袁嘯天+宋彥璋+劉喆昊+張凱+楊浚哲

摘 要：血細(xì)胞作為細(xì)胞免疫的承擔(dān)者，與體液免疫因子的提供者，在對蝦的免疫系統(tǒng)中具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過對凡納濱對蝦感染副溶血性弧菌后，總血細(xì)胞，大顆粒細(xì)胞，小顆粒細(xì)胞與透明細(xì)胞各自的數(shù)量變化與單類血細(xì)胞數(shù)占總血細(xì)胞數(shù)的比例變化，發(fā)現(xiàn)總血細(xì)胞數(shù)，三類血細(xì)胞數(shù)與其各自所占比例在感染的不同時期發(fā)生了不同程度的變化，大體呈現(xiàn)先增長后減少的數(shù)量變化，探索對蝦的細(xì)胞免疫與弧菌感染力的關(guān)系，為制定高效的對蝦流行病防控策略提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：凡納濱對蝦；血細(xì)胞；大顆粒細(xì)胞；小顆粒細(xì)胞；透明細(xì)胞

DOI：10.16640/j.cnki.37-1222/t.2017.05.190

1 研究意義和目的

對蝦弧菌病是對蝦養(yǎng)殖中危害嚴(yán)重的疾病之一，其中鰻弧菌和副溶血弧菌廣泛存在于自然海水中，具有流行廣、發(fā)病率高、危害大、死亡率高等特點(diǎn)，造成對蝦養(yǎng)殖業(yè)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，進(jìn)行對蝦免疫學(xué)研究，為建立高效、健康的對蝦養(yǎng)殖模式提供基礎(chǔ)科學(xué)依據(jù)。對蝦的血細(xì)胞既是細(xì)胞免疫的承擔(dān)者， 又是體液免疫因子的提供者， 分為透明細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞和大顆粒細(xì)胞三類， 各自擔(dān)負(fù)著不同的免疫功能。在健康對蝦體內(nèi)三類血細(xì)胞的比例和數(shù)量相對穩(wěn)定。當(dāng)對蝦患病后， 三類血細(xì)胞的比例和數(shù)量會發(fā)生相應(yīng)的變化。

本課題旨在探索對蝦的細(xì)胞免疫與弧菌感染力的關(guān)系，為制定高效的對蝦流行病防控策略提供理論依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

健康的凡納濱對蝦（ Litopenaeus vannamei ） 購自南山市場。副溶血性弧菌（ATCC17802）購自中國菌種保藏中心。

抗凝劑（ NaCl 450mM， KCl 10mM， EDTA-Na2 10mM， HEPES 10mM， pH7.3）與血淋巴等滲。

2.2 預(yù)實(shí)驗(yàn)

將十組凡納濱對蝦，每組3尾，分別注射0.1ml不同濃度的副溶血弧菌，記錄各組凡納濱對蝦的死亡時間。選擇接近168小時全部死亡的一組的副溶血弧菌濃度進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。如果死亡時間與理想時間相差過大，則進(jìn)行多次預(yù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 對蝦感染試驗(yàn)

選取體長10cm±0.5cm，體重30g±2g，外觀健康的凡納濱對蝦，暫養(yǎng)于180L水族箱中。一周后，感染組取30尾注射副溶血性弧菌，對照組取30尾注射等量生理鹽水。兩組分別飼養(yǎng)，每日投喂飼料一次。實(shí)驗(yàn)過程連續(xù)充氣，水溫為24℃-26℃。

2.4 血樣的制備

注射弧菌后，用配有26號針頭的1ml注射器從實(shí)驗(yàn)組3尾凡納濱對蝦與對照組3尾凡納濱對蝦的腹血竇處分別取0.4ml血淋巴。

取血前在注射器中裝入0.4ml的抗凝劑（4℃），取血后將血淋巴和抗凝劑的混合物注入裝有0.4ml抗凝劑的離心管中，混勻，混合液用于蝦總血細(xì)胞與單類血細(xì)胞數(shù)的測量。

2.5 血細(xì)胞計(jì)數(shù)

取一滴A液加到血球計(jì)數(shù)板上在400倍顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)血細(xì)胞并計(jì)算蝦總血細(xì)胞與單類血細(xì)胞數(shù)，此后每隔12小時重復(fù)取血并觀察，直至實(shí)驗(yàn)組凡納濱對蝦全部死亡。

3 結(jié)果

3.1 總血細(xì)胞計(jì)數(shù)及比較結(jié)果

72小時內(nèi)血細(xì)胞總數(shù)呈上升趨勢，72小時后直至對蝦死亡血細(xì)胞總數(shù)呈下降趨勢。血細(xì)胞最多時上升到對照組凡納濱對蝦血細(xì)胞總數(shù)的232%。108小時后血樣開始模糊不清，死亡的細(xì)胞數(shù)增多。

3.2 單類血細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)及比較結(jié)果

大顆粒細(xì)胞：60小時內(nèi)大顆粒細(xì)胞數(shù)呈上升趨勢，60小時后直至對蝦死亡大顆粒細(xì)胞數(shù)不斷下降。未感染弧菌時，大顆粒細(xì)胞數(shù)占血細(xì)胞總數(shù)的14.91%，60小時內(nèi)，其所占比例呈上升趨勢，最高時達(dá)到46.74%。此后其所占比例呈下降趨勢，最后一次測量時，比例下降到30.25%。

小顆粒細(xì)胞：84小時內(nèi)小顆粒細(xì)胞數(shù)呈上升趨勢，84小時后直至對蝦死亡小顆粒細(xì)胞數(shù)不斷下降。92小時至120小時時下降速度最快。

透明細(xì)胞：72小時內(nèi)透明細(xì)胞數(shù)呈上升趨勢，72小時后直至對蝦死亡透明細(xì)胞數(shù)不斷下降。未感染弧菌時透明細(xì)胞數(shù)在血細(xì)胞總數(shù)中所占比例最大為51.20%，72小時內(nèi)其所占比例不斷下降，72小時時最低，達(dá)到35.22%，此后有所回升，最后一次測量時，比例達(dá)到50.65%

4 總結(jié)

對蝦的三類血細(xì)胞在免疫中具有不同的功能。本研究發(fā)現(xiàn)，在對蝦感染弧菌初期，總血細(xì)胞數(shù)量和單類血細(xì)胞數(shù)量都發(fā)生了顯著的升高，說明感染弧菌后三類血細(xì)胞參與了對抗弧菌的細(xì)胞免疫反應(yīng)。隨著感染時間的增加，對蝦的血細(xì)胞數(shù)量發(fā)生顯著的下降。

可以推斷，對蝦在抵抗弧菌的過程中，其先天免疫系統(tǒng)表現(xiàn)為先強(qiáng)后抑的規(guī)律。對蝦抵抗副溶血性弧菌時，三類血細(xì)胞數(shù)量和比例上的變化規(guī)律的發(fā)現(xiàn)為制定對蝦流行病防控的高效策略提供理論依據(jù)，具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

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[2]葉燕玲，陳寬智.中國對蝦血細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、分類及計(jì)數(shù)[J].青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，1993（23）：35-41.

[3]姜國建，于仁誠，王云峰，顏天，周名江.中國明對蝦血細(xì)胞中一氧化氮合成酶的鑒定及其在白斑綜合癥病毒感染過程中的變化[J].海洋與湖沼，2004（35）：346-352.

指導(dǎo)老師：姜國建，白曉歌