群體感應(yīng)抑制劑與磺胺甲惡唑、鹽酸強(qiáng)力霉素對(duì)大腸桿菌的聯(lián)合毒性及其機(jī)制初探

谷月，孫昊宇，葛鴻銘，馬清萍，林志芬,#，張飲江,,*

1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306 2. 污染控制與資源化研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海200092 3. 水域環(huán)境生態(tài)上海高校工程研究中心，上海201306

抗生素自發(fā)現(xiàn)以來(lái)，被廣泛地應(yīng)用于臨床醫(yī)藥和生命科學(xué)等行業(yè)中，具有種類多、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)。其中，磺胺類抗生素因其性質(zhì)穩(wěn)定、價(jià)格低廉而被廣泛用于家畜飼料中來(lái)預(yù)防和治療家畜疾病[1]，2003年我國(guó)磺胺類藥物產(chǎn)量突破20 000 t 且一直持續(xù)增長(zhǎng)。同時(shí)，另一類廣譜抗生素——四環(huán)素的應(yīng)用也極為廣泛，占美國(guó)整個(gè)抗生素市場(chǎng)份額的15.8%；而我國(guó)是世界上四環(huán)素類抗生素的生產(chǎn)、使用和銷售大國(guó)，僅2014年我國(guó)四環(huán)素類抗生素的使用量就高達(dá)6 950 t[2-3]。但是，近年來(lái)抗生素濫用導(dǎo)致的抗性基因爆發(fā)及超級(jí)細(xì)菌出現(xiàn)等生態(tài)安全問(wèn)題引發(fā)了人們的廣泛關(guān)注，抗生素替代品的探索及研發(fā)變得刻不容緩[4]。

群體感應(yīng)抑制劑(quorum sensing inhibitors，QSIs)是一種作用于群體感應(yīng)(QS)系統(tǒng)的新型抗菌劑。研究表明，QSIs干擾細(xì)菌QS系統(tǒng)的方式主要包括與信號(hào)分子受體蛋白競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合和誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生可以使信號(hào)分子滅活的降解酶等途徑，因此具有不對(duì)細(xì)菌直接產(chǎn)生毒性作用、不對(duì)細(xì)菌施加選擇性生長(zhǎng)壓力以及不易誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥等特點(diǎn)[20]。近些年，越來(lái)越多研究者認(rèn)為，QSIs可以作為一類傳統(tǒng)抗生素的可能替代品應(yīng)用到相關(guān)行業(yè)中[5]。基于QSIs的遠(yuǎn)大應(yīng)用前景，環(huán)境中QSIs和傳統(tǒng)抗生素聯(lián)合暴露的可能性逐漸增大，因此對(duì)于它們聯(lián)合暴露所產(chǎn)生生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的研究迫在眉睫。

為了探究上述問(wèn)題，本文以經(jīng)典模式生物大腸桿菌[6-7](Escherichia coli)為受試生物，測(cè)定了7種QSIs(DL-焦谷氨酸、N-乙烯基吡咯烷酮、呋喃酮乙酸酯、2-甲基四氫呋喃-3-酮、3,4-二溴-2(5H)-呋喃酮、(R)-3-吡咯烷醇、D-脯氨醇)分別與磺胺甲惡唑(SMX，磺胺類抗生素)和鹽酸強(qiáng)力霉素(DH，四環(huán)素類抗生素)的二元聯(lián)合毒性，判別其聯(lián)合作用類型，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，以期為傳統(tǒng)抗生素與QSIs聯(lián)合暴露的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供一定的科學(xué)依據(jù)和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 生物與試劑

受試生物：Escherichia coli (MG1655)，購(gòu)自Biovector Science實(shí)驗(yàn)室。

化學(xué)試劑：7種QSIs包括DL-焦谷氨酸、N-乙烯基吡咯烷酮、呋喃酮乙酸酯、2-甲基四氫呋喃-3-酮、3,4-二溴-2(5H)-呋喃酮、(R)-3-吡咯烷醇、D-脯氨醇，磺胺甲惡唑(SMX)和鹽酸強(qiáng)力霉素(DH)均購(gòu)自Sigma-Aldrich化學(xué)制品有限公司(St.Louis，MO，USA)，純度均為分析純。具體信息如表1。

1.2 毒性試驗(yàn)

毒性實(shí)驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[8]。取待測(cè)化合物用適量DMSO配制成濃度較高的標(biāo)準(zhǔn)溶液，實(shí)驗(yàn)時(shí)用1% NaCl稀釋成等對(duì)數(shù)梯度系列，加入96孔酶標(biāo)板中，每孔共加入200 μL含有化合物、培養(yǎng)基及工作菌液的混合體，空白組以1%的NaCl代替化合物的部分，最后將培養(yǎng)體系在37 ℃下振蕩培養(yǎng)12 h。測(cè)試體系以吸光度OD為測(cè)試終點(diǎn)，采用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定OD值。以上樣品每次至少設(shè)置12個(gè)濃度梯度，3組平行。抑制率(P%)計(jì)算如式1：

(1)

表1 化合物相關(guān)信息表Table 1 Details of the test chemicals

式(1)中，OD0為E. coli在無(wú)染毒作用下的空白OD平均值，而OD為藥物作用下細(xì)菌的OD平均值。

二元混合實(shí)驗(yàn)方法參照參考文獻(xiàn)[9]，根據(jù)單一化合物的EC50，配制A和B化合物等毒性比的混合溶液，按照單一毒性實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定混合溶液的毒性。TU50計(jì)算如式2。

(2)

式(2)中，CA和CB是混合體系在產(chǎn)生半數(shù)抑制效應(yīng)時(shí)單一組分(A、B)的濃度，EC50A和EC50B分別是單一組分在產(chǎn)生半數(shù)抑制效應(yīng)時(shí)的濃度。

對(duì)于混合物聯(lián)合效應(yīng)的判別采用TU判別法進(jìn)行，具體為[10]：當(dāng)TU50<0.8時(shí)，化合物聯(lián)合作用為協(xié)同；當(dāng)0.8≤TU50≤1.2時(shí)，化合物聯(lián)合作用為相加；當(dāng)TU50>1.2時(shí)，化合物聯(lián)合作用為拮抗。

1.3 分子對(duì)接

使用Discovery Studio 3.1 (Accelrys Software Inc., San Diego, CA) 對(duì)E. coli中目標(biāo)蛋白(晶體三級(jí)結(jié)構(gòu))和目標(biāo)小分子進(jìn)行對(duì)接。根據(jù)化合物已有抑菌機(jī)制從PDB protein data bank (http://www.pdb.org) 獲取各類化合物的目標(biāo)靶蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)。本研究中，QSIs作用于E. coli的目標(biāo)靶蛋白為L(zhǎng)srB或者SdiA，PDB ID分別為4LFD和1TJY。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 群體感應(yīng)抑制劑(QSIs)與磺胺甲惡唑(SMX)、鹽酸強(qiáng)力霉素(DH)單一毒性及作用機(jī)制

本研究以log(1/EC50)作為指標(biāo)來(lái)表征化合物毒性，QSIs、SMX和DH對(duì)E. coli的單一毒性大小見(jiàn)圖1。

圖1 單一化合物log(1/EC50)比較Fig. 1 Comparison of log(1/EC50) of single chemical

從圖1可以看出，所研究化合物毒性大小順序?yàn)椋篋H >SMX>QSIs(BRF > PA > FA > HPL > DP > MO > VP)。即QSIs的毒性明顯低于SMX和DH，QSIs中毒性最小的VP的log(1/EC50)比SMX的小5以上，比DH的小6以上。此外，雖然總體上7種QSIs的毒性大小相差并不大，但是BRF毒性卻大于其他幾個(gè)QSIs，這是因?yàn)锽RF結(jié)構(gòu)中含有雙溴基團(tuán)導(dǎo)致其毒性變大[11]。

前人研究表明，細(xì)菌體內(nèi)的氨基苯甲酸(PABA)與二氫葉酸合成酶(DHPS)結(jié)合生成二氫葉酸(DHFA)，調(diào)控細(xì)菌核蛋白的合成，從而促進(jìn)細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖[19]；磺胺類藥物(SAs)的化學(xué)結(jié)構(gòu)與PABA非常相似，可與PABA競(jìng)爭(zhēng)DHPS從而抑制二氫葉酸的形成，最終發(fā)揮抑菌作用[12]。而鹽酸強(qiáng)力霉素的抑菌作用表現(xiàn)為通過(guò)與核蛋白體的30S小亞基結(jié)合，阻止氨?；?tRNA同核蛋白體(RNP)結(jié)合，從而抑制肽鏈的增長(zhǎng)和影響細(xì)菌蛋白的合成[13]。

E. coli自身不能產(chǎn)生AI-1類信號(hào)分子(高絲氨酸內(nèi)酯類化合物)，只能產(chǎn)生AI-2類信號(hào)分子(呋喃酮類化合物)，它的群體感應(yīng)系統(tǒng)有2條：1)細(xì)菌自身產(chǎn)生AI-2信號(hào)分子，AI-2被位于周質(zhì)空間的蛋白LsrB感應(yīng)到，通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)被運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中后與LsrR蛋白結(jié)合，改變LsrR的構(gòu)象[14]，解除LsrR對(duì)lsrACDBFGE基因抑制作用，而該群體感應(yīng)系統(tǒng)在細(xì)菌代謝過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。2)細(xì)菌接收外源的AI-1信號(hào)分子，靶蛋白是SdiA，結(jié)合體可以調(diào)控ftsQAZ操縱子的表達(dá)，而表達(dá)的FtsZ蛋白是細(xì)胞分裂激活因子，因此促進(jìn)了細(xì)胞分裂[15-16]。當(dāng)大腸桿菌暴露在QSIs中時(shí)，QSIs可以和AI-2或AI-1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合它們各自的靶蛋白LsrB或SdiA，起到抑菌作用。

2.2 群體感應(yīng)抑制劑(QSIs)與磺胺甲惡唑(SMX)、鹽酸強(qiáng)力霉素(DH)的聯(lián)合毒性及其機(jī)制初探

7種QSIs分別與SMX、DH的二元毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

由表2可看出，前5種QSIs與SMX、DH聯(lián)合作用均為相加，后2種QSIs與SMX、DH聯(lián)合作用均為拮抗。那么，QSIs與SMX、DH聯(lián)合作用時(shí)為什么會(huì)有相加和拮抗2種不同的結(jié)果呢？

前文提到，E. coli有2條群體感應(yīng)系統(tǒng)，由此我們推測(cè)不同QSIs可能作用于E. col的不同群體感應(yīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致與SMX、DH的聯(lián)合作用不同。當(dāng)QSIs作用于AI-2介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)時(shí)與AI-2競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合LsrB蛋白，當(dāng)QSIs作用于AI-1介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)時(shí)與AI-1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合SdiA蛋白。因此，我們將7種QSIs分別與LsrB和SdiA蛋白進(jìn)行了分子對(duì)接(圖2，Ebinding值見(jiàn)表3，可以看出：1) 7種QSIs與LsrB和SdiA蛋白均以氫鍵發(fā)生結(jié)合；2) 前5種QSIs與LsrB形成的氫鍵數(shù)量較后2種QSIs多，結(jié)合更為緊密，如PA與LsrB形成2個(gè)氫鍵，與SdiA只形成一個(gè)氫鍵；3)后2種QSIs與SdiA形成的氫鍵數(shù)量較前5種QSIs多，結(jié)合更為緊密，如HPL與LsrB僅有一個(gè)氫鍵，而與SdiA形成2個(gè)氫鍵。根據(jù)7種QSIs分別與SMX、DH的聯(lián)合作用類型和它們分別與LsrB、SdiA蛋白的分子對(duì)接結(jié)果，我們將前5種QSIs歸為第I類QSIs(作用于AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng))，將后2種QSIs歸為第II類QSIs(作用于AI-1群體感應(yīng)系統(tǒng))。

圖2 群體感應(yīng)抑制劑(QSIs)和LsrR、SdiA的分子對(duì)接2D圖Fig. 2 2D molecular docking of quorum sensing in hibitors (QSIs) with LsrR and SdiA

QSITU50JointeffectQSITU50JointeffectSMXPA1.16additiveVP1.10additiveFA1.08additiveMO0.85additiveBRF1.04additiveHPL1.88antagonismDP4.54antagonismDHPA1.03additiveVP1.07additiveFA1.05additiveMO1.10additiveBRF1.19additiveHPL2.07antagonismDP2.57antagonism

為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述推測(cè)，我們選擇E. coli中2條群體感應(yīng)系統(tǒng)的靶蛋白LsrB、SdiA分別和QSIs之間相互作用的結(jié)合能EbindingLsrB、EbindingSdiA值作為表征參數(shù)，與測(cè)得的毒性數(shù)據(jù)log(1/EC50)值進(jìn)行回歸分析，建立的QSAR模型如下：

log(1/EC50)=0.0414EbindingLsrB-1.0071

R2=0.0268，n=7

(3)

log(1/EC50)=1.2999EbindingSdiA-17.474

R2=0.1327，n=7

(4)

如果2類QSIs作用于同一種蛋白，那么log(1/EC50)與Ebinding值之間應(yīng)具有較好的相關(guān)性，但是根據(jù)式(3)、式(4)的結(jié)果，R2都小于0.2，因此證明2類QSIs作用于不同的靶蛋白。我們又對(duì)第I類QSIs與EbindingLsrB、EbindingSdiA進(jìn)行了線性回歸，結(jié)果如下：

log(1/EC50)=0.1318EbindingLsrB+1.9667

R2=0.6487，n=5

(5)

log(1/EC50)=3.8828EbindingSdiA-13.327

R2=0.2624，n=5

(6)

可見(jiàn)，第I類QSIs與LsrR蛋白結(jié)合的Ebinding值與對(duì)應(yīng)QSIs的log(1/EC50)之間線性關(guān)系較SdiA好，表明第I類QSIs作用于AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)通路，結(jié)合蛋白為L(zhǎng)srR；而第II類QSIs則作用于AI-1群體感應(yīng)系統(tǒng)通路，結(jié)合蛋白為SdiA。那么不同作用途徑的2類QSIs在和SMX、DH聯(lián)合作用時(shí)為什么會(huì)產(chǎn)生不同的聯(lián)合效應(yīng)呢？

我們前期研究[18]發(fā)現(xiàn)，SMX和DH對(duì)費(fèi)氏弧菌(發(fā)光菌)的24 h毒性作用中均有hormesis效應(yīng)(劑量效應(yīng)曲線如圖3)，其機(jī)理表現(xiàn)為低濃度的SMX和DH能夠促進(jìn)費(fèi)氏弧菌體內(nèi)LuxR蛋白表達(dá)量增加，而高表達(dá)的LuxR蛋白能夠和信號(hào)分子結(jié)合促進(jìn)熒光素酶的表達(dá)，導(dǎo)致發(fā)光增強(qiáng)，從而產(chǎn)生hormesis效應(yīng)。而E. coli中的SdiA為L(zhǎng)uxR的同源蛋白，我們推測(cè)低劑量的SMX和DH也能促進(jìn)E. coli體內(nèi)SdiA蛋白的表達(dá)。當(dāng)這2種化合物與第I類QSIs共同作用時(shí)，由于此類QSIs的靶蛋白為L(zhǎng)srB，因此，低劑量的SMX或DH對(duì)SdiA蛋白表達(dá)的刺激作用不影響第I類QSIs作用的AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)，同時(shí)SMX與DH的毒性作用通路與AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)也不存在影響，因而聯(lián)合效應(yīng)表現(xiàn)為相加。而當(dāng)SMX或DH與第II類QSIs共同作用時(shí)，由于此類QSIs的靶蛋白為SdiA，因此，SdiA蛋白的過(guò)量表達(dá)會(huì)作用到AI-1群體感應(yīng)系統(tǒng)，消耗更多的QSIs，使其毒性變小，最終導(dǎo)致聯(lián)合效應(yīng)表現(xiàn)為拮抗(聯(lián)合作用機(jī)理如圖4)。

圖3 SMX、DH對(duì)費(fèi)氏弧菌光值的毒性效應(yīng)(24 h)Fig. 3 The toxicity (24 h) of SMX and DH to Vibrio fischeri

No.QSIsQSIssortlog(1/EC50)/(mol·L-1)EbindingLsrB/(kcal·mol-1)EbindingSdiA/(kcal·mol-1)1PA2.29±0.16-31.512-18.8642VP3FA4MO5BRFI1.24±0.10-25.921-17.9422.21±0.14-30.276-25.7121.84±0.11-22.556-17.1123.87±0.15-27.543-21.5316HPL7DPII1.87±0.09-27.313-19.1891.87±0.11-31.385-21.697

圖4 QSIs分別與SMX、DH聯(lián)合作用機(jī)制假設(shè)圖注： I-a為第I類QSIs與SMX；I-b為第I類QSIs與DH；II-a為第II類QSIs與SMX；II-b為第II類QSIs與DH。Fig. 4 Mechanistic hypothesis for joint toxicity of binary mixtures of QSIs with SMX and DHNote: QSIs of sort I with SMX (I-a)； QSIs of sort I with DH (I-b)； QSIs of sort II with SMX (II-a)； QSIs of sort II with DH (II-b).

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