羅昊翔，顧隆，賀禮紅，姜文敏，李佳佳(黔西南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)藥系，貴州興義562400)

轉(zhuǎn)染HBV Creg DNA的小鼠肝細(xì)胞表面干性分子表達(dá)觀察

羅昊翔，顧隆，賀禮紅，姜文敏，李佳佳
(黔西南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)藥系，貴州興義562400)

目的 觀察轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HBV Creg DNA質(zhì)粒的小鼠肝細(xì)胞表面干性分子CD44、CD90、CD133的表達(dá)變化。方法 從含有pcDNA3.1-HBV Creg DNA質(zhì)粒的Ecoli DH5α菌株中提取pcDNA3.1-HBV Creg DNA質(zhì)粒。取SPF級正常小鼠的肝細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，加入50 μL pcDNA3.1-HBV Creg DNA混合轉(zhuǎn)染細(xì)胞。采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測轉(zhuǎn)染前后小鼠肝細(xì)胞表面干性分子CD44、CD90、CD133表達(dá)。結(jié)果 轉(zhuǎn)染前，部分小鼠肝細(xì)胞CD90、CD133呈陽性，且陽性染色細(xì)胞都是圓形。未見有CD44陽性染色細(xì)胞。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HBV Creg DNA后，小鼠肝細(xì)胞表面干性分子CD44、CD90、CD133呈陽性染色。結(jié)論 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HBV Creg DNA質(zhì)粒的小鼠肝細(xì)胞表達(dá)CD44、CD90、CD133。HBV Creg DNA可能影響小鼠肝細(xì)胞表面干性分子CD44的表達(dá)。

肝癌；肝腫瘤；乙肝相關(guān)性肝癌；干細(xì)胞；干性分子

HBV Creg DNA(nt1087-nt2488)是存在于乙型肝炎病毒(HBV)基因組中一段DNA片段，包括HBV的核心基因、兩個增強(qiáng)子(Enh Ⅰ和EnhⅡ)、完整的X蛋白的啟動子、核心啟動子、反式調(diào)控序列(X蛋白編碼區(qū))、信號肽序列(前C編碼區(qū))，即包含了HBV核心基因及其上游的調(diào)控序列和包裝信號區(qū)(1853nt-1982nt)、順向重復(fù)序列1(DR Ⅰ)、順向重復(fù)序列2(DR Ⅱ)及其間的黏性末端區(qū)(1592nt-1836nt)。目前，腫瘤干細(xì)胞的研究領(lǐng)域尚存在較多爭議。Reya等[1]提出了腫瘤干細(xì)胞假說。也有研究認(rèn)為，腫瘤是由于干細(xì)胞發(fā)育異常導(dǎo)致的。目前，臨床尚無公認(rèn)的篩選腫瘤干細(xì)胞的特異性標(biāo)記分子。CD90、CD133和CD44是最常見的肝癌干細(xì)胞標(biāo)記分子，既往研究發(fā)現(xiàn)其在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)[2]，但CD90、CD133和CD44不是特異性的肝癌干細(xì)胞標(biāo)記分子，正常組織和腫瘤組織中均可見其表達(dá)。乙肝相關(guān)性肝癌是我國常見的肝癌類型，HBV DNA可調(diào)節(jié)肝細(xì)胞基因的表達(dá)。但HBV是否會導(dǎo)致肝細(xì)胞表面干性分子的表達(dá)變化呢？我們觀察了觀察轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HBV Creg DNA質(zhì)粒的小鼠肝細(xì)胞表面干性分子CD44、CD90、CD133的表達(dá)變化，旨在為乙肝相關(guān)性肝癌的分子靶向治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑及儀器 2～3周齡SPF級正常小鼠1只，采用國標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物干飼料喂養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食。RPMI1640(Invitrogen Corporation)，小牛血清(杭州四季青公司)，CD44抗體一抗、CD90抗體一抗、CD133抗體一抗、免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，胰蛋白酶(Biosharp)，質(zhì)粒提取試劑盒(AXYGEN)，LipofectamineTM2000(Invitrogen Corporation)，菌株Ecoli DH5α(Fermentas)，瓊脂，胰蛋白胨，酵母提取物。

1.2 pcDNA3.1-HBV Creg DNA質(zhì)粒提取 將含有pcDNA3.1-HBV Creg DNA質(zhì)粒的Ecoli DH5α菌株接種于含100 μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃電熱培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，取出試管，按AXKGEN質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒。

1.3 小鼠肝細(xì)胞分離、培養(yǎng)與 pcDNA3.1-HBV Creg DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法 取SPF級正常小鼠1只，頸椎脫臼處死，取出肝臟，使用解剖剪將小鼠肝臟充分剪碎，使小鼠肝細(xì)胞脫落，形成肝細(xì)胞懸液。吸取肝細(xì)胞懸液，加入25 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)的小鼠肝細(xì)胞在低倍鏡下觀察，細(xì)胞形態(tài)多種多樣，大部分細(xì)胞呈圓形、橢圓形，少數(shù)細(xì)胞呈梭形。細(xì)胞顏色深淺不一。細(xì)胞越幼稚，細(xì)胞越小，顏色越淺。待細(xì)胞貼壁后，棄上清，加入適量0.01 mmol/L PBS沖洗2～3次，直至倒置顯微鏡下觀察無懸浮細(xì)胞，將50 μL pcDNA3.1-HBV Creg DNA溶于500 μL無血清RPMI1640中，混勻，加入10 μL LipofectamineTM2000，混勻，室溫放置25 min，將混合物加入培養(yǎng)瓶中，再加適量RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至第二天胰蛋白酶消化傳代，傳代時，一部分傳于蓋玻片上，置于37 ℃、5%CO2的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，第2天將傳有細(xì)胞的蓋玻片置入10%甲醛溶液中固定12 h，備用。

1.4 轉(zhuǎn)染前后小鼠肝細(xì)胞表面干性分子CD44、CD90、CD133檢測 采用免疫細(xì)胞化學(xué)。從甲醛中取出轉(zhuǎn)染前、轉(zhuǎn)染后的傳有小鼠肝細(xì)胞的蓋玻片各3片，分別使用0.01 mmol/L PBS洗2 min×3次，分別滴加H2O2適量，室溫下靜置30 min、0.01 mmol/L PBS洗2 min×3次，滴加1滴5%BSA室溫封閉20 min，甩干蓋玻片多余液體，不洗，分別滴加一抗(鼠抗人CD44抗體、鼠抗人CD90抗體和鼠抗人CD133抗體)，37 ℃水浴2 h，取出，0.01 mmol/L PBS洗2 min×3次，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠二抗，37 ℃水浴30 min，0.01 mmol/L PBS洗2 min×3次，滴加SABC試劑1滴，37 ℃水浴20 min，0.01 mmol/L PBS洗5 min×4次，顯色劑顯色后，普通光學(xué)顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染前、后小鼠肝細(xì)胞表面干性分子CD44、CD90、CD133的表達(dá)情況,陽性細(xì)胞可被染色劑染為藍(lán)綠色，陰性細(xì)胞不顯色。

2 結(jié)果

轉(zhuǎn)染前小鼠肝細(xì)胞表面干性分子CD44、CD90、CD133表達(dá)情況見圖1。轉(zhuǎn)染前鏡下可見部分細(xì)胞CD90、CD133呈陽性，且陽性染色細(xì)胞都是圓形，細(xì)胞個體較小。CD44的檢測結(jié)果一直都是陰性，未見有CD44陽性染色細(xì)胞。

圖1 轉(zhuǎn)染前小鼠肝細(xì)胞表面干性分子CD44、CD90、CD133表達(dá)

轉(zhuǎn)染后小鼠肝細(xì)胞表面干性分子CD44、CD90、CD133表達(dá)情況見圖2。在肝細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HBV Creg DNA后，部分細(xì)胞CD44呈陽性染色。

3 討論

有研究人員認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生是干細(xì)胞發(fā)育受阻，激活了異常分裂機(jī)制，導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖。也有研究人員認(rèn)為，腫瘤組織中存在突變的干細(xì)胞，這些不正常的干細(xì)胞只能發(fā)育為腫瘤細(xì)胞，而不能發(fā)育為正常組織細(xì)胞，這是腫瘤發(fā)生及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的根本原因[3]。正常組織的干細(xì)胞與腫瘤組織的干細(xì)胞到底有何不同呢？干細(xì)胞是一種前體細(xì)胞，細(xì)胞的某種干性分子不只是在一種組織存在，在很多種組織可能存在相同的干性標(biāo)記分子，如CD133在造血干細(xì)胞、肝臟干細(xì)胞、腎細(xì)胞癌、乳腺癌等均有表達(dá)，所以找到特異性的腫瘤干細(xì)胞表面分子標(biāo)記，對于腫瘤的分子靶向治療有重要意義。本實驗研究主要通過將外源因素pcDNA3.1-HBV Creg DNA導(dǎo)入正常小鼠肝細(xì)胞，觀察正常小鼠肝細(xì)胞表面干性標(biāo)記分子的變化，從而找到乙肝相關(guān)性肝癌特異性的細(xì)胞表面分子標(biāo)記，為乙肝相關(guān)性肝癌的分子靶向治療提供理論依據(jù)。

圖2 轉(zhuǎn)染后小鼠肝細(xì)胞表面干性分子CD44、CD90、CD133表達(dá)

pcDNA3.1-HBV Creg DNA為我們實驗室構(gòu)建的HBV DNA片段的表達(dá)載體，該HBV Creg DNA片段中，包含了HBV的核心基因、兩個增強(qiáng)子(Enh I和EnhⅡ)、完整的X蛋白的啟動子、核心啟動子、反式調(diào)控序列(X蛋白編碼區(qū))、信號肽序列(前C編碼區(qū))即包含了HBV核心基因及其上游的調(diào)控序列和包裝信號區(qū)(1853nt-1982nt)、順向重復(fù)序列1(DRⅠ)、順向重復(fù)序列2(DR Ⅱ)及其間的粘性末端區(qū)(1592nt-1836nt)。研究表明，HBV的該段DNA序列，與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。HBV X蛋白可以反式調(diào)控、激活細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路，引起表觀遺傳改變[3]，從而提高細(xì)胞干性表達(dá)，決定腫瘤轉(zhuǎn)化。HBV兩個直接重復(fù)序列區(qū)域可以同源重組等多種方式整合入人類肝細(xì)胞基因組[4]，通常整合入細(xì)胞基因組的HBV DNA序列還包括X基因、X基因的啟動子、C基因、C基因的啟動子、增強(qiáng)子2(EnhⅡ)、S基因等。X基因的啟動子是已證明了的強(qiáng)啟動子，整合后能夠有效激活細(xì)胞基因的表達(dá)，EnhⅡ增強(qiáng)表面抗原和X基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性[5]，整合后導(dǎo)致HBV的X抗原和表面抗原持續(xù)表達(dá)，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄，激活干細(xì)胞的信號傳導(dǎo)途徑，使細(xì)胞表現(xiàn)出干性。此外，HBV基因整合入細(xì)胞基因組可能會導(dǎo)致p53基因失活，使干細(xì)胞基因過表達(dá)[6]。在小鼠肝細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HBV Creg DNA前后，細(xì)胞表面干性標(biāo)記分子發(fā)生了變化，轉(zhuǎn)染前，在小鼠肝細(xì)胞表面主要檢測出的細(xì)胞干性標(biāo)記分子為CD133和CD90部分細(xì)胞呈陽性表達(dá)，而CD44在轉(zhuǎn)染前一直未檢出。轉(zhuǎn)染后，在小鼠肝細(xì)胞表面也能檢出CD133和CD90部分細(xì)胞呈陽性表達(dá)，但CD44在轉(zhuǎn)染后，檢出大部分小鼠肝細(xì)胞呈陽性表達(dá)。CD133和CD90在正常組織和腫瘤組織均有實驗研究檢出，而對于CD44的檢測，大部分實驗研究都是檢測腫瘤組織[7～11]。

眾所周知，肝細(xì)胞屬于穩(wěn)定細(xì)胞。但是當(dāng)肝臟受到刺激時，肝細(xì)胞既表現(xiàn)出較強(qiáng)的再生能力，肝細(xì)胞的這種再生能力說明肝臟內(nèi)存在維持細(xì)胞更新的干細(xì)胞[12]。正常肝臟細(xì)胞可能不具有干性特征，但當(dāng)肝臟受到損傷刺激后，肝細(xì)胞則表現(xiàn)出干性特征，經(jīng)過損傷刺激，肝細(xì)胞表面出現(xiàn)干性標(biāo)記分子，而我們的研究是通過取出小鼠肝臟，然后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，中間經(jīng)過肝臟損傷刺激的過程，所以在肝細(xì)胞傳代培養(yǎng)后，檢測肝細(xì)胞部分細(xì)胞干性標(biāo)記分子陽性。Rountree等[13]的研究表明分離出CD133+肝臟干細(xì)胞可以體外克隆擴(kuò)增，CD133是一個干細(xì)胞標(biāo)記分子[14]，CD90在胚胎肝臟和肝腫瘤中也是一個很重要的干性標(biāo)記[15]，但是我們研究表明，CD90和CD133分子在正常干細(xì)胞和pcDNA3.1-HBV Creg DNA轉(zhuǎn)染后的均有表達(dá)，說明CD90和CD133分子可能是正常肝臟干細(xì)胞表面的干性標(biāo)記分子。正常肝細(xì)胞在pcDNA3.1-HBV Creg DNA轉(zhuǎn)染前為檢測出CD44的表達(dá)，然而，在轉(zhuǎn)染后卻檢測出有大部分肝細(xì)胞呈陽性表達(dá)，說明帶有調(diào)控序列的HBV Creg DNA片段可影響小鼠肝細(xì)胞表面干性分子CD44的表達(dá)，CD44分子的陽性表達(dá)可能與乙肝相關(guān)性肝癌的發(fā)生有關(guān)，CD44分子可能是比較有特性的肝癌干細(xì)胞的表面干性標(biāo)記分子。

綜上所述，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HBV Creg DNA質(zhì)粒的小鼠肝細(xì)胞表達(dá)CD44、CD90、CD133。HBV Creg DNA可可影響小鼠肝細(xì)胞表面干性分子CD44的表達(dá)。CD44可能是乙肝相關(guān)性肝癌干細(xì)胞的干性標(biāo)記分子，而CD90、CD133可能是正常肝臟干細(xì)胞的干性標(biāo)記分子。

[1] Reya T, Morrison SJ, Clarke MF, et al. Stem cells，cancer，and cancer stem cells[J]. Nature, 2001,414(6859):105-111

[2] Bahnassy AA, Fawzy M, El-Wakil M, et al. Aberrant expression of cancer stem cell markers (CD44, CD90, and CD133) contributes to disease progression and reduced survival in hepatoblastoma patients: 4-year survival data[J]. Transl Res, 2015,165(3):396-406.

[3] Tian Y, Ni DJ, Yang WB, et al. Telbivudine treatment corrects HBV-induced epigenetic alterations in liver cells of patients with chronic hepatitis B[J]. Carcinogenesis, 2014,35(1):53-61.

[4] Kimbi GC, Kramvis A, Kew MC. Integration of hepatitis B virus DNA into chromosomal DNA during acute hepatitis B[J].World J Gastroenterol, 2005,11(41):6416-6421.

[5] Bai X, Zhu Y, Jin Y, et al. Temporal acquisition of sequential mutations in the enhancer II and basal core promoter of HBV in individuals at high risk for hepatocellular carcinoma[J]. Carcinogenesis, 2011,32(1):63-68.

[6]Amaddeo G, Cao Q, Ladeiro Y, et al. Integration of tumour and viral genomic characterisations in HBV-related hepatocellular carcinomas[J]. Gut, 2014,64(5):820-829.

[7] Jing FF, Kim HJ, Kim CH, et al. Colon cancer stem cell markers CD44 and CD133 in patients with colorectal cancer and synchronous hepatic metastases[J]. Intern J Oncol, 2015,46(4):1582-1588.

[8] Huang X, Sheng Y, Guan M. Co-expression of stem cell genes CD133 and CD44 in colorectal cancers with early liver metastasis[J].Surg Oncol, 2012,21(2):103-107.

[9] Chen KL, Pan F, Jiang H, et al. Highly enriched CD133(+)CD44(+) stem-like cells with CD133(+)CD44(high) metastatic subset in HCT116 colon cancer cells[J].Clin Exp Metas, 2011,28(8):751-763.

[10] Ying H, Zou QF, Ge RL, et al. The critical role of CD133+CD44+/high tumor cells inhematogenous metastasis of liver cancers [J]. Cell Res, 2012,22(1):259-272.

[11] Wang CX, Xie JP, Guo JS, et al. Evaluation of CD44 and CD133 as cancer stem cell markers for colorectal cancer[J].Oncolg Rep, 2012,28(4):1301-1308.

[12] Jeong Eun H, Sang HH, Ji-Hun Km, et al. Distribution of hepatic stem cell markers in human liver with massive hepatic necrosis[J]. Basic Applied Pathol, 2010,3(2):39-45.

[13] Rountree CB, Ding W, Dang H, et al. Isolation of CD133+Liver Stem Cells for Clonal Expansion[J]. J Vis Exp, 2011, 2011 (56):1-9.

[14] Zhong L. CD133: a stem cell biomarker and beyond[J]. Exper Hematol Oncol, 2013,2(17):1-8.

[15] Ceafalan L, Vidulescu C, Radu E, et al. Expression of stem cell markers on fetal and tumoral human liver cells in primary culture[J]. Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi, 2005,109(1):96-104.

貴州省科技廳科學(xué)技術(shù)基金資助項目(2013-2268) 。

羅昊翔

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.07.011

R73

A

1002-266X(2017)07-0037-03

2016-06-12)