賈逸文 綜述 劉海峰 審校

共聚焦激光顯微內(nèi)鏡聯(lián)合熒光靶向探針診斷消化道腫瘤及癌前病變的研究進展

賈逸文 綜述 劉海峰 審校

激光共聚焦內(nèi)鏡；分子影像；腫瘤；消化道

消化系統(tǒng)腫瘤是世界范圍內(nèi)最常見的腫瘤病變，嚴(yán)重危害人類健康；提高早期腫瘤的診斷水平對于提高患者生存率、減輕社會經(jīng)濟負擔(dān)有著深遠的意義[1,2]。目前國際研究表明，內(nèi)鏡檢查是發(fā)現(xiàn)消化系統(tǒng)腫瘤的最有效途徑。然而，現(xiàn)有內(nèi)鏡技術(shù)存在檢出率低，漏診率高等諸多問題。為解決這些問題，分子影像學(xué)為我們提供了新的思路[3]。熒光分子成像技術(shù)(fluorescence molecular imaging，F(xiàn)LI)可以在細胞和分子水平對活體內(nèi)的生物過程進行研究，同時利用靶向探針與特定分子結(jié)合可實現(xiàn)實時、定量成像。隨著分子靶向探針技術(shù)的發(fā)展，它已被廣泛應(yīng)用于細胞學(xué)、分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等眾多領(lǐng)域[4-6]。該技術(shù)可與多種現(xiàn)代學(xué)科交叉，其應(yīng)用的范圍正在不斷拓展，而與共聚焦激光顯微內(nèi)鏡的聯(lián)合應(yīng)用引起了人們的關(guān)注。

1 熒光分子成像技術(shù)與共聚焦激光顯微內(nèi)鏡

熒光分子成像技術(shù)是近些年出現(xiàn)的新興分子影像技術(shù)。其成像原理是利用特異性的熒光分子探針標(biāo)記特定的分子或細胞，從而得到這些物質(zhì)的含量及分布情況，具有靈敏度高，特異度高，重復(fù)性好等優(yōu)勢，尤其適用于研究胃腸道的病理、生理分子機制[7]。

共聚焦激光顯微內(nèi)鏡(confocal laser endomicroscopy，CLE)作為一種新內(nèi)鏡成像方式，已被廣大內(nèi)鏡醫(yī)生所認同，使臨床醫(yī)生能夠在操作白光內(nèi)鏡的同時對胃腸道黏膜進行放大觀察，對淺表病灶進行鑒別診斷，其放大倍數(shù)可以達到1000倍[8]。CLE通過靜脈注射和表面噴灑非特異性的熒光對比劑進行熒光成像，實時觀察消化道黏膜上皮細胞、腺體及血管等顯微結(jié)構(gòu)[9,10]。目前可在臨床上使用的CLE設(shè)備有兩種類型：一種是將共聚焦探頭安裝在傳統(tǒng)白光內(nèi)鏡前端的整合式內(nèi)鏡(integrated confocal lasar endomicroscopy，iCLE)；另一種是將微探頭通過白光內(nèi)鏡的活檢孔道遞送的探頭式內(nèi)鏡(probe-based confocal lasar endomicroscopy，pCLE)[11,12]。CLE是把形態(tài)學(xué)和組織學(xué)相聯(lián)合的新型診斷工具，能清楚地顯示亞細胞結(jié)構(gòu)，以達到“光學(xué)活檢”的目的。但是由于常規(guī)使用的熒光染料如熒光素鈉、鹽酸吖啶黃、四環(huán)素、甲酚紫均為非特異性染料，這些染料用于對比劑，只能對組織進行大致的觀察發(fā)現(xiàn)問題，無法特異性地發(fā)現(xiàn)病變組織(如不典型增生，上皮內(nèi)瘤變或者惡性腫瘤等)進行有針對性的觀察。目前研究表明將熒光靶向探針和共聚焦激光顯微內(nèi)鏡技術(shù)相結(jié)合可以特異性地發(fā)現(xiàn)病變，并能對病灶進行實時免疫組化(immunohistochemistry，IHC)[13-15]，達到對可疑病變快速而準(zhǔn)確診斷的目的，對此國內(nèi)外已經(jīng)開展了相關(guān)研究。

2 對消化道疾病的診斷應(yīng)用

近年來，CLE將消化道病變的內(nèi)鏡診斷和病理組織學(xué)診斷有效地結(jié)合起來, 通過對比病灶和正常組織的圖像特征，進而診斷疾病，在將來有望取代耗時費力的傳統(tǒng)組織病理切片技術(shù)。

2.1 食管腫瘤及癌前病變 最新研究數(shù)據(jù)表明，近年來西方人群中食管腺癌 (EAC)的發(fā)病率顯著增加，且其預(yù)后不良，早期發(fā)現(xiàn)食管癌及癌前病變是改善預(yù)后的關(guān)鍵[16,17]。利用CLE聯(lián)合熒光靶向探針可以發(fā)現(xiàn)食管表面發(fā)生異型增生的黏膜。2013年Sturm等[18]應(yīng)用噬菌體表面展示肽庫技術(shù)，篩選出能與食管異性增生黏膜特異性結(jié)合的短肽ASYNYDA，在可疑病變表面噴灑FITC標(biāo)記短肽ASYNYDA ，對25個Barrett食管病人進行pCLE成像來檢測Barrett食管的異型增生，其敏感度和特異度分別能達到75%和97%。這是第一次證明了應(yīng)用熒光標(biāo)記的特異性短肽可以對人食管下端黏膜進行CLE成像，并可以在體診斷Barrett食管的異型增生，整個成像過程可在5 min內(nèi)完成，在日常臨床診療中具有較高可行性。

人類表皮生長因子受體2(HER2)廣泛參與人類腫瘤的惡性進程，其中也包括EAC。通過對HER2受體進行靶向熒光成像對發(fā)現(xiàn)食管癌有良好效果。2015年S. Realdon等[19]通過研究證明，在外科誘導(dǎo)食管癌小鼠體內(nèi)，食管癌組織中HER2信號的表達遠高于正常組織和Barrett食管組織。而后應(yīng)用AlexaFluor488標(biāo)記的抗HER2抗體，通過尾靜脈注射入4只經(jīng)外科誘導(dǎo)80周后的小鼠(其中3只病理證實為食管腺癌，1只為Barrett食管)體內(nèi)，并使用探頭式CLE(pCLE)進行成像。結(jié)果顯示其中3只食管腺癌小鼠HER2過度表達，而在小鼠的正常組織和Barrett食管組織中并沒有觀察到信號。實驗證實HER2過度表達是食管腺癌的特征性表現(xiàn)，應(yīng)用CLE可以對食管腺癌小動物模型進行在體診斷，并且通過量化熒光信號的方法，可以指導(dǎo)活檢，提高了常規(guī)病理活檢操作的特異性。

2.2 胃腫瘤 胃癌是世界第2大腫瘤死亡相關(guān)疾病，每年有超過100萬人被診斷為新發(fā)胃癌[20]。早期診斷并治療可以顯著提高胃癌病人的生存率。早期胃癌的發(fā)生發(fā)展往往伴隨著某些細胞受體或成分的表達異常。表皮生長因子受體(EGFR)是表皮生長因子(EGF)進行信號傳導(dǎo)的受體，與腫瘤細胞的增殖分化、血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移及細胞凋亡的抑制有關(guān)。研究表明在很多腫瘤組織中存在EGFR的高表達或表達異常。存活素(Survivin)是一種新近發(fā)現(xiàn)的分子量16.5 ku細胞內(nèi)蛋白,屬于抗細胞凋亡蛋白家族，可以廣泛的抑制細胞凋亡，并促進有絲分裂。通過對組織表面的EGFR和Survivin的觀察可以發(fā)現(xiàn)胃癌病變。2012年Nakai Y等[21]通過表面噴灑及黏膜注射兩種方式，將FITC標(biāo)記EGFR抗體及Survivin抗體注入正常豬食管和胃黏膜，并利用pCLE進行了靶向分子成像。研究表明通過CLE能夠觀察到豬的食管和胃黏膜存在EGFR和Survivin表達，結(jié)果由體外免疫組化所證實。在食管中EGFR和Survivin主要在局部角化的祖細胞中表達。而在胃中，EGFR主要在局部祖細胞區(qū)及上皮細胞表達，Survivin則表現(xiàn)出相似的結(jié)果，但在上皮細胞表達率更高。研究證明了通過FITC標(biāo)記EGFR抗體及Survivin抗體對正常食管和胃黏膜進行在體成像的可行性，同時也為更好地了解胃腸道的病理生理學(xué)提供了一項新的方法。

用熒光標(biāo)記的EGFR抗體探針檢測腫瘤組織，可篩選出EGFR過表達的患者，對這些患者進行靶向治療，可獲得較好療效。2012年，Hoetker MS等[22]利用FITC標(biāo)記EGFR抗體(診斷性探針)，使用Optiscan FIVE1系統(tǒng)對胃癌移植瘤小鼠模型進行共聚焦成像，觀察結(jié)果得出，瘤體表面的信號強度明顯高于周圍的結(jié)締組織(P=0.0145)。同時又應(yīng)用AlexaFluor488標(biāo)記的西妥昔單克隆抗體進行成像，得到相似的結(jié)果(P=0.047)。該研究初步探討了靶向治療藥物用于分子成像的可行性，為分子靶向藥物療效早期預(yù)測提供了理論依據(jù)及技術(shù)支持，實現(xiàn)了診斷與治療同時進行，并有望成為未來個體化治療的參考標(biāo)準(zhǔn)。2013年，Li Z等[23]使用AlexaFluor488標(biāo)記MG7抗體對23例人類胃癌標(biāo)本進行了共聚焦成像。胃癌相關(guān)特異性抗原MG7-Ag是一種國內(nèi)學(xué)者新發(fā)現(xiàn)的診斷標(biāo)志物，在胃癌組織中高表達，而在正常胃黏膜組織不表達[24]。利用MG7抗體對相關(guān)抗原進行檢測，可以特異性的發(fā)現(xiàn)胃癌細胞。實驗結(jié)果表明，該方法可以鑒別胃癌組織與正常黏膜(P<0.001)，協(xié)助提高胃癌檢出率，并且可以篩選出MG7抗體陽性患者作為靶向治療的敏感患者，提高治療反應(yīng)性。

2.3 結(jié)直腸腫瘤及癌前病變 結(jié)直腸癌(CRC)的發(fā)生發(fā)展是一個多步驟的過程，與基因的改變和環(huán)境因素相關(guān)。大部分的CRC可以通過檢查和切除息肉性病變來預(yù)防。盡管內(nèi)鏡技術(shù)已取得了較大提升，但結(jié)腸癌的發(fā)病率依然很高，原因主要是由于常規(guī)內(nèi)鏡檢查只能發(fā)現(xiàn)黏膜形態(tài)學(xué)上的改變，而缺乏分子特異性。如能對結(jié)直腸癌的癌前病變進行分子成像，可以在病變形態(tài)學(xué)改變之前發(fā)現(xiàn)病變，實現(xiàn)病變早期診斷的目的。2007年，Hsiung PL等[25]利用噬菌體表面展示肽庫技術(shù)，合成短肽VRPMPLQ作為靶向探針，并可以與人類結(jié)直腸腺癌細胞特異性結(jié)合。相對于抗體式的靶向探針，短肽探針具有抗原性低，無毒，結(jié)構(gòu)簡單，易于制備等多種優(yōu)勢。通過腸道表面噴灑共軛熒光素鈉標(biāo)記的短肽VRPMPLQ，對結(jié)直腸腺瘤26例進行了內(nèi)鏡檢查和pCLE成像，并對標(biāo)本進行病理學(xué)檢查。通過比較病變部位熒光強度及隱窩形態(tài)，檢出結(jié)直腸組織上皮內(nèi)瘤變的敏感性為81%，特異性為82%(α< 0.01)。實驗驗證了應(yīng)用短肽分子成像診斷腸道上皮內(nèi)瘤變的可行性，并評估腫瘤發(fā)展過程中的惡性程度，及檢測腫瘤進展中的生物標(biāo)記物水平，為診斷結(jié)直腸癌前病變提供了新思路。

利用CLE技術(shù)可以對結(jié)腸癌組織進行特異性成像，使在體診斷結(jié)腸癌成為可能。2009年，Goetz M等[26]將FITC標(biāo)記EGFR抗體分別注入高表達(SW480細胞系)和低表達(SW620細胞系)兩類人結(jié)腸癌荷瘤鼠模型體內(nèi)，采用Optiscan FIVE1共聚焦成像系統(tǒng)對腫瘤組織進行成像，首次實現(xiàn)了結(jié)直腸癌的在體分子成像，證實了CLE可以實時區(qū)別不同移植瘤細胞的EGFR表達差異。之后又選取8例患者的上皮內(nèi)瘤變組織及非瘤變組織，以FITC標(biāo)記EGFR抗體進行表面噴灑。CLE成像結(jié)果顯示正常人類腸道黏膜和上皮內(nèi)瘤變標(biāo)本的平均熒光強度分別為0.25+/-0.16和2.12 +/-0.30，(P<0.002)，實驗結(jié)果之間存在明顯差異，為將來人類在體分子成像提供了理論支持。2013年，Liu J等[27]對37例結(jié)直腸腫瘤病人進行在體研究，對病變表面噴灑AlexaFluor488標(biāo)記EGFR抗體，使用eCLE進行觀察。其中在19例結(jié)直腸癌中有18例表現(xiàn)出特異性的熒光信號(94.7%)，18例結(jié)直腸腺瘤中有12例表現(xiàn)出特異性的熒光信號(66.7%)。而以上病人的正常組織均未觀察到或只觀察到極微量的特異性的熒光信號。所有觀察部位均由體外免疫組化和病理所證實。實驗表明體外結(jié)直腸癌組織免疫組化結(jié)果和體內(nèi)EGFR分子成像結(jié)果具有良好的一致性，證明了人體在體CLE分子成像的可行性。

腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移離不開新生血管的形成。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是胃腸道腫瘤靶向治療的靶點，在正常組織和腫瘤組織的血管生成中扮演重要角色。 CLE聯(lián)合熒光靶向探針可以觀察到VEGF受體在細胞膜上的分布。2010年Foersch S等[28]利用AlexaFluor488標(biāo)記的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，對人結(jié)腸癌荷瘤鼠模型進行了CLE在體成像，同時又對結(jié)腸癌患者的腫瘤標(biāo)本進行體外CLE成像。并將結(jié)果和病理，免疫組化及熒光顯微鏡結(jié)果進行比較。通過定量分析的方式分析圖像結(jié)果，證明了應(yīng)用此技術(shù)可以鑒別上皮內(nèi)瘤變與正常黏膜(P<0.05)。研究表明CLE結(jié)合熒光靶向探針進行成像是一種有效區(qū)分腫瘤性和非腫瘤性病變的成像方式，可以早期發(fā)現(xiàn)腫瘤組織。研究發(fā)現(xiàn)運用治療性靶向探針，可以篩選出藥物敏感性高療效好的患者，以實施個性化診療，將對結(jié)直腸癌及其癌前病變的診斷、治療及預(yù)后評估具有重要意義。

綜上所述，將熒光靶向探針和共聚焦激光顯微內(nèi)鏡相結(jié)合，可對消化道腫瘤及癌前病變進行診斷，其與傳統(tǒng)內(nèi)鏡相比，具有高特異性，高準(zhǔn)確性，操作簡單的優(yōu)勢，可早期診斷消化道腫瘤及癌前病變。同時運用靶向藥物作為探針，可以實現(xiàn)個體化治療，并預(yù)測治療的反應(yīng)性及對靶向治療的效果，從而提高患者的遠期生存率。然而，成像深度及表面噴灑穿透力有限，尚缺乏可供患者靜脈應(yīng)用的安全、無毒熒光標(biāo)記分子探針等問題仍是目前急需解決重點。同時熒光信號強度判斷標(biāo)準(zhǔn)尚需進一步統(tǒng)一和完善，對于采取半定量或者定量分析，業(yè)界還存在爭議。但從目前的研究來看，這項技術(shù)仍體現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。未來隨著技術(shù)的進步，分子影像學(xué)也必然會成為醫(yī)生的得力助手，在日后的臨床診療中發(fā)揮出巨大優(yōu)勢。

[1] Selby J V, Friedman G D, Jr Q C,etal. A case-control study of screening sigmoidoscopy and mortality from colorectal cancer[J]. New England Journal of Medicine, 1992, 326(10):653-657.

[2] Levin B, Lieberman D A, McFarland B,etal. Screening and surveillance for the early detection of colorectal cancer and adenomatous polyps, 2008: a joint guideline from the American Cancer Society, the US Multi-Society Task Force on Colorectal Cancer, and the American College of Radiology[J]. Gastroenterology, 2008,134(11):1570-1595.

[3] Joshi B P, Wang T D. Gastrointestinal imaging in 2015: Emerging trends in endoscopic imaging[J]. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology, 2016, 13(2):72-73.

[4] Xie X S. Enzyme kinetics, past and present[J]. Science , 2013, 342(6165):1457-1459.

[5] Bourzac K. Medical imaging: Removing the blindfold[J]. Nature, 2013, 504(7480):10-12.

[6] Nguyen Q T, Tsien R Y. Fluorescence-guided surgery with live molecular navigation[mdash]a new cutting edge[J]. Nature Reviews Cancer, 2013, 13(9):653-662.

[7] Goetz M, Kiesslich R. Advances of endomicroscopy for gastrointestinal physiology and diseases.[J]. Ajp Gastrointestinal & Liver Physiology, 2010, 298(6):797-806.

[8] Karstensen J G, Klausen P H, Saftoiu A,etal. Molecular confocal laser endomicroscopy: a novel technique for in vivo cellular characterization of gastrointestinal lesions.[J]. World Journal of Gastroenterology, 2014, 20(24):7794-7800.

[9] L K Wanders, J E East, S E Uitentuis. Diagnostic performance of narrowed spectrum endoscopy, autofluorescence imaging, and confocal laser endomicroscopy for optical diagnosis of colonic polyps: a meta-analysis[J]. Lancet Oncology, 2013, 14(13):1337-1347.

[10] Neumann H, Kiesslich R. Endomicroscopy and Endocytoscopy in IBD[J]. Gastrointestinal Endoscopy Clinics of North America, 2013, 23(3):695-705.

[11] Neumann H, Kiesslich R, Wallace M B,etal. Confocal Laser Endomicroscopy: Technical Advances and Clinical Applications[J]. Gastroenterology, 2010, 139(2):388-392.

[12] Goetz M, Watson A, Kiesslich R. Confocal laser endomicroscopy in gastrointestinal diseases[J]. Journal of Biophotonics, 2011, 4(7-8):498-508.

[13] Goetz M, Kiesslich R. Confocal endomicroscopy: in vivo diagnosis of neoplastic lesions of the gastrointestinal tract.[J]. Anticancer Research, 2008, 28(1B):353-360.

[14] Goetz M, Ziebart A, Foersch S. In vivo molecular imaging of colorectal cancer with confocal endomicroscopy by targeting epidermal growth factor receptor[J]. Gastroenterology, 2009, 138(2):435-446.

[15] Hsiung P L, Hsiung P L, Hardy J,etal. Detection of colonic dysplasia in vivo using a targeted heptapeptide and confocal microendoscopy[J]. Nature Medicine, 2008, 14(4):454-458.

[16] Spechler S J. Clinical practice. Barrett’s Esophagus[J]. New England Journal of Medicine, 2002, 346(11):836-842.

[17] Wild C P, Hardie L J. Reflux, Barrett’s oesophagus and adenocarcinoma: burning questions[J]. Nature Reviews Cancer, 2003, 3(9):676-684.

[18] Sturm M B, Cyrus P, B Joseph E,etal. In vivo molecular imaging of Barrett’s esophagus with confocal laser endomicroscopy[J]. Gastroenterology, 2013, 145(1):56-58.

[19] Realdon S, Dassie E, Fassan M,etal. In vivo molecular imaging of HER2 expression in a rat model of Barrett’s esophagus adenocarcinoma[J]. Diseases of the Esophagus, 2014, 28(4):394-403.

[20] Jemal F. Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2011, 61(1):33-64.

[21] Nakai Y, Shinoura S, Ahluwalia A,etal. Molecular imaging of epidermal growth factor-receptor and survivin in vivo in porcine esophageal and gastric mucosae using probe-based confocal laser-induced endomicroscopy: proof of concept[J]. Journal of Physiology & Pharmacology, 2012, 63(3):303-307.

[22] Hoetker M S, Kiesslich R, Diken M,etal. Molecular in vivo imaging of gastric cancer in a human-murine xenograft model: targeting epidermal growth factor receptor[J]. Gastrointestinal Endoscopy, 2012, 76(3):612-620.

[23] Li Z, Zuo X L, Li C Q,etal. In vivo molecular imaging of gastric cancer by targeting MG7 antigen with confocal laser endomicroscopy[J]. Endoscopy, 2013, 45(2):79-85.

[24] Whiting P F, Rutjes A W S, Westwood M E,etal. QUADAS-2: A Revised Tool for the Quality Assessment of Diagnostic Accuracy Studies[J]. Annals of Internal Medicine, 2011, 155(8):529-536.

[25] Hsiung P L, Hardy J, Friedland S,etal. Detection of colonic dysplasia in vivo using a targeted heptapeptide and confocal microendoscopy[J]. Nature Medicine, 2008, 14(4):454-458.

[26] Martin G. In vivo molecular imaging of colorectal cancer with confocal endomicroscopy by targeting epidermal growth factor receptor[J]. Gastroenterology, 2010, 138(2):435-446.

[27] Jun L, Xiuli Z, Changqing L,etal. In vivo molecular imaging of epidermal growth factor receptor in patients with colorectal neoplasia using confocal laser endomicroscopy[J]. Cancer Letters, 2013, 330(2):200-207.

[28] Foersch S, Kiesslich R, Waldner M J,etal. Molecular imaging of VEGF in gastrointestinal cancer in vivo using confocal laser endomicroscopy[J]. Gut, 2010, 59(8):1046-1055.

(2016--收稿 2016--修回)

(責(zé)任編輯 梁秋野)

首都臨床特色應(yīng)用研究(2141109002514099)

賈逸文，碩士研究生。

100039 北京，武警總醫(yī)院消化內(nèi)科

劉海峰，E-mail:haifengliu333@163.com

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