高速逆流色譜分離純化番瀉葉中的苷類化合物

段文娟, 吳秋霞,, 李月,楊國紅, 時新剛, 孫衛(wèi)紅, 王曉*

(1.山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點實驗室，山東省分析測試中心，山東 濟南 250014；2. 江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

【中藥與天然活性產(chǎn)物】

高速逆流色譜分離純化番瀉葉中的苷類化合物

段文娟1, 吳秋霞1,2, 李月1,楊國紅1, 時新剛1, 孫衛(wèi)紅2, 王曉1*

(1.山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點實驗室，山東省分析測試中心，山東 濟南 250014；2. 江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

采用高速逆流色譜法從中藥番瀉葉中快速分離得到4個苷類化合物，溶劑體系為正丁醇-水(9:10，V/V)，流速2.0 mL/min，檢測波長280 nm，轉(zhuǎn)速860 r/min。從200 mg番瀉葉正丁醇萃取物中分離得到10 mg芹菜素-6, 8-二-C-葡萄糖苷、9 mg山奈酚-3-O-β-D-龍膽二糖苷、15 mg異鼠李素-3-O-β-D-龍膽二糖苷和5 mg番瀉苷B，純度分別為97.6%、98.9%、98.3%和99.3%。該方法穩(wěn)定、高效，適合番瀉葉中苷類化合物的分離純化。

番瀉葉；高速逆流色譜；苷類化合物；分離純化

《中華人民共和國藥典》2015年版一部中記載番瀉葉為豆科植物狹葉番瀉CassiaangustifoliaVahll或尖葉番瀉CassiaacutifoliaDelile的“干燥小葉”[1]。番瀉葉主要產(chǎn)于印度、埃及等地，我國所使用的番瀉葉基本是從這些國家進口的，目前我國云南、廣西等地也有引種栽培。番瀉葉性味甘、苦、寒，其功能主要是瀉熱行滯、通便利水，用于熱結(jié)積滯、便秘腹痛、水腫脹滿。番瀉葉是最早用作瀉藥和減肥藥的植物之一?，F(xiàn)代藥理研究表明，番瀉葉具有抗菌[2-4]、止血、消炎[5]、解痙[6]的作用。番瀉葉化學(xué)成分的研究多采用傳統(tǒng)硅膠柱色譜、大孔吸附樹脂、高效制備液相[7-9]等，這些方法分離時間長，不但造成了試劑的浪費，而且由于分離過程中的死吸附導(dǎo)致樣品大量損失。本研究采用高速逆流色譜技術(shù)(HSCCC)對番瀉葉中的苷類成分進行分離純化，解決了常規(guī)柱色譜分離過程中的死吸附和環(huán)境不友好等問題，從番瀉葉的正丁醇萃取物中，一次分離得到芹菜素-6, 8-二-C-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-β-D-龍膽二糖苷、異鼠李素-3-O-β-D-龍膽二糖苷和番瀉苷B等4個化合物。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

KQ3200型超聲波清洗器(昆山超聲儀器公司)；BUCHI旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI)；TBE-300A高速逆流色譜儀(上海同田生物技術(shù)有限公司)；TBP5002 泵(上海同田生物技術(shù)有限公司)；3057-11記錄儀(重慶川儀總長有限公司)；8823B 紫外檢測器(北京賓達英創(chuàng)科技有限公司)；Waters 600-996高效液相色譜系統(tǒng)(配有光電二極管陣列檢測器(PDA)，美國Waters公司)；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)。

實驗用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇等均為分析純；高效液相色譜用甲醇為色譜純(美國天地公司)，水為娃哈哈純凈水。

番瀉葉藥材購于山東省濟南市漱玉平民大藥房，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)李佳教授鑒定為豆科植物狹葉番瀉的干燥小葉。

番瀉苷B購自成都曼斯特生物科技有限公司， HPLC檢測純度大于等于98%。

1.2 粗提物的制備

稱取番瀉葉1.0 kg，粉碎機粉碎，無需過篩，倒入5 L的圓底燒瓶中，加入10倍量50%乙醇，加熱回流提取2次，每次1 h，合并提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至無醇味。然后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，減壓回收溶劑，得正丁醇萃取物50 g，用于進一步分離純化。

1.3 分配系數(shù)KD的測定

取少量樣品置于1.5 mL試管中，加入等量的上下相各0.5 mL，劇烈震蕩0.5 min，使樣品充分溶解，靜置分層，取上下相各0.5 μL分別用高效液相色譜(HPLC)進行檢測，上相峰面積為A1，下相峰面積為A2，分配系數(shù)KD=A1A2。

1.3 兩相溶劑體系及樣品溶液的制備

本實驗中HSCCC所用的溶劑體系為正丁醇-水(9:10，V/V)，按比例將這兩種溶劑分別置于2 L的分液漏斗中，振蕩充分混合后，于室溫靜置分層。分別取上相作為固定相，下相作為流動相，使用前超聲脫氣10 min除去氣泡待用。

稱取番瀉葉正丁醇萃取物200 mg，加入上述溶劑系統(tǒng)的上下相各5 mL，超聲攪拌使樣品完全溶解。

1.4 高速逆流色譜分離

將已超聲脫氣的上相以20 mL/min的流速泵入螺旋管中直至有上相流出，以保證固定相充滿整個分離螺旋管，然后打開主機，使色譜儀螺旋管柱按順時針的方向旋轉(zhuǎn)，當(dāng)轉(zhuǎn)速達到860 r/min并穩(wěn)定后，以1.8 mL/min的流速將下相泵入分離螺旋管中，待有下相流出時(即螺旋管中的上下相達到平衡時)，將樣品溶液注入進樣圈中，打開紫外檢測儀和記錄儀，檢測波長設(shè)置為280 nm，手動收集餾分。

1.5 HPLC分析和結(jié)構(gòu)鑒定

番瀉葉正丁醇萃取物和HSCCC分離得到的餾分均用HPLC進行分析。分析條件為色譜柱：Intersil ODS-SP(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)和水(B)梯度洗脫：20%～25% A(0～10 min)，25% A(10～20 min)，25%～100% (20～21 min)A，100%A(21～30 min)；流速1.0 mL/min；檢測波長340 nm；柱溫為室溫；進樣量10 μL。HSCCC分離后各組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)通過ESI-MS和NMR進行鑒定。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC條件的優(yōu)化

本實驗考察了乙腈-水、乙腈-0.1%醋酸水、甲醇-水、甲醇-0.1%醋酸水作為流動相時對番瀉葉正丁醇萃取物中各組分的分離效果。結(jié)果顯示當(dāng)采用乙腈-0.1%醋酸水系進行梯度洗脫時，番瀉葉正丁醇萃取物中的成分可以實現(xiàn)較好的分離，結(jié)果見圖1。

a 正丁醇粗樣; b 芹菜素-6,8-二-C-葡萄糖苷; c 山奈酚-3-O-β-D-龍膽二糖苷；d 異鼠李素-3-O-β-D-龍膽二糖苷； e 番瀉苷B。圖1 番瀉葉正丁醇萃取物和分離得到苷類化合物 的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of n-butyl alcohol extracts and separated glycosidic compounds

2.2 HSCCC溶劑體系的優(yōu)化

選擇合適的溶劑體系是高速逆流色譜分離純化成功的關(guān)鍵，可以通過測定目標(biāo)化合物在兩相溶劑中的分配系數(shù)(KD)來選擇合適的溶劑體系，一般而言，比較合適的KD值范圍是0.5～2.0[10]。本實驗首先選用的是乙酸乙酯-甲醇-水體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不論如何調(diào)節(jié)體系比例，目標(biāo)化合物都集中在下相，KD<0.5，無法實現(xiàn)目標(biāo)化合物的分離。嘗試氯仿-甲醇-水體系、乙酸乙酯-正丁醇-甲醇-水體系，結(jié)果顯示目標(biāo)化合物均偏水相，KD<0.5，各組分很快被洗脫出來，難以實現(xiàn)分離。采用極性最大的溶劑體系正丁醇-水體系，調(diào)節(jié)體積比為9:10，目標(biāo)化合物的KD值基本符合要求，該體系中各物質(zhì)的KD值如表1。因此，本實驗采用正丁醇-水(9:10)作為高速逆流色譜的溶劑體系，從200 mg番瀉葉正丁醇萃取物中一次性分離得到10 mg芹菜素-6, 8-二-C-葡萄糖苷、9 mg山奈酚-3-O-β-D-龍膽二糖苷、15 mg異鼠李素-3-O-β-D-龍膽二糖苷和5 mg番瀉苷B(化合物結(jié)構(gòu)式見圖2，高速逆流色譜分離圖見圖3)，采用HPLC分析純度，分別為97.6%、98.9%、98.3%、99.3%，結(jié)果如圖3所示。

表1 目標(biāo)化合物在溶劑體系中的KD值

圖2 番瀉葉中苷類化合物的結(jié)構(gòu)式Fig.2 Chemical structures of glycosidic compounds from Folium Sennae

圖3 番瀉葉正丁醇萃取物的高速逆流色譜圖Fig.3 HSCCC chromatogram of n-butyl alcohol extracts from Folium Sennae

2.3 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色結(jié)晶，UVmax(MeOH)nm：217, 272, 340；ESI-MS,m/z: 595.3 [M-H]-；1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 6.82 (1H, s, H-3), 8.02 (2H,d,J=8.4 Hz, H-2′, H-6′), 6.88 (2H, d,J=8.8 Hz, H-3′, H-5′), 5.05 (1H, d,J=6.0 Hz, H-1″), 4.62 (1H, d,J=6.0 Hz, H-1?), 9.36 (1H, s, 4′-OH), 10.38 (1H, s, 7-OH), 13.72 (1H, s, 5-OH)。以上數(shù)據(jù)與文獻[11]報道基本一致，該化合物鑒定為芹菜素-6-8-二-C-葡萄糖苷。

化合物2：黃色粉末，UVmax(MeOH)nm：258, 270, 360；ESI-MS,m/z: 609.1 [M-H]-；1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 6.16 (1H, brs, H-6), 6.37 (1H, brs, H-8), 8.02 (2H, d,J=8.0 Hz, H-2′, H-6′), 6.90 (2H, d,J=8.0 Hz, H-3′, H-5′), 5.04 (1H, d,J=6.8 Hz, H-1″), 4.04 (1H, d,J=7.6 Hz, H-1?)。以上數(shù)據(jù)與文獻[12]報道基本一致，該化合物鑒定為山奈酚-3-O-β-D-龍膽二糖苷。

化合物3：黃色結(jié)晶，UVmax(MeOH)nm：270, 355；ESI-MS,m/z: 639.2 [M-H]-；1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 7.93 (2H, brs, H-2′, H-5′), 7.49 (1H, d,J=2.4 Hz, H-6′), 6.90 (1H，d，J=8.4 Hz, H-5′), 6.41 (1H，brs，H-8), 6.19 (1H，brs，H-6)，5.52 (1H, d,J=6.8 Hz, H-1?), 5.04 (1H, d,J=5.6 Hz, H-1″),9.82 (1H, s, 4′-OH), 10.80 (1H, s, 7-OH), 12.56 (1H, s, 5-OH)。以上數(shù)據(jù)與文獻[11]報道數(shù)據(jù)基本一致，因此，該化合物鑒定為異鼠李素-3-O-β-D-龍膽二糖苷。

化合物4：黃色粉末，UVmax(MeOH)nm：255, 270, 360；ESI-MS,m/z: 861.2 [M-H]-該化合物與番瀉苷B對照品的TLC和HPLC檢測對照一致，鑒定此化合物為番瀉苷B。

3 結(jié)論

本研究首次采用高速逆流色譜技術(shù)對番瀉葉正丁醇萃取物進行分離純化，一次分離得到4個純度大于97%的苷類化合物。研究結(jié)果表明，高速逆流色譜分離技術(shù)能簡便、快速、高效地分離純化番瀉葉中的化學(xué)成分，為番瀉葉的進一步開發(fā)利用提供技術(shù)支撐。

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Separation and purification of glycosidic compounds from Folium Sennae by high-speed counter-current chromatography

Duan Wen-juan1, WU Qiu-xia1, 2, Li Yue1, Yang Guo-hong1,SHI Xin-gang1, Sun Wei-hong2, WANG Xiao1*

(1.Shandong Provincial Key Laboratory for TCM Quality Control Technology, Shandong Analysis and test Center, Jinan 250014,China; 2. School of Food and Biology Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

∶Four glycosidic compounds were rapidly separated from then-butyl alcohol of Folium Sennae by high-speed countercurrent chromatography with the solvent system ofn-butanol-water (9:10,V/V). The flow rate is 2.0 mL/min, the detection wavelength is 280 nm, and the rotate speed rating is 860 r/min. Separated from then-butyl alcohol extracts (200 mg) of Folium Sennae, their structures were identified as apigenin-6, 8-di-C-glycoside (10 mg), kaempferol-3-O-β-Dgentiobioside (9 mg), isorhamnetin-3-O-β-Dgentiobioside (15 mg), and sennoside B (5 mg) with the purities were respectively 97.6%, 98.9%, 98.3%, and 99.3%. The results show that this method is simple and efficient, which is suitable for the separation and purification of glycosidic compounds from Folium Sennae.

∶Folium Sennae; high-speed counter-current chromatography; glycosidic compounds; separation and purification

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.01.003

2016-11-02

三院聯(lián)合基金(ZR2016YL006)；山東省科學(xué)院先導(dǎo)項目；山東省泰山學(xué)者崗位

段文娟(1981—)，女，副研究員，研究方向為天然產(chǎn)物研究與開發(fā)。E-mail: duanwj4048@126.com

*通信作者,王曉(1971—)，男，博士，研究員，研究方向為天然產(chǎn)物研究與開發(fā)。 E-mail: wxjn1998@126.com

R284.2

A

1002-4026(2017)02-0015-05