梁艷 張曉燕 王小美 宋晶瑩 白雪娟 陽(yáng)幼榮 張俊仙 王蘭 許飛虹 史迎昌 吳雪瓊

·論著·

四種結(jié)核分枝桿菌增殖期抗原基因抗小鼠結(jié)核感染的比較研究

梁艷 張曉燕 王小美 宋晶瑩 白雪娟 陽(yáng)幼榮 張俊仙 王蘭 許飛虹 史迎昌 吳雪瓊

目的 研究、比較4種結(jié)核分枝桿菌增殖期抗原基因抗小鼠結(jié)核感染的作用，為開(kāi)發(fā)新型結(jié)核病免疫治療制劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 將70只BALB/c小鼠采用數(shù)字表法隨機(jī)分為7組，每組10只。以6.4×105菌落形成單位(CFU)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv尾靜脈注射感染小鼠后第3天，分別用生理鹽水、pVAX1載體、微卡菌苗、ag85aDNA、rv1291cDNA、rv1419 DNA和rv2223cDNA進(jìn)行肌內(nèi)注射，每2周1次，共3次，免疫結(jié)束后2周殺鼠，分別取肺和脾觀察其病理改變、稱(chēng)取肺和脾的質(zhì)量、做菌落計(jì)數(shù)。結(jié)果 肺組織病理顯示：生理鹽水組肺組織病變嚴(yán)重、廣泛；載體組病變也較嚴(yán)重、廣泛，但比生理鹽水組略輕；微卡菌苗組、ag85aDNA組、rv1291cDNA組、rv1419 DNA組和rv2223cDNA組肺組織病變有不同程度減輕，病變局限，部分區(qū)域肺泡結(jié)構(gòu)完整、清晰，細(xì)胞分布均勻。與生理鹽水組相比，ag85aDNA組、rv1291cDNA組、rv1419 DNA組肺菌落計(jì)數(shù)分別減少0.53 lg CFU、0.67 lg CFU、0.41 lg CFU(χ2=27.07，P<0.01)；脾菌落計(jì)數(shù)分別減少0.43 lg CFU(t>3.004，P<0.05)、0.34 lg CFU(t<3.004，P>0.05)、0.41 lg CFU(t>3.004，P<0.05)；微卡菌苗組和rv2223cDNA組肺、脾菌落計(jì)數(shù)與生理鹽水組比較均有所減少，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值均<3.004，P值均>0.05)。結(jié)論 結(jié)核分枝桿菌增殖期抗原基因rv1291c和rv1419 DNA與ag85aDNA具有相似的抗結(jié)核治療效果，而rv2223cDNA無(wú)明顯治療作用。

分枝桿菌，結(jié)核； 細(xì)菌素質(zhì)粒； 基因組成分； 免疫療法； 療效比較研究； 動(dòng)物, 實(shí)驗(yàn)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(MTB)感染引起的世界性傳染病，根據(jù)2016年WHO報(bào)道，2015年全球約有1040萬(wàn)例新發(fā)結(jié)核病患者，印度、印度尼西亞、中國(guó)、尼日利亞、巴基斯坦和南非6個(gè)國(guó)家占新發(fā)患者的60%，有58萬(wàn)例新發(fā)耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)和利福平耐藥患者，其中印度、中國(guó)和俄羅斯聯(lián)邦占新發(fā)耐藥結(jié)核病患者的45%[1]。由于耐多藥結(jié)核病的流行、化療藥物的不良反應(yīng)，以及人類(lèi)免疫缺陷病毒的感染、免疫抑制劑的應(yīng)用和年老等原因引起的機(jī)體免疫功能低下，使難治性結(jié)核病增多，抗結(jié)核治療面臨巨大的挑戰(zhàn)，尤其是耐多藥結(jié)核病、廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)面臨無(wú)藥可治的困難局面。因此，有必要研制新的安全、有效的抗結(jié)核藥物。

結(jié)核病是一種細(xì)菌性傳染性疾病，從另一個(gè)角度來(lái)看也是一種細(xì)胞免疫疾病。抗結(jié)核免疫主要是細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。免疫治療可以通過(guò)調(diào)節(jié)或選擇性地誘導(dǎo)結(jié)核病患者免疫系統(tǒng)蘊(yùn)藏的潛力，來(lái)達(dá)到治療疾病的目的。近年來(lái)通過(guò)免疫調(diào)節(jié)輔助治療結(jié)核病成為研究的熱點(diǎn)之一，免疫治療制劑的研究與開(kāi)發(fā)成為一個(gè)十分重要的研究方向。將外源基因克隆到真核表達(dá)載體上，免疫動(dòng)物，它在機(jī)體細(xì)胞內(nèi)能夠表達(dá)蛋白抗原，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答。筆者前期的研究及國(guó)內(nèi)外研究均已證明，結(jié)核分枝桿菌基因在結(jié)核病預(yù)防和治療中具有廣泛的應(yīng)用前景[2-9]。因此，筆者研究3種新型的結(jié)核分枝桿菌增殖期抗原基因抗小鼠結(jié)核感染的作用，并與已有的ag85aDNA進(jìn)行比較，為開(kāi)發(fā)新型結(jié)核病免疫治療制劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

一、材料

1. 結(jié)核分枝桿菌菌株和基因來(lái)源：結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；微卡菌苗(注射用母牛分枝桿菌)購(gòu)自安徽智飛龍科馬生物制藥有限責(zé)任公司，規(guī)格22.5 μg/支；結(jié)核分枝桿菌ag85a、rv1291c、rv1419和rv2223c質(zhì)粒DNA均由解放軍第三〇九醫(yī)院結(jié)核病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、制備，濃度均為1.0 mg/ml；pVAX1載體購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，由解放軍第三〇九醫(yī)院結(jié)核病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備，濃度為1 mg/ml。

2. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：73只6～8周齡雌性BALB/c小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

二、方法

1. 小鼠結(jié)核感染：每只小鼠經(jīng)尾靜脈注射0.4 ml 含6.4×105菌落形成單位(CFU)的結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv菌懸液。

2. 小鼠結(jié)核病模型制備情況：感染后3 d，采用數(shù)字表法隨機(jī)取3只小鼠進(jìn)行解剖，肉眼觀察小鼠肺和脾大體病理改變；并進(jìn)行肺和脾的活菌計(jì)數(shù)，方法是取小鼠全肺加生理鹽水研磨，加等體積 4% NaOH 消化30 min后, 倍比稀釋取100 μl 接種于改良羅氏雞卵平皿培養(yǎng)基上，置 37 ℃溫箱培養(yǎng)4周；取小鼠脾加生理鹽水研磨，倍比稀釋后取100 μl 接種于改良羅氏雞卵平皿培養(yǎng)基上，置 37 ℃溫箱培養(yǎng)4周，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

3. 實(shí)驗(yàn)分組：小鼠感染后，采用數(shù)字表法隨機(jī)將小鼠分為7組，每組10只小鼠。小鼠感染后第3天開(kāi)始治療。(1)生理鹽水組：每只小鼠肌內(nèi)注射100 μl生理鹽水；(2)pVAX1載體組：每只小鼠肌內(nèi)注射100 μg/100 μl pVAX1載體；(3)微卡菌苗組：每只小鼠肌內(nèi)注射25 μg/100 μl微卡；(4)ag85aDNA組：每只小鼠肌內(nèi)注射100 μg/100 μlag85aDNA；(5)rv1291cDNA組：每只小鼠肌內(nèi)注射100 μg/100 μlrv1291cDNA；(6)rv1419 DNA組：每只小鼠肌內(nèi)注射100 μg/100 μlrv1419 DNA；(7)rv2223cDNA組：每只小鼠肌內(nèi)注射100 μg/100 μlrv2223cDNA，各治療組每2周免疫1次，共3次。

4. 肺組織病理學(xué)檢查：治療結(jié)束后2周，取小鼠肺右葉固定于10%中性福爾馬林，石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅(HE)染色后，鏡下觀察肺組織病理改變。

5. 肺、脾菌落計(jì)數(shù)：治療結(jié)束后2周，取小鼠肺左葉稱(chēng)重，加生理鹽水研磨，加等體積 4% NaOH 消化30 min后, 倍比稀釋取100 μl 接種于改良羅氏雞卵平皿培養(yǎng)基上，置 37 ℃溫箱培養(yǎng)4周，將得到的肺左葉菌落數(shù)根據(jù)肺左葉和全肺的質(zhì)量換算為全肺菌落數(shù)；取脾的上半部分稱(chēng)重，加生理鹽水研磨，倍比稀釋后取100 μl 接種于改良羅氏雞卵平皿培養(yǎng)基上，置 37 ℃ 溫箱培養(yǎng)4周，將得到的脾的上半部分的菌落數(shù)根據(jù)脾上半部分的質(zhì)量和全脾的質(zhì)量換算為全脾菌落數(shù)。

三、 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、小鼠結(jié)核病模型的建立

感染后3 d，全肺平均荷菌量為2.0×106CFU；全脾平均荷菌量為6.8×105CFU。小鼠肺臟均有明顯的壞死，脾臟都有腫大。

二、肺臟組織病理改變

治療結(jié)束后2周，小鼠肺組織鏡下病理改變的代表性結(jié)果見(jiàn)圖1。生理鹽水組肺組織病變嚴(yán)重、廣泛，充血、實(shí)變，正常肺泡結(jié)構(gòu)消失，肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)大量的漿液纖維素性滲出，可見(jiàn)大量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；pVAX1載體組病變程度也較嚴(yán)重、廣泛，但比生理鹽水組略輕；微卡菌苗組、ag85aDNA組、rv1291cDNA組、rv1419 DNA組和rv2223cDNA組肺組織病變程度較輕，病變局限，可見(jiàn)少量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，部分區(qū)域可見(jiàn)正常的肺泡結(jié)構(gòu)，肺泡輪廓相對(duì)清晰，細(xì)胞分布均勻。

三、 肺組織活菌計(jì)數(shù)

生理鹽水組、pVAX1載體組、微卡菌苗組、ag85aDNA組、rv1291cDNA組、rv1419 DNA組和rv2223cDNA組全肺平均菌落數(shù)依次是(7.33±0.18) lg CFU、(7.23±0.10) lg CFU、(7.08±0.37) lg CFU、(6.80±0.41) lg CFU、(6.66±0.60) lg CFU、(6.92±0.41) lg CFU和(7.13±0.25) lg CFU。與生理鹽水組相比，各治療組中只有ag85aDNA組、rv1291cDNA組、rv1419 DNA組全肺平均菌落數(shù)明顯減少(χ2=27.07，P<0.01)，分別減少了0.53 lg CFU、0.67 lg CFU和0.41 lg CFU；微卡菌苗組和rv2223cDNA組雖分別減少了0.25 lg CFU和0.2 lg CFU，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Student-Newman-Keulsq檢驗(yàn)，P值均>0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖2。

四、脾組織活菌計(jì)數(shù)

生理鹽水組、pVAX1載體組、微卡菌苗組、ag85aDNA組、rv1291cDNA組、rv1419 DNA組和rv2223cDNA組全脾平均菌落數(shù)依次是(6.92±0.12) lg CFU、(6.81±0.07) lg CFU、(6.65±0.35) lg CFU、(6.49±0.21) lg CFU、(6.58±0.25) lg CFU、(6.51±0.20) lg CFU和(6.65±0.22) lg CFU。與生理鹽水組相比，各治療組中只有ag85aDNA組、rv1291cDNA組、rv1419 DNA組全脾平均菌落數(shù)明顯減少(F=4.03，P=0.0019)，分別減少0.43 lg CFU(t>3.004，P<0.05)、0.34 lg CFU(t<3.004，P>0.05)、0.41 lg CFU(t>3.004，P<0.05)；微卡菌苗組和rv2223cDNA組雖分別減少了0.27 lg CFU，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值均<3.004，P值均>0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖1 治療結(jié)束后2周各組小鼠肺組織病理檢查結(jié)果(HE ×100)(a)生理鹽水組； (b) pVAX1載體組；(c) 微卡菌苗組；(d) ag85a DNA組；(e) rv1291c DNA組；(f) rv1419 DNA組；(g) rv2223c DNA組

圖2 治療結(jié)束后2周各組小鼠肺菌落計(jì)數(shù)結(jié)果

圖3 治療結(jié)束后2周各組小鼠脾菌落計(jì)數(shù)結(jié)果

討 論

結(jié)核病保護(hù)性免疫主要是細(xì)胞免疫, 誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)的抗原主要存在于結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)和培養(yǎng)濾液中, 其中分泌蛋白和細(xì)胞壁表面的蛋白是主要的免疫保護(hù)性抗原, 能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，將成為新疫苗研究的首選靶抗原[10]。結(jié)核分枝桿菌rv1419基因由474 bp組成，編碼一個(gè)由157個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，是分子質(zhì)量最小的凝集素[11]，該蛋白屬于蓖麻毒素B型三葉草形蛋白質(zhì)家族[12]，存在于結(jié)核分枝桿菌H37Rv培養(yǎng)濾液中，而非結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液中則不存在[13]。這種凝集素可以調(diào)節(jié)多種生物過(guò)程，比如細(xì)胞與細(xì)胞間的黏附、細(xì)胞的有絲分裂和固有免疫過(guò)程等，尤其是在宿主-病原體相互作用中發(fā)揮重要作用。劉銀萍等[14]用生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)結(jié)核分枝桿菌Rv1419是一個(gè)T細(xì)胞抗原表位占優(yōu)勢(shì)的蛋白抗原。在活動(dòng)性肺結(jié)核的患者中，Rv1419蛋白可刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生大量的γ-干擾素(IFN-γ)，此外，在活動(dòng)性肺結(jié)核患者的血清中，Rv1419也顯示產(chǎn)生了高滴度的IgG抗體，并且抗體滴度在結(jié)核病有效治療后隨之下降[15]。結(jié)核分枝桿菌rv2223c基因由 1563 bp組成，編碼一個(gè)由 520 個(gè)氨基酸組成的脂肪酶；Lun和Bishai[16]通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)Rv2223c氨基酸序列與Rv2224c同源性為51.2%，相似性為64.6%，它們含有相同的結(jié)構(gòu)域，而且活性位點(diǎn)甘氨酸-酪氨酸-絲氨酸-酪氨酸-甘氨酸(G-Y-S-Y-G)殘基是完全保守的，推測(cè)Rv2223c功能可能與Rv2224c相同，是一個(gè)具有羧酸酯酶活性的分泌蛋白。結(jié)核分枝桿菌rv1291c基因由 336 bp 組成，編碼一個(gè)由 111 個(gè)氨基酸組成的分泌蛋白。McMurry等[17]應(yīng)用Rv2223c和Rv1291c多肽分別刺激PPD陽(yáng)性者，然后通過(guò)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISPOT)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)分別有48%和12%的PPD陽(yáng)性者的T細(xì)胞分泌IFN-γ，通過(guò)ELISA方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)分別有11%和15%的PPD陽(yáng)性者外周血單個(gè)核細(xì)胞分泌IFN-γ。鑒于上述3種抗原均能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生Th1型細(xì)胞因子，因此本研究將這3種蛋白的編碼基因克隆入真核表達(dá)載體。

鑒于微卡菌苗是一個(gè)已獲得國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局臨床批文的免疫調(diào)節(jié)劑，多年臨床輔助結(jié)核病治療結(jié)果表明其能增強(qiáng)結(jié)核病患者的細(xì)胞免疫功能，使結(jié)核病患者體質(zhì)量增加，加快痰菌陰轉(zhuǎn)、病灶吸收及空洞縮小、閉合的速度[18-21]；而Ag85A是結(jié)核分枝桿菌和BCG主要的分泌性蛋白，筆者前期研究[2-5]和國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究[6-8]表明，ag85aDNA具有較好的免疫原性、治療作用和免疫保護(hù)作用。因此，本研究選擇微卡菌苗和ag85aDNA作為陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)結(jié)核感染動(dòng)物模型評(píng)價(jià)3種新型的結(jié)核分枝桿菌基因的免疫治療作用，以篩選具有免疫治療作用的基因，為開(kāi)發(fā)新型結(jié)核病疫苗奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

筆者首次發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌增殖期抗原rv1291c、rv1419編碼基因?qū)π∈蠼Y(jié)核模型具有治療作用，減少肺、脾結(jié)核分枝桿菌載量，能減輕結(jié)核病變程度。從肺、脾細(xì)菌載量和肺組織病變程度來(lái)看，ag85aDNA、rv1291cDNA、rv1419 DNA組肺、脾組織活菌數(shù)均顯著減少，表明ag85aDNA、rv1291cDNA、rv1419 DNA均能調(diào)動(dòng)機(jī)體免疫力，在體內(nèi)具有一定的抑菌和殺菌作用，能顯著減輕肺病理?yè)p傷。但此次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示的治療效果不如筆者以前的研究報(bào)道[2]；2008年筆者的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，ag85aDNA可減少結(jié)核感染小鼠肺、脾活菌數(shù)達(dá)1.3 lg CFU和1.0 lg CFU，同時(shí)肺部病變程度也明顯減輕。Zhu等[22]報(bào)道ag85bDNA也可減少結(jié)核感染小鼠肺、脾活菌數(shù)達(dá)0.7 lg CFU和1.2 lg CFU，同時(shí)肺部病變程度也減輕。Hu 等[23]聯(lián)合應(yīng)用表達(dá)3種分泌蛋白 Ag85B、MPT64 和 MPT83 的DNA組也能使結(jié)核感染牛的肺菌落數(shù)減少10倍，從而減輕肺部病變。這些報(bào)道均證明，部分結(jié)核分枝桿菌基因克隆在真核表達(dá)載體上對(duì)結(jié)核病具有較好的免疫治療作用，聯(lián)合應(yīng)用能夠獲得更好的療效，這為未來(lái)開(kāi)發(fā)聯(lián)合基因疫苗提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。雖然不同批次的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得的結(jié)果不完全一樣，但經(jīng)過(guò)多次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或臨床應(yīng)用已證明ag85aDNA和微卡菌苗均具有較好的抗結(jié)核效果[2-7, 18-20]；本研究顯示rv1291cDNA、rv1419 DNA的抗結(jié)核療效與ag85aDNA相似，而rv2223cDNA與微卡菌苗相似，盡管本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)未能顯示出微卡菌苗和rv2223cDNA的治療效果，但也不能排除rv2223cDNA具有一定的免疫治療作用。盡管微卡菌苗未表現(xiàn)出明顯減少細(xì)菌載量的作用，但是從微卡菌苗的肺組織病理上看，其病變程度還是比較輕的，是有一定治療作用的，其原因可能在于此次感染小鼠的菌量較大。

總之，筆者新發(fā)現(xiàn)2種結(jié)核分枝桿菌增殖期抗原編碼基因rv1291c、rv1419對(duì)結(jié)核分枝桿菌具有抑制或殺滅作用，能減輕結(jié)核病變程度，對(duì)小鼠結(jié)核感染模型具有治療作用，可作為治療結(jié)核病新疫苗的候選靶標(biāo)，未來(lái)將對(duì)rv1291c、rv1419基因進(jìn)行更深入的研究。

[1] World Health Organization. Global tuberculosis report 2016. Geneva: World Health Organization, 2016.

[2] Liang Y, Wu XQ, Zhang JX, et al. The treatment of mice infected with multi-drug-resistantMycobacteriumtuberculosisusing DNA vaccines or in combination with rifampin. Vaccine, 2008, 26(35):4536-4540.

[3] 吳雪瓊，張俊仙，李洪敏，等. 結(jié)核分枝桿菌Ag85A DNA 疫苗免疫治療作用的研究. 中國(guó)免疫學(xué)雜志, 2002, 18(1):17-22.

[4] Liang Y, Wu X, Zhang J, et al. Treatment of multi-drug-resistant tuberculosis in mice with DNA vaccines alone or in combination with chemotherapeutic drugs. Scand J Immunol, 2011, 74(1):42-46.

[5] 梁艷，吳雪瓊，張俊仙，等. 結(jié)核分枝桿菌Ag85A DNA 疫苗抗結(jié)核作用的研究. 中國(guó)防癆雜志, 2012, 34(3): 181-183.

[6] Ha SJ, Jeon BY, Kim SC, et al. Therapeutic effect of DNA vaccines combined with chemotherapy in a latent infection model after aerosol infection of mice withMycobacteriumtuberculosis. Gene Therapy, 2003, 10(18):1592-1599.

[7] Lowrie DB, Tascon RE, Bonato VLD, et al. Therapy of tuberculosis in mice by DNA vaccination. Nature, 1999, 400(6741):269-271.

[8] Huygen K, Content J, Denis O, et al. Immunogenicity and protective efficacy of a tuberculosis DNA vaccine. Nat Med,1996, 2(8):893-898.

[9] Donnelly JJ, Ulmer JB, Shiver JW, et al. DNA vaccines. Annu Rev Immunol，1997, 15: 617-648.

[10] 吳雪瓊. 結(jié)核分枝桿菌保護(hù)性抗原的研究進(jìn)展. 中華結(jié)核和呼吸雜志, 2006, 29(5): 340-342.

[11] Singh DD, Chandran D, Jeyakani J, et al. Scanning the genome ofMycobacteriumtuberculosisto identify potential lections. Protein pept lett, 2007,14(7): 683-691.

[12] Patra D, Srikalaivani R, Misra A, et al. Cloning, expression, purification, crystallization and preliminary X-ray studies of a secreted lectin (Rv1419) fromMycobacteriumtuberculosis. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun, 2010, 66(Pt 12):1662-1665.

[13] Nogueira L, Cardoso FC, Mattos AM, et al.MycobacteriumtuberculosisRv1419 encodes a secreted 13 kD a lectin with immunological reactivity during human tuberculosis. Eur J Immunol, 2010, 40(3): 744-753.

[14] 劉銀萍, 王全立, 張俊仙, 等. 結(jié)核分枝桿菌 Rv1419 蛋白抗原表位的預(yù)測(cè). 中國(guó)防癆雜志, 2015, 37(1): 52-55.

[15] Paetzel M, Dalbey RE, Strynadka NC. Crystal structure of a bacterial signal peptidase in complex with a beta-lactam inhibitor. Nature, 1998, 396(6707): 186-190.

[16] Lun S, Bishai WR. Characterization of a novel cell wall-anchored protein with carboxylesterase activity required for virulence inMycobacteriumtuberculosis. J Biol Chem, 2007, 282(25): 18348-18356.

[17] McMurry J,Sbai H, Gennaro ML, et al. AnalyzingMycobacteriumtuberculosisproteomes for candidate vaccine epitopes. Tuberculosis, 2005,85(1): 95-105.

[18] 王倩，張潔，黃淑萍，等.母牛分枝桿菌菌苗輔助治療復(fù)治性及耐多藥結(jié)核的Meta分析.中國(guó)藥房, 2008,19(11): 838-841.

[19] 初乃惠，羅永艾，朱莉貞，等. 化療加免疫長(zhǎng)療程方案治療耐多藥結(jié)核病的隨機(jī)對(duì)照研究.中國(guó)防癆雜志, 2009,31(1):10-14.

[20] 范妙儀, 陳雪融, 王可, 等. 母牛分枝桿菌菌苗輔助治療復(fù)治肺結(jié)核的Meta 分析. 中國(guó)循證醫(yī)學(xué)雜志, 2007, 7 (6): 449-455.

[21] Stanford JL, Bahr GM, Rook GA, et al. Immunotherapy withMycobacteriumvaccaeas an adjucant to chemotherapy in the treatment of pulmonary tuberculosis. Tubercle, 1990, 71(2): 87-93.

[22] Zhu DY, Jiang S, Luo XD. Therapeutic effects of Ag85B and MPT64 DNA vaccines in a murine model ofMycobacteriumtuberculosisinfection. Vaccine, 2005, 23(37): 4619-4624.

[23] Hu XD, Chen ST, Yua DH, et al. Immunotherapy with combined DNA vaccines is an effective treatment forM.bovisinfection in cattle. Vaccine, 2009, 27(9): 1317-1322.

(本文編輯：范永德)

A comparative study on four kinds of genes encoding the antigens in proliferation phase againstMycobacteriumtuberculosisinfection in mice

LIANGYan,ZHANGXiao-yan,WANGXiao-mei,SONGJing-ying,BAIXue-juan,YANGYou-rong,ZHANGJun-xian,WANGLan,XIUFei-hong,SHIYing-chang,WUXue-qiong.

ArmyTuberculosisKeyLaboratory,TuberculosisResearchInstitute，the309thHospitalofChinesePLA,Beijing100091,China

WUXue-qiong,Email：wu-xueqiong@263.net

Objective To compare the anti-tuberculosis effects of four kinds of genes encoding the antigens in proliferation phase ofM.tuberculosisin mouse tuberculosis (TB) model, and provide experimental basis for developing new TB immunotherapy agents. Methods Seventy female BALB/c mice were infected via the tail vein with 6.4×105CFUs ofM.tuberculosisH37Rv, then randomly divided into 7 groups and treated as follow at the third day after infection：saline, plasmid vector pVAX1,M.vaccaevaccine,ag85aDNA,rv1291cDNA,rv1419 DNA andrv2223cDNA, which were injected intramuscularly 3 times at two-week intervals. The mice were sacrificed at two weeks after the final immunization. The lungs and spleens from the mice were taken and their pathological changes, weights and number of mycobacterial colony were examined. Data were expressed as means and standard deviations. Results The lung histopathological examination showed that the lesions were severe and extensive in saline group, lighter in plasmid vector pVAX1 group than those in saline group, slight and limited in theM.vaccaevaccine,ag85aDNA,rv1291cDNA,rv1419 DNA andrv2223cDNA groups with relatively clear and normal structure of alveoli. Compared with saline group,ag85aDNA group,rv1291cDNA group andrv1419 DNA group reduced the pulmonary bacterial loads respectively by 0.53 lg CFU, 0.67 lg CFU and 0.41 lg CFU (χ2=27.07，P<0.01); spleen bacterial loads respectively by 0.43 lg CFU (t>3.004,P<0.05), 0.34 lg CFU (t<3.004,P>0.05), and 0.41 lg CFU (t>3.004,P<0.05);M.vaccaevaccine andrv2223cDNA groups also decreased lung and spleen bacterial loads, but there were not significant differences (t<3.004，allP<0.05). ConclusionM.tuberculosisrv1291candrv1419 genes encoding the antigens in proliferation period had better immunotherapeutic effects on TB, which were similar toag85aDNA in mice.Rv2223cDNA had not obvious immunotherapeutic effect.

Mycobacteriumtuberculosis； Bacteriocin plasmids； Genome components； Immunotherapy； Comparative effectiveness research； Animals, laboratory

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.02.005

“十二五”國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)(2012ZX-10003-008)

100091 北京，解放軍第三〇九醫(yī)院全軍結(jié)核病研究所 全軍結(jié)核病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 結(jié)核病診療新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

吳雪瓊，Email：wu-xueqiong@263.net

2016-11-11)