲，分支呈45°角，菌絲穿透血管可引起血管炎、血管周圍炎及血栓形成等，血栓形成可致組織缺血、壞死。

3.2.2隱球菌感染 病變與病期早晚有關(guān)。早期形成膠樣病灶，炎癥反應(yīng)輕微，病灶中可見大量隱球菌；晚期病變呈肉芽腫性，有纖維組織增生，大量的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、異物巨噬細(xì)胞充斥其中，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見隱球菌。

3.2.3念珠菌感染 基本病理變化是以單核細(xì)胞為主的肉芽腫性炎癥。早期以滲出為主，有巨噬細(xì)胞、上皮樣細(xì)胞等浸潤；晚期則為肉芽腫形成及若干灰色微小膿腫。病灶內(nèi)可找到孢子和假菌絲。血管受累呈急慢性血管炎改變，易破裂出血。

3.2.4肺孢子菌感染 肺實(shí)變，體積增大，外觀呈不規(guī)則結(jié)節(jié)狀或棘狀。肺泡上皮細(xì)胞增生，Ⅰ型上皮細(xì)胞可呈退行性變、細(xì)胞脫落和肺泡壁壞死，但無化膿性改變；Ⅱ型上皮細(xì)胞腫脹。肺間質(zhì)充血水腫、肺泡間隔增寬。間質(zhì)中淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤，亦可見中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞。

3.3真菌抗原和抗體檢測

3.3.1GM GM是曲霉細(xì)胞壁上的一種多聚糖，在曲霉侵犯組織早期就可釋放入血，可持續(xù)1～8周，最高靈敏度達(dá)1 ng/mL，是目前用于診斷侵襲性肺曲霉病(IPA)的一種可靠的方法，可對(duì)血清、BALF標(biāo)本進(jìn)行檢測[10-11]。在粒細(xì)胞缺乏患者中已經(jīng)證實(shí)GM檢測診斷IPA的敏感性和特異性都在90%左右。但對(duì)非粒細(xì)胞缺乏患者IPA診斷，血清GM試驗(yàn)的敏感性僅為50%或更低[5，12]。因此，在非粒細(xì)胞缺乏患者血清GM試驗(yàn)陰性時(shí)不能排除IPA，還應(yīng)結(jié)合其他檢查，主要是BALF培養(yǎng)來評(píng)估和確定IPA的診斷。近年來，BALF的GM試驗(yàn)越來越受到人們的重視。有研究報(bào)告，BALF的GM試驗(yàn)的敏感性為88%、特異性為87%[13]。南京總醫(yī)院對(duì)肺曲霉病患者同時(shí)檢測血清和BALF中的GM(cut off值≥0.5為陽性)，證實(shí)BALF的GM敏感性(75.7%)明顯高于血清GM(37.8%)[14]。建議有條件的醫(yī)院應(yīng)常規(guī)開展BALF中GM檢測，非常有助于臨床的早期診治。陽性界值目前尚無統(tǒng)一規(guī)定，美國食品和藥品監(jiān)督管理局(FDA)以1.0而歐洲國家多以0.7或0.8作為診斷界值。

GM在血液系統(tǒng)惡性腫瘤及肝細(xì)胞移植曲霉感染患者中的敏感性和特異性高于實(shí)體器官移植感染者[10]。動(dòng)態(tài)監(jiān)測GM變化更有助于診斷及治療效果的評(píng)估。需要注意的是，使用哌拉西林/他唑巴坦后可導(dǎo)致血液GM滴度明顯上升，牛奶等某些高蛋白食物中可能含有GM抗原，亦可引起短暫的GM滴度升高，需要臨床警惕。

3.3.2G G是大多數(shù)真菌的細(xì)胞壁成分，但隱球菌、接合菌(主要是毛霉屬)除外。血清G試驗(yàn)診斷IPFD的敏感性達(dá)80%，特異性達(dá)82%[15]。需要注意的是，透析使用纖維素膜、蘑菇多糖和血液蛋白質(zhì)制品會(huì)導(dǎo)致G試驗(yàn)滴度升高，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。

3.3.3隱球菌莢膜多糖抗原 采用乳膠凝集法檢測患者血液中隱球菌莢膜多糖抗原可用于診斷隱球菌感染，有報(bào)道其診斷肺部隱球菌感染的敏感性和特異性可達(dá)96.2%和99.4%，非常值得在臨床推廣應(yīng)用。近年來，采用膠體金方法快速檢測(15 min)隱球菌莢膜多糖抗原，并可行半定量檢測，其敏感性和特異性與乳膠凝集法相當(dāng)，期望能盡早普及開展。

3.3.4特異性真菌抗體 包括念珠菌抗體、曲霉抗體等，多用于回顧性研究或慢性真菌感染的輔助診斷。粒細(xì)胞缺乏患者由于免疫功能缺陷往往不能產(chǎn)生抗體或在疾病早期尚未形成抗體，故進(jìn)行血清曲霉抗體檢測沒有臨床意義。但非粒細(xì)胞缺乏患者通常發(fā)病較為緩慢、免疫狀態(tài)尚可，進(jìn)行血清抗體檢測在許多情況下具有輔助診斷價(jià)值，甚至接近確診價(jià)值。如在診斷肺曲霉球、慢性肺曲霉病(CPA)和變應(yīng)性支氣管肺曲霉病(ABPA)等時(shí)[8]，主要檢測指標(biāo)是血清曲霉特異性IgM、IgG、IgE類抗體，其中曲霉特異性IgG在CPA的診斷中具有接近確診的價(jià)值。目前國內(nèi)有些研究者正在開展曲霉IgG類抗體檢測的臨床實(shí)驗(yàn)，但尚無批準(zhǔn)上市的抗體檢測試劑盒，能檢測的主要是血清曲霉特異性IgE類抗體，后者僅對(duì)ABPA有診斷價(jià)值。因此，需要盡早開展此項(xiàng)檢測工作并進(jìn)一步評(píng)估其臨床診斷價(jià)值。

其他快速檢測(膠體金法)尚有血清抗念珠菌烯醇化酶特異性抗體檢測、曲霉細(xì)胞外糖蛋白檢測等，均顯示了良好的臨床應(yīng)用前景。

3.4現(xiàn)場快速評(píng)估(rapid on site evaluation, ROSE)技術(shù)的應(yīng)用 ROSE在肺及縱隔病變的活檢中是一項(xiàng)非常有用的輔助技術(shù)。穿刺標(biāo)本經(jīng)過快速固定，進(jìn)行快速HE或Diff-quick染色，鏡檢，首先確認(rèn)所取得的標(biāo)本是否合格，再對(duì)標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)染色。若懷疑真菌感染，則需要送微生物培養(yǎng)及特殊染色。此技術(shù)對(duì)于提高真菌檢出率、減少不必要的穿刺有重要價(jià)值。

3.5核酸檢測 PCR技術(shù)在真菌檢測方面具有特異性強(qiáng)、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，但費(fèi)用高、操作復(fù)雜，存在假陽性等問題。有研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用PCR技術(shù)檢測患者BALF標(biāo)本診斷IPA的敏感性和特異性分別為88%和75%，具有一定的臨床價(jià)值[16]。尤其實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)，不需凝膠電泳，操作過程簡化，污染機(jī)會(huì)減少，具有一定的應(yīng)用前景。但是由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的操作方案導(dǎo)致報(bào)道的研究結(jié)果之間差異較大，目前尚不能應(yīng)用于臨床診斷，僅供臨床醫(yī)師在具有高危因素的患者診斷時(shí)謹(jǐn)慎參考[17-18]。

1998年首次提出了針對(duì)特定環(huán)境樣品中全部微生物的基因組總和進(jìn)行研究的宏基因組(metagenome)概念。宏基因組測序以特定環(huán)境中全部微生物群落作為研究對(duì)象，不需要對(duì)微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)，而是提取環(huán)境微生物總DNA作為研究對(duì)象，擺脫了傳統(tǒng)研究中微生物分離培養(yǎng)的技術(shù)限制。采用高通量測序技術(shù)，對(duì)18S進(jìn)行測序可以進(jìn)行真菌鑒定，展示了良好的應(yīng)用前景。

此項(xiàng)技術(shù)尚在研究中，需要解決的技術(shù)難題包括樣本處理、結(jié)果解釋(和臨床驗(yàn)證)、數(shù)據(jù)分析等，目前離臨床應(yīng)用尚遠(yuǎn)。此外，病原快速檢測只能適應(yīng)經(jīng)驗(yàn)性用藥，尚無法滿足目標(biāo)用藥，這也是今后診斷技術(shù)研究的方向。

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2017-09-10)

(本文編輯：劉群)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.10.02

施毅，1956年生，男，教授，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，主要從事肺部感染、肺癌、呼吸危重癥、慢性氣道炎癥性疾病相關(guān)研究。

R446.5

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