孫曉霞，黃經(jīng)春，王鸞鸞，王昕，侯麗

國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局 濟(jì)南醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心 山東省醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南250101

不同振蕩速率制備陽(yáng)性對(duì)照在醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

孫曉霞，黃經(jīng)春，王鸞鸞，王昕，侯麗

國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局 濟(jì)南醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心 山東省醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南250101

醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)中試驗(yàn)樣品制備的標(biāo)準(zhǔn)化是保證其試驗(yàn)結(jié)果具有可靠性和可比性的關(guān)鍵。為了進(jìn)一步明確樣品制備過(guò)程中振蕩速率對(duì)浸提液溶出物的影響，本研究以國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)ISO10993-12: 2007中推薦的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(SPU-ZDEC)為試驗(yàn)樣品，檢測(cè)了不同振蕩速度下浸提液的細(xì)胞毒性。結(jié)果表明，醫(yī)療器械生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中不同的樣品振蕩速率對(duì)檢測(cè)結(jié)果具有顯著影響，本研究對(duì)于今后標(biāo)準(zhǔn)制定中規(guī)定樣品制備的標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，有著重要的參考意義。

二乙基二硫代氨基甲酸鋅；細(xì)胞毒性；振蕩速率；恒溫培養(yǎng)振蕩器；酶標(biāo)儀

引言

醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)中在進(jìn)行試驗(yàn)以及解釋試驗(yàn)結(jié)果時(shí)，應(yīng)考慮器械在人體應(yīng)用時(shí)的接觸性質(zhì)、程度、頻率、時(shí)間和條件等因素，此外，還要關(guān)注的一個(gè)重要因素即：試驗(yàn)樣品的制備。試驗(yàn)樣品的選擇和制備標(biāo)準(zhǔn)化是保證生物學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果可靠性和可比性的關(guān)鍵一步。ISO10993-12:2007中規(guī)定樣品浸提應(yīng)在攪拌或環(huán)流的條件下進(jìn)行，即采用動(dòng)態(tài)方法進(jìn)行浸提，但并未詳細(xì)規(guī)定動(dòng)態(tài)浸提的具體方法和參數(shù)（如轉(zhuǎn)速，旋轉(zhuǎn)方式等）。在實(shí)際檢驗(yàn)工作中，不同的動(dòng)態(tài)參數(shù)會(huì)直接影響檢測(cè)結(jié)果。由于細(xì)胞毒性試驗(yàn)是目前公認(rèn)的一種鑒別篩選生物相容性材料良好性的最敏感的體外試驗(yàn)方法，故本實(shí)驗(yàn)室對(duì)ISO10993-12: 2007（即GBT16886.12: 2005）中推薦的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（ZDEC）以不同振蕩速率浸提并通過(guò)系列稀釋進(jìn)行體外細(xì)胞毒性檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果表明不同的振蕩浸提速率對(duì)細(xì)胞毒性結(jié)果具有顯著影響。本研究為今后醫(yī)療器械生物學(xué)試驗(yàn)樣品制備的標(biāo)準(zhǔn)化及相應(yīng)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供了試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

含有0.1%二乙基二硫代氨基甲酸鋅（SPU-ZDEC）的聚氨酯薄膜，購(gòu)自Hatano Research Institute/Food and Drug Safty Center, Japan。

1.2 陰性對(duì)照

高密度聚乙烯，購(gòu)自Hatano Research Institute/Food and Drug Safety Center, Japan。

1.3 溶劑對(duì)照

不含試驗(yàn)材料的MEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 試劑與細(xì)胞

MEM培養(yǎng)基：賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司，批號(hào)：NWE0403。

胎牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司，批號(hào)：100517。

細(xì)胞：小鼠成纖維細(xì)胞系L929（購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）。

1.4.2 主要儀器

會(huì)上，常務(wù)副總經(jīng)理?xiàng)钊鹕?、副總?jīng)理劉江濤、馬朝輝分別就集團(tuán)公司2018年農(nóng)資經(jīng)營(yíng)、房地產(chǎn)項(xiàng)目開(kāi)發(fā)及資金運(yùn)作情況進(jìn)行了詳細(xì)介紹，對(duì)下一步工作進(jìn)行了認(rèn)真部署。

恒溫培養(yǎng)振蕩器3臺(tái)，規(guī)格型號(hào)：ZHWY-100B，上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司。

酶標(biāo)儀，規(guī)格型號(hào)：MK3，熱電（上海）儀器有限公司。

1.4.3 樣品浸提液的制備

放置于恒溫培養(yǎng)振蕩器中，振蕩頻率設(shè)置為60、90、120 rpm，溫度為（37±1）℃，時(shí)間為（24±2） h。第4份放置于37恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)（24±2） h。同時(shí)，陰性對(duì)照和溶劑對(duì)照以同樣方式處理。浸提結(jié)束后，用對(duì)照溶劑將試驗(yàn)樣品的浸提液分別稀釋成如下濃度梯度：2%、4%、6%、8%、10%，以進(jìn)行體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)[1-2]。

1.4.4 試驗(yàn)方法

按照ISO10993-5: 2009（GBT16886.12: 2003）醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)MTT法進(jìn)行試驗(yàn)[3-7]。

1.4.5 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)ISO10993-5: 2009（GBT16886.12: 2003）醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)8.5細(xì)胞毒性測(cè)定部分，利用試驗(yàn)樣品浸提液光密度平均值（OD570e）和溶劑對(duì)照組光密度平均值（OD570b），通過(guò)如下公式進(jìn)行結(jié)果分析：

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果都以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式展示。

2 結(jié)果

2.1 不同振蕩速度的ZDEC浸提液對(duì)細(xì)胞毒性試驗(yàn)的影響

將培養(yǎng)24 h的L929細(xì)胞，棄去培養(yǎng)上清，分別加入制備的樣品浸提液、陰性對(duì)照及溶劑對(duì)照，每組6復(fù)孔，100μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后更換新鮮含血清培養(yǎng)基，通過(guò)MTT摻入法檢測(cè)570 nm的吸光度（參照波長(zhǎng)650 nm）。與溶劑對(duì)照組相比，當(dāng)樣品制備的振蕩速度為0（即靜止浸提）時(shí)，隨著ZDEC浸提濃度的增加OD570/650數(shù)值改變不明顯，然而，經(jīng)過(guò)振蕩浸提后，隨著ZDEC浸提濃度的增加OD570/650數(shù)值顯著降低，說(shuō)明振蕩后的ZDEC浸提物能夠抑制L929細(xì)胞增殖，且這種增殖抑制作用具有濃度依賴性（表1）。同時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果顯示：樣品制備時(shí)，ZDEC浸提濃度為2%、4%、6%時(shí)，60 rpm相比于靜止浸提液的OD570/650數(shù)值無(wú)明顯差異，隨著浸提濃度的增加（8%和10%）60 rpm浸提液的OD570/650數(shù)值明顯降低，但是仍大于90 rpm和120 rpm的OD數(shù)值；90 rpm相較于120 rpm浸提也得到了類似60 rpm和靜止浸提的變化，即120 rpm浸提液（8%和10%）的OD570/650數(shù)值明顯降低，其它濃度差異不明顯。此外，相較于溶劑對(duì)照組，陰性對(duì)照組的OD數(shù)值無(wú)顯著改變。

2.2 不同振蕩速度的ZDEC浸提液進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)的IC50值分析

同時(shí)，分析不同振蕩速度的ZDEC浸提液對(duì)細(xì)胞存活率的影響（圖1），也可以得到與表1相一致的結(jié)果。靜止浸提后，改變ZDEC浸提濃度不會(huì)影響細(xì)胞存活率；然而振蕩浸提后，隨著ZDEC浸提濃度的增加細(xì)胞的存活率越低，浸提液對(duì)細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)越明顯。此外，在相同的ZDEC浸提濃度下，不同振蕩速率(60、90、120 rpm)對(duì)細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)不明顯。通過(guò)各組細(xì)胞存活率所得到的抑制率，根據(jù)文獻(xiàn)中推薦的方法來(lái)計(jì)算相應(yīng)的IC50值[8-10]，見(jiàn)圖2，也進(jìn)一步證實(shí)上述試驗(yàn)結(jié)果。

2.3 不同振蕩速度的ZDEC浸提液細(xì)胞毒性形態(tài)學(xué)分析

結(jié)合ISO 10993-5：2009 (GBT16886.12: 2003) 浸提液細(xì)胞毒性形態(tài)學(xué)定性分級(jí)，顯微鏡下顯示，浸提介質(zhì)對(duì)照組和陰性對(duì)照組的細(xì)胞形態(tài)良好，增殖明顯（圖3）。而試驗(yàn)樣品浸提組，相同ZDEC濃度下，隨著振蕩速度的提高，L929細(xì)胞明顯皺縮，增殖被抑制，細(xì)胞毒性級(jí)別明顯增大。

表1 不同振蕩速度的ZDEC浸提液進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)對(duì)細(xì)胞OD值的影響

結(jié)合ISO 10993-5：2009 最新修訂草案[3]中規(guī)定的浸提液細(xì)胞毒性形態(tài)學(xué)定性分級(jí)，顯微鏡下顯示，浸提介質(zhì)對(duì)照組(Cell-blank)和陰性對(duì)照組(Cell-NC)的細(xì)胞形態(tài)良好、增殖明顯，細(xì)胞毒性為0級(jí)（圖3）。而試驗(yàn)樣品組，靜止浸提時(shí)各組細(xì)胞生長(zhǎng)良好、增殖明顯，無(wú)毒性反應(yīng)（細(xì)胞毒性為0級(jí)）；同時(shí)，振蕩浸提組，濃度為2%和4%的細(xì)胞毒性亦為0級(jí)，60 rpm浸提時(shí)6%浸提液稀釋組＜20%的細(xì)胞圓縮死亡，顯示輕微毒性反應(yīng)(細(xì)胞毒性為1級(jí))，90 rpm和120 rpm浸提時(shí)6%浸提液稀釋組的死亡細(xì)胞明顯增多，胞漿內(nèi)顆粒增多(細(xì)胞毒性為2級(jí))，除此之外的60、90、120 rpm其余浸提液稀釋組(8%和10%)均顯示明顯的細(xì)胞皺縮、增殖抑制現(xiàn)象，顯示為重度毒性反應(yīng)，細(xì)胞毒性均為4級(jí)。

圖1 不同振蕩速度的ZDEC浸提液對(duì)細(xì)胞存活率的影響

圖2 不同振蕩速度的ZDEC浸提液進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)的IC50值分析

圖3 顯微鏡觀察ZDEC浸提液的細(xì)胞毒性

3 討論

在醫(yī)療器械生物學(xué)試驗(yàn)過(guò)程中，標(biāo)準(zhǔn)化的試驗(yàn)樣品制備是保證生物學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果具備可靠性和可比性的關(guān)鍵。在ISO10993-12:2007 (GBT16886.12: 2005) 中規(guī)定，浸提是模擬器械正常使用過(guò)程中通過(guò)評(píng)價(jià)可瀝濾材料對(duì)病人和使用者的一種模擬產(chǎn)品適用條件的處理方法。浸提是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，受時(shí)間、溫度、表面積與體積比、浸提介質(zhì)以及材料的相平衡的影響。人體在使用醫(yī)療器械以達(dá)到臨床診斷/治療的過(guò)程中，機(jī)體(或血液)的運(yùn)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致該器械在體內(nèi)的代謝及其毒性作用發(fā)生改變，因此，不能采用靜息浸提的方式來(lái)評(píng)價(jià)醫(yī)療器械的細(xì)胞毒作用。盡管，ISO10993-12:2007 (GBT16886.12: 2005) 中10.3.6規(guī)定樣品浸提應(yīng)在攪拌或環(huán)流的條件下進(jìn)行，但并未詳細(xì)規(guī)定動(dòng)態(tài)浸提的具體方法和參數(shù)（如轉(zhuǎn)速，旋轉(zhuǎn)方式等）。然而，對(duì)于醫(yī)療器械的檢測(cè)，統(tǒng)一的計(jì)量單位、標(biāo)準(zhǔn)化的測(cè)量或檢測(cè)方法是實(shí)現(xiàn)正確測(cè)量的必要條件。本文以ISO10993-12:2007 中推薦的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(SPU-ZDEC)為實(shí)驗(yàn)材料，以不同振蕩速率浸提該實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)檢測(cè)各浸提液的細(xì)胞毒性，分析水平振蕩浸提的振蕩速率對(duì)SPU-ZDEC的可瀝濾物及其細(xì)胞毒作用的影響，以探討樣品制備過(guò)程中的不同振蕩速率對(duì)評(píng)價(jià)醫(yī)療器械引起細(xì)胞毒性反應(yīng)的意義。

體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)廣泛適用于各種醫(yī)療器械和材料的評(píng)價(jià)，其目的是評(píng)價(jià)醫(yī)療器械引起細(xì)胞毒性反應(yīng)的潛在可能性，這種方法不僅可以快速、靈敏、有效地對(duì)供試品的體外細(xì)胞生物學(xué)行為作出判斷，而且還有助于對(duì)一種醫(yī)療器械是否有必要采用昂貴的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)作出科學(xué)的判定。本研究中選用國(guó)際通用的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(SPU-ZDEC)作為研究對(duì)象，通過(guò)不同振蕩速率浸提后，用MTT摻入法檢測(cè)各浸提液的細(xì)胞毒性。按照ISO10993-5: 2009 (GBT16886.12: 2003)，由于含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基既能支持細(xì)胞生長(zhǎng)，又能做為極性和非極性浸提介質(zhì)，故在本次研究中，我們選擇含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基作為浸提介質(zhì)。根據(jù)ISO10993-12:2007 (GBT16886.12: 2005)中的樣品制備原則，按0.1 g/mL浸提比例進(jìn)行制備，選擇適用于細(xì)胞毒性試驗(yàn)的（37±1）℃，（24±2）℃條件，于恒溫培養(yǎng)振蕩器中完成振蕩浸提。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，振蕩浸提能增加SPU-ZDEC的細(xì)胞毒性，60 rpm浸提時(shí)的細(xì)胞毒性明顯大于靜止浸提而小于90 rpm浸提，并且120 rpm浸提時(shí)的細(xì)胞毒性大于90 rpm浸提但增加毒性作用不明顯。這一結(jié)果提示，在進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)的樣品制備時(shí)，不僅要看試驗(yàn)樣品的材料、特性，與人體的接觸程度和接觸時(shí)間，樣品制備的時(shí)間和溫度，還要考慮樣品制備過(guò)程中振蕩速率這一重要因素。本文通過(guò)水平振蕩的方式觀察振蕩浸提對(duì)細(xì)胞毒性的影響，此外對(duì)于其它的環(huán)流或攪拌等動(dòng)態(tài)浸提方式而引起的細(xì)胞毒作用有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)解決。

IC50值是指細(xì)胞活性抑制50%時(shí)抑制劑的濃度，也有學(xué)者將其用于醫(yī)療器械細(xì)胞毒性試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)參照材料的選擇[11-13]。本研究中，我們通過(guò)細(xì)胞毒性試驗(yàn)中細(xì)胞存活率所得到的抑制率，計(jì)算了不同振蕩速度的SPU-ZDEC浸提液的IC50值，60 rpm浸提的IC50值為10.45%，90 rpm浸提的IC50值為7.47%，120 rpm浸提的IC50值為6.73%（圖2）。此外，通過(guò)顯微鏡下觀察不同振蕩速度浸提液的細(xì)胞毒性（圖3）。結(jié)果表明，定量分級(jí)評(píng)價(jià)與定性評(píng)價(jià)之間具有良好的相關(guān)性。然而，IC50值一般用于評(píng)價(jià)單一化合物的細(xì)胞毒性反應(yīng)，醫(yī)療器械浸提液多為混合物，因此需要對(duì)其適用性進(jìn)行驗(yàn)證[14-16]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，振蕩浸提有助于醫(yī)療器械和材料中潛在的毒性成分釋放發(fā)揮細(xì)胞毒作用，浸提過(guò)程中增加振蕩速率會(huì)增強(qiáng)材料的細(xì)胞毒作用，這一結(jié)果為今后標(biāo)準(zhǔn)制定中規(guī)定樣品制備的標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，有著重要的參考意義。

[1] ISO10993-12-2007,Biological evaluation of medical devices-Part 12: Sample preparation and reference materials[S].

[2] GB/T16886-12-2005,醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)-第12部分:樣品制備與參照樣品[S].

[3] ISO10993-5-2009.Biological evaluation of medical devices-Part 5:Tests for in vitro cytotoxicity[S].

[4] GB/T 16886-5-2003.醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)-第5部分:體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)[S].

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本文編輯 蘇欣

Preparation of Positive Control with Different Oscillation Rate in the Application of Medical Devices Biological Evaluation

SUN Xiao-xia, HUANG Jing-chun, WANG Luan-luan, WANG Xin, HOU Li
Key Lab of Biological Evaluation of Medical Devices of Shandong Province, Jinan Quality Supervision and Inspection Center for Medical Devices, State Food and Drug Administration, Jinan Shandong 250101, China

Standardization of test sample preparation is key to ensuring a reliable and comparable test results in biological evaluation of medical devices. In order to further clarify the effect of oscillation rate during soluble material extraction, we tested the positive standard material of SPU-ZDEC recommended by ISO10993-12: 2007 and detected the cytotoxicity of extract with different oscillation rate. Results showed that different sample oscillation rates have significant impacts on test results in biological tests of medical devices. This study provided a reliable experimental basis for the standardization of sample preparation, which is of great reference meaning.

SPU-ZDEC; cytotoxicity; oscillation rate; constant shaking incubator; microplate reader

R197.39

A

10.3969/j.issn.1674-1633.2017.02.002

1674-1633(2017)02-0005-04

2016-11-10

山東省自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（ZR2014CQ041）；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題（2016YFC1103202；2016YFC1103205）。

王瑾曄，教授。

通訊作者郵箱：jinyewang@sjtu.edu.cn