李小雯 鄭松柏 張曉莉 劉 菲

復(fù)旦大學附屬華東醫(yī)院消化科(200040)

比格犬胃底黏膜相關(guān)生物活性因子的增齡變化*

李小雯 鄭松柏#張曉莉 劉 菲

復(fù)旦大學附屬華東醫(yī)院消化科(200040)

背景：近年研究證實胃黏膜隨增齡更易受侵襲因素的損害，既往胃黏膜老化研究多以胃竇黏膜為主，鮮有提及胃底黏膜。目的：研究比格犬胃底黏膜相關(guān)生物活性因子的增齡變化。方法：將19只健康比格犬分為中青年組(1～5歲)、低齡老年組(6～8歲)和高齡老年組(≥9歲)，以TBA法測定胃底黏膜組織中MDA、LPO、MPO含量，ELISA法測定胃底黏膜組織中PTEN、TE、survivin、caspase-3、caspase-9、ZO-1、CGRP、VEGF、COX-1和COX-2含量。結(jié)果：與中青年組和低齡老年組相比，高齡老年組胃底黏膜MDA、LPO、MPO、PTEN、TE、ZO-1、CGRP、VEGF、COX-1和COX-2含量顯著升高(P<0.05)，caspase-3和caspase-9含量無明顯差異(P>0.05)。低齡老年組和高齡老年組胃底黏膜中survivin含量顯著低于中青年組(P=0.000)。結(jié)論：老年比格犬胃底黏膜相關(guān)生物活性因子含量存在不同程度的不利變化，但高齡老年組與調(diào)節(jié)黏膜下血流、黏膜再生和上皮間緊密連接等相關(guān)的生物活性因子反而升高，可能是一種“退化-代償”現(xiàn)象。

胃底； 衰老； 降鈣素基因相關(guān)肽； 環(huán)氧合酶1； 環(huán)氧合酶2

臨床和實驗研究表明，胃黏膜結(jié)構(gòu)和功能隨增齡出現(xiàn)異常，黏膜下血流(GMBF)減少、缺氧以及調(diào)節(jié)黏膜上皮凋亡的生物活性因子發(fā)生不利改變，導(dǎo)致胃黏膜更易受侵襲性因素的損害[1]。既往胃黏膜老化研究多以胃竇黏膜為研究對象，鮮有涉及胃底黏膜。此外，人在衰老過程中不可避免地受乙醇、藥物，尤其是幽門螺桿菌(Hp)感染等環(huán)境因素的影響。本研究以無Hp感染的國際標準實驗動物比格犬為研究對象，通過研究胃底黏膜相關(guān)生物活性因子的增齡改變，旨在探討胃底黏膜防御-修復(fù)機制隨增齡的變化。

材料與方法

一、實驗動物

19只國際標準實驗用比格犬于2003年起陸續(xù)飼養(yǎng)于中國科學院上海藥物研究所，犬齡1.33～10.58歲，每個月血常規(guī)、血生化、心電圖、腦電圖等檢查均在正常范圍內(nèi)。根據(jù)網(wǎng)站http://www.maxiebeagle.com/dogage.htm，將比格犬年齡換算成人類年齡，并分為中青年組(1～5歲，n=8)、低齡老年組(6～8歲，n=5)和高齡老年組(≥9歲，n=6)。

二、研究方法

1. 獲取標本：取標本前1天晚上8：00后禁食、禁水，次日上午9：00開始靜脈麻醉，剖腹，游離胃，沿胃大彎切開胃腔，距賁門6～8 cm處取胃底組織2塊(深達黏膜下層)，大小約1.0 cm×0.2 cm×0.2 cm，置于液氮-80 ℃保存。

2. TBA法：準確稱取組織重量，制備勻漿，離心，取上清液200 μL，根據(jù)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書，測定丙二醛(MDA)、脂質(zhì)過氧化物(LPO)、髓過氧化物酶(MPO)含量。

3. ELISA法：準確稱取組織重量，制備勻漿，離心，取上清液40 μL，參照ELISA測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書，測定比格犬胃底黏膜組織中磷酸酶張力蛋白同源物(PTEN)、端粒酶(TE)、生存素(survivin)、caspase-3、caspase-9、緊密連接蛋白ZO-1、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、環(huán)氧合酶(COX)-1和COX-2含量。

三、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、胃底黏膜MDA、LPO、MPO含量

三組MDA、LPO、MPO含量相比差異有統(tǒng)計學意義(F=7.090，P=0.006；F=3.689，P=0.048；F=6.114，P=0.011)；進一步比較發(fā)現(xiàn)，高齡老年組MDA、LPO、MPO含量顯著高于中青年組和低齡老年組(P<0.05)(表1)。

二、胃底黏膜PTEN、TE、survivin、caspase-3、caspase-9、ZO-1含量

三組PTEN、TE、survivin、ZO-1含量相比差異有統(tǒng)計學意義(F=4.777，P=0.024；F=5.147，P=0.019；F=15.437，P=0.000；F=5.365，P=0.016)；進一步比較發(fā)現(xiàn)，高齡老年組PTEN、TE、ZO-1含量顯著高于低齡老年組(P<0.05)，但與中青年組相比無明顯差異，低齡老年組和高齡老年組survivin含量顯著低于中青年組(P<0.05)。而三組caspase-3、caspase-9含量差異無統(tǒng)計學意義(F=3.065，P=0.750；F=1.123，P=0.349)(表2)。

三、胃底黏膜CGRP、VEGF、COX-1、COX-2含量

三組CGRP、VEGF、COX-1、COX-2含量相比差異有統(tǒng)計學意義(F=5.418，P=0.016；F=5.364，P=0.016；F=7.336，P=0.005；F=5.158，P=0.019)；進一步比較發(fā)現(xiàn)，高齡老年組CGRP和COX-1含量顯著高于中青年組和低齡老年組(P<0.05)，高齡老年組VEGF和COX-2顯著高于低齡老年組(P<0.05)，與中青年組無明顯差異(表1)。

討 論

胃底黏膜的第一層屏障是黏液-碳酸氫鹽-磷脂屏障，磷脂雙分子層的脂肪酸鏈面向胃腔，形成一道疏水性屏障，保護胃黏膜上皮細胞免受胃酸和胃蛋白酶等的損傷。MDA、LPO、MPO是與胃黏膜氧化應(yīng)激損傷和磷脂雙分子層脂質(zhì)過氧化有關(guān)的生物化學因子。本研究發(fā)現(xiàn)高齡老年組胃底黏膜MDA、LPO、MPO含量明顯高于低齡老年組和中青年組(P<0.05)，提示增齡可能增加胃黏膜脂質(zhì)過氧化，這可能與胃黏膜磷脂的疏水性隨增齡降低有關(guān)[2]。

胃底黏膜的第二層屏障是胃黏膜上皮與上皮細胞間的緊密連接。PTEN具有調(diào)節(jié)細胞增殖、生長、遷移、分化等多種效應(yīng)[3-5]；TE可延長染色體上的端粒，從而增強細胞增殖能力，與衰老關(guān)系密切[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，高齡老年組PTEN和TE顯著高于中青年組和低齡老年組(P<0.05)；低齡老年組和高齡老年組抗凋亡蛋白survivin含量顯著低于中青年組(P<0.05)。凋亡相關(guān)因子caspase-3和caspase-9分別參與細胞凋亡的執(zhí)行和起始，可間接反映細胞凋亡狀況。本研究發(fā)現(xiàn)兩者含量在三組中的差異無統(tǒng)計學意義。緊密連接是維持黏膜上皮機械屏障和通透性的重要結(jié)構(gòu)，ZO-1是重要的組成蛋白之一。有研究表明老年大鼠上皮組織中ZO-1含量明顯低于幼年大鼠，從而導(dǎo)致上皮屏障功能下降[7-8]。本研究顯示高齡老年組胃底黏膜ZO-1含量顯著高于中青年組和低齡老年組(P<0.05)。

表1 各組胃底黏膜MDA、LPO、MPO、CGRP、VEGF、COX-1和COX-2含量

表2 各組胃底黏膜PTEN、TE、survivin、caspase-3、caspase-9、ZO-1含量

胃黏膜的第三層屏障是GMBF，其減少是胃黏膜損傷發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，臨床研究發(fā)現(xiàn)單純GMBF降低即可引起胃潰瘍的發(fā)生，而增加GMBF可促進潰瘍愈合[9]。李雅君等[10]報道老年人賁門、胃體、胃角血流均顯著低于中青年人。機體內(nèi)多種生物活性因子參與調(diào)控GMBF。VEGF與黏膜細胞增殖、再生和GMBF密切相關(guān)[11-12]；CGRP是重要的血管擴張神經(jīng)肽，多項研究顯示老年大鼠胃黏膜防御功能降低與黏膜下血管周圍神經(jīng)纖維分泌的CGRP減少有關(guān)[13-14]；環(huán)氧合酶是花生四烯酸合成前列腺素(PGs)的限速酶，PGs可增加GMBF并通過增加VEGF表達起黏膜保護的作用[15]。本研究顯示，低齡老年組胃底黏膜CGRP、VEGF、COX-1和COX-2含量顯著低于中青年組，而高齡老年組顯著高于中青年組和低齡老年組。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，與細胞增殖、上皮間緊密連接、黏膜修復(fù)和GMBF相關(guān)的PTEN、TE、ZO-1、CGRP、VEGF、COX-1和COX-2在低齡老年組明顯降低，而高齡老年組明顯升高。這種現(xiàn)象未見相關(guān)文獻報道，我們暫且稱之為老化過程中的“退化-代償(degeneration-compensation)”現(xiàn)象，這種現(xiàn)象有利于老化過程中胃底黏膜內(nèi)重要功能腺體-胃底腺形態(tài)和功能的保護，再次驗證了本課題組的相關(guān)研究[16-18]結(jié)果；這種現(xiàn)象有利于維持老年人胃底黏膜的完整性，可能是胃底糜爛、潰瘍等病變較胃竇少見的原因之一。但發(fā)生這種“退化-代償”現(xiàn)象的內(nèi)在機制尚不清楚，有待進一步研究。

1 Tarnawski AS, Ahluwalia A, Jones MK. Angiogenesis in gastric mucosa: an important component of gastric erosion and ulcer healing and its impairment in aging[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2014, 29 Suppl 4: 112-123.

2 Hackelsberger A, Platzer U, Nilius M, et al. Age andHelicobacterpyloridecrease gastric mucosal surface hydrophobicity independently[J]. Gut, 1998, 43 (4): 465-469.

3 Tarnawski A, Pai R, Deng X, et al. Aging gastropathy-novel mechanisms: hypoxia, up-regulation of multi-functional phosphatase PTEN, and proapoptotic factors[J]. Gastroenterology, 2007, 133 (6): 1938-1947.

4 Zeng N, Yang KT, Bayan JA, et al. PTEN controls β-cell regeneration in aged mice by regulating cell cycle inhibitor p16ink4a[J]. Aging Cell, 2013, 12 (6): 1000-1011.

5 Zhu X, Qin X, Fei M, et al. Loss and reduced expression of PTEN correlate with advanced-stage gastric carcinoma[J]. Exp Ther Med, 2013, 5 (1): 57-64.

6 孔令平, 汪華僑. 端粒和端粒酶與衰老、癌癥的潛在關(guān)系——2009年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎簡介[J]. 自然雜志, 2009, 31 (6): 327-331, 封322.

7 Mooradian AD, Haas MJ, Chehade JM. Age-related changes in rat cerebral occludin and zonula occludens-1 (ZO-1) [J]. Mech Ageing Dev, 2003, 124 (2): 143-146.

8 吳克芬, 李希, 任衛(wèi)英, 等. 增齡對大鼠腸黏膜上皮屏障功能的影響[J]. 中華老年醫(yī)學雜志, 2013, 32 (9): 1006-1009.

9 Kawano S, Tsuji S. Role of mucosal blood flow: a conceptional review in gastric mucosal injury and protection[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2000, 15 Suppl: D1-D6.

10 李雅君, 陳堯, 鄧利群, 等. 幽門螺桿菌感染與年齡及胃黏膜血流關(guān)系的研究[J]. 北京醫(yī)學, 2002, 24 (1): 61.

11 Rivard A, Berthou-Soulie L, Principe N, et al. Age-dependent defect in vascular endothelial growth factor expression is associated with reduced hypoxia-inducible factor 1 activity[J]. J Biol Chem, 2000, 275 (38): 29643-29647.

12 Ahluwalia A, Jones MK, Deng X, et al. An imbalance between VEGF and endostatin underlies impaired angiogenesis in gastric mucosa of aging rats[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2013, 305 (4): G325-G332.

13 Kang JM, Kim N, Kim JH, et al. Effect of aging on gastric mucosal defense mechanisms: ROS, apoptosis, angiogenesis, and sensory neurons[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2010, 299 (5): G1147-G1153.

14 Gr?nbech JE, Lacy ER. Role of gastric blood flow in impaired defense and repair of aged rat stomachs[J]. Am J Physiol, 1995, 269 (5 Pt 1): G737-G744.

15 Takeuchi K, Kato S, Amagase K. Prostaglandin EP receptors involved in modulating gastrointestinal mucosal integrity[J]. J Pharmacol Sci, 2010, 114 (3): 248-261.

16 Zhang W, Zheng SB, Zhuang Y, et al. H+ /K+ ATPase expression in human parietal cells and gastric acid secretion in elderly individuals[J]. J Dig Dis, 2013, 14 (7): 366-372.

17 鄭松柏, 莊艷, 肖立, 等. 人體胃底腺組織學和壁細胞超微結(jié)構(gòu)的增齡變化研究[J]. 中華老年多器官疾病雜志, 2012, 11 (5): 324-328.

18 李小雯, 鄭松柏, 張曉莉, 等. 比格犬胃底腺組織學和超微結(jié)構(gòu)的增齡變化[J]. 胃腸病學, 2015, 20 (9): 528-532.

(2016-07-11收稿；2016-09-05修回)

Effect of Aging on Related Biological Activity Factors in Gastric Fundic Mucosa in Beagle Dogs

LIXiaowen,ZHENGSongbai,ZHANGXiaoli,LIUFei.

DepartmentofGastroenterology,HuadongHospital,FudanUniversity,Shanghai(200040)

ZHENG Songbai, Email: songbai1009@163.com

Gastric Fundus; Aging; Calcitonin Gene-Related Peptide; Cyclooxygenase 1; Cyclooxygenase 2

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.02.010

上海市科委科研計劃項目(12ZR1409600)

#本文通信作者，Email: songbai1009@163.com

Background: Recent studies showed that gastric mucosa was more susceptible to injury by invasion factors with aging, however, the studies were mainly on gastric antral mucosa,fundic mucosa was rarely studied. Aims: To investigate the effect of aging on related biological activity factors in gastric fundic mucosa in beagle dogs. Methods: Nineteen beagle dogs were assigned into younger group (aged 1-5 years), junior elderly group (aged 6-8 years) and senior elderly group (aged≥9 years). The contents of MDA, LPO, MPO in gastric fundic mucosa were determined by TBA method. The contents of PTEN, TE, survivin, caspase-3, caspase-9, ZO-1, CGRP, VEGF, COX-1 and COX-2 were assessed by ELISA. Results: Compared with younger group and junior elderly group, contents of MDA, LPO, MPO, PTEN, TE, ZO-1, CGRP, VEGF, COX-1 and COX-2 were significantly increased in senior elderly group (P<0.05), no significant differences in contents of caspase-3 and caspase-9 were found among the three groups (P>0.05). The content of survivin in junior elderly group and senior elderly group was significantly decreased when compared with younger group (P=0.000). Conclusions: Disadvantaging changes of biological activity factors are found in gastric fundic mucosa in elderly beagles dogs, however, gastric mucosal blood flow, mucosa regeneration and epithelial tight junction related biological activity factors are significantly increased in senior elderly beagle dogs, which may be a phenomenon of degeneration-compensation.