李雨澤 劉玉琴 陳向麗 侯紹英 Hayder 姜輝 李殿忠

·論著·

2型糖尿病并發(fā)肺結(jié)核患者血清中炎癥細(xì)胞因子水平變化的研究

李雨澤 劉玉琴 陳向麗 侯紹英 Hayder 姜輝 李殿忠

目的 探討2型糖尿病并發(fā)肺結(jié)核(type 2 diabetes mellitus complicated with pulmonary tuberculosis，T2DMTB)患者血清中炎癥細(xì)胞因子Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)和脂多糖受體14(lipopolysaccharide receptor 14，LPS受體14；又稱(chēng)CD14)水平的變化。方法 選取2014年9月至2015年6月在黑龍江省傳染病防治院就診的T2DMTB患者40例(T2DMTB組)，2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者40例(T2DM組)，以及體檢科篩查出的健康者40名(對(duì)照組)作為研究對(duì)象。收集研究對(duì)象的人口學(xué)特征資料，并抽取清晨空腹靜脈血3～4 ml。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)研究對(duì)象血清中TLR4和CD14的水平，并進(jìn)行比較。結(jié)果 對(duì)照組、T2DM組和T2DMTB組血清中TLR4水平分別為(10.21±2.29) ng/ml、(19.40±1.80) ng/ml、(15.27±2.52) ng/ml，三組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=76.33，P<0.01)；進(jìn)一步的兩兩比較顯示，T2DM組和T2DMTB組均高于對(duì)照組，T2DMTB組低于T2DM組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01)。對(duì)照組、T2DM組和T2DMTB組血清中CD14水平分別為(9.17±1.62) ng/ml、(16.48±1.54) ng/ml、(10.86±1.65) ng/ml，三組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=113.92，P<0.01)；進(jìn)一步的兩兩比較顯示，T2DM組和T2DMTB組均高于對(duì)照組，T2DMTB組低于T2DM組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01)。結(jié)論 T2DMTB組血清中TLR4和CD14水平高于對(duì)照組，而低于T2DM組；T2DMTB患者血清中TLR4和CD14水平變化，對(duì)T2DMTB的發(fā)病機(jī)制有提示作用。

結(jié)核； 肺； 糖尿病，2型； 炎癥趨化因子類(lèi)； 評(píng)價(jià)研究

結(jié)核病是嚴(yán)重危害公眾健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題，我國(guó)結(jié)核病負(fù)擔(dān)很重，全國(guó)≥15歲人口中活動(dòng)性肺結(jié)核患者預(yù)計(jì)可高達(dá)499萬(wàn)例[1]。文獻(xiàn)報(bào)道顯示，2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者較正常人更容易患肺結(jié)核[2]。2型糖尿病并發(fā)肺結(jié)核(type 2 diabetes mellitus complicated with pulmonary tuberculosis，T2DMTB)患者多表現(xiàn)為肺部病變重、病情進(jìn)展快、原發(fā)耐藥多和預(yù)后差。因此，探索T2DMTB的發(fā)病機(jī)制，尋找T2DM患者中肺結(jié)核高危人群，進(jìn)而早期預(yù)防與治療已成為亟待解決的問(wèn)題。目前認(rèn)為，T2DM是一個(gè)慢性炎癥的病理過(guò)程[3-4]，而肺結(jié)核也是公認(rèn)的慢性感染性疾病。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)是機(jī)體天然免疫屏障中作用機(jī)制最明確的Toll樣家族相關(guān)受體，可在包括巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞及胰島細(xì)胞等在內(nèi)的免疫和非免疫細(xì)胞中表達(dá)，并在天然免疫防御中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5-6]。此外，當(dāng)病原體入侵機(jī)體時(shí)，機(jī)體最先識(shí)別的就是病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMP)，而脂多糖受體14(lipopolysaccharide receptor 14，LPS受體14；又稱(chēng)CD14)已被證實(shí)可以使TLR4與PAMP的親和力增強(qiáng)，從而同樣發(fā)揮免疫防御作用[7-8]。TLR4、CD14水平的改變與健康人群T2DM[9-10]或肺結(jié)核[11-12]患病相關(guān)，但T2DMTB患者這些炎癥細(xì)胞因子水平改變的情況尚不明確。因此，筆者選取我國(guó)東北地區(qū)的漢族人群(人群限定是為后續(xù)基因測(cè)序做準(zhǔn)備)，比較T2DM、T2DMTB及健康人群血清中炎癥細(xì)胞因子TLR4、CD14水平，探討血清炎癥細(xì)胞因子水平的改變與T2DMTB發(fā)病的關(guān)聯(lián)。

對(duì)象和方法

1.對(duì)象：選取2014年9月至2015年6月在黑龍江省傳染病防治院就診的T2DMTB患者40例(T2DMTB組)，T2DM患者40例(T2DM組)，以及體檢科篩查出的健康者40名(對(duì)照組)作為研究對(duì)象。收集研究對(duì)象人口學(xué)特征及相關(guān)臨床檢測(cè)指標(biāo)。研究對(duì)象均抽取清晨空腹靜脈血3～4 ml (使用乙二胺四乙酸抗凝)，分離血清，-20 ℃保存待測(cè)。本研究經(jīng)過(guò)黑龍江省第四醫(yī)院倫理委員會(huì)的審核，研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

2.納入標(biāo)準(zhǔn)：所有研究對(duì)象均為中國(guó)黑龍江省漢族人群(限定“民族”為后續(xù)基因多態(tài)性研究做準(zhǔn)備)，民族判定以現(xiàn)場(chǎng)家族史詢(xún)問(wèn)及身份證為準(zhǔn)。(1)T2DMTB組：研究對(duì)象為已患T2DM且初次診斷為并發(fā)肺結(jié)核患者，其符合T2DM和肺結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)。T2DM的診斷參照文獻(xiàn)[13]，即有明顯的糖尿病典型癥狀(包括多飲、多食、多尿、體質(zhì)量下降)，并滿(mǎn)足以下任意一條件：①任意時(shí)間血糖≥11.1 mmol/L；②空腹血糖≥7.0 mmol/L；③空腹血糖≥7.0 mmol/L且口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(oral glucose tolerance test，OGTT)2 h血糖≥11.1 mmol/L。肺結(jié)核診斷參照文獻(xiàn)[14]。(2)T2DM組：研究對(duì)象符合T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)[13]，且根據(jù)肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)[14]確定未患肺結(jié)核者。(3)對(duì)照組：研究對(duì)象為無(wú)肺結(jié)核既往史、無(wú)糖尿病家族史，生化全項(xiàng)、血常規(guī)、糖化血紅蛋白、尿常規(guī)、尿微量白蛋白等檢查均正常的健康人群。

3.排除標(biāo)準(zhǔn)：并發(fā)艾滋病、病毒性肝炎(乙型和丙型)、梅毒、腫瘤、結(jié)締組織病及其他內(nèi)分泌疾病的患者；非中國(guó)黑龍江省漢族人群。

4.細(xì)胞因子水平測(cè)定：血清中TLR4和CD14采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)進(jìn)行測(cè)定，所用試劑盒均購(gòu)自北京誠(chéng)林生物制品有限公司。不同批次試劑盒無(wú)交叉使用。每次實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品線(xiàn)性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R2均大于 0.99。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行2次，取平均值。

結(jié) 果

1.基本信息：對(duì)照組、T2DM組和T2DMTB組間研究對(duì)象在性別、年齡及身高方面的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 研究對(duì)象人口學(xué)特征在各組間分布情況

2.細(xì)胞因子水平：經(jīng)ELISA檢測(cè)研究對(duì)象血清中TLR4水平，對(duì)照組、T2DM組和T2DMTB組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；血清中CD14水平，3組間差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。進(jìn)一步的組間兩兩比較顯示，血清TLR4水平T2DM組和T2DMTB組均高于對(duì)照組，T2DMTB組低于T2DM組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01)；血清CD14水平，T2DM組和T2DMTB組均高于對(duì)照組，T2DMTB組低于T2DM組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01)。

表2 各組研究對(duì)象血清TLR4和CD14受體水平

討 論

病原體微生物中具有的結(jié)構(gòu)恒定又進(jìn)化比較保守的分子結(jié)構(gòu)被定義為PAMP。PAMP包括LPS、蛋白聚糖(proteoglycan，PG)、脂阿拉伯甘露糖(lipoarabinomannan，LAM)等。TLR4識(shí)別結(jié)核分枝桿菌病原體細(xì)胞壁LAM后觸發(fā)各種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[15]，最終導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生天然免疫。CD14參與并增強(qiáng)了TLR4的識(shí)別和再結(jié)合結(jié)核分枝桿菌的能力。所以，研究TLR4及CD14與T2DMTB發(fā)病的關(guān)系有著非常重要的意義。

本次研究中，各組研究對(duì)象年齡、性別、身高間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，減少了混雜因素。各組研究對(duì)象血清中TLR4水平從低到高依次為對(duì)照組、T2DMTB組及T2DM，其中，T2DM組高于對(duì)照組和T2DMTB組，T2DMTB組高于對(duì)照組。各組血清中CD14水平也具有相同的趨勢(shì)。T2DM組血清中TLR4及CD14水平均高于對(duì)照組也進(jìn)一步證明了T2DM本身就是慢性炎癥過(guò)程。炎性反應(yīng)可以使得Toll樣受體下游核因子κB (nuclear factor-κB，NF-κB)被激活，其活化后又可促進(jìn)腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)轉(zhuǎn)錄，加劇包含胰島細(xì)胞在內(nèi)的氧化應(yīng)激，導(dǎo)致T2DM的發(fā)生[16]。本結(jié)果也與一些其他研究報(bào)道一致。Singh等[17]研究發(fā)現(xiàn)，T2DM患者血清中LPS及TLR4均有升高；楊孟雪等[18]發(fā)現(xiàn)，肥胖糖尿病患者血清中TLR4升高，而且NF-κB被激活，為正反饋炎性反應(yīng)過(guò)程。

TLR4是Toll受體之一，T2DM所導(dǎo)致機(jī)體長(zhǎng)期處于慢性炎性的過(guò)程可能會(huì)使得活性受體數(shù)量減少。CD14不能單獨(dú)激活巨噬細(xì)胞吞噬病原體，而要與其他因子結(jié)合后才能夠增強(qiáng)TLR4功能。所以，這可能是T2DMTB患者TLR4、CD14水平較T2DM患者降低的原因之一。T2DMTB組TLR4和CD14水平雖較T2DM組低，但較對(duì)照組高，說(shuō)明T2DMTB是感染性疾病，患者機(jī)體會(huì)伴隨炎癥反應(yīng)過(guò)程TLR4和CD14水平升高。血清中Toll樣受體家族的TLR4和CD14水平變化提示了TLR4、CD14與T2DMTB發(fā)病有關(guān)，而T2DMTB患者血清中TLR4和CD14水平低于T2DM患者，可能是T2DMTB發(fā)病的關(guān)鍵。

T2DM患者并發(fā)肺結(jié)核會(huì)導(dǎo)致傳染源增多，受威脅人群增多，結(jié)核患病風(fēng)險(xiǎn)增大。同時(shí)，T2DMTB治療和控制也是臨床工作中面臨的新挑戰(zhàn)。本研究的創(chuàng)新之處就是對(duì)T2DMTB的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行探究，并根據(jù)大量臨床及科研經(jīng)驗(yàn)選擇TLR4和CD14對(duì)T2DMTB的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行推斷。但因本研究?jī)H為臨床觀(guān)察性研究，所得證據(jù)強(qiáng)度較弱，僅對(duì)病因有提示作用，無(wú)法深入闡述病因機(jī)制。

單純用環(huán)境因素不僅無(wú)法解釋糖尿病和結(jié)核病兩種看似發(fā)病機(jī)制相互矛盾的疾病能同時(shí)發(fā)生于同一個(gè)機(jī)體的原因，也無(wú)法解釋臨床工作中常見(jiàn)的糖尿病家族成員雖在同一環(huán)境中均有結(jié)核分枝桿菌接觸史，但并不共同患結(jié)核病的現(xiàn)實(shí)。這些實(shí)際工作中的發(fā)現(xiàn)促使我們不得不從遺傳學(xué)方面考慮糖尿病并發(fā)肺結(jié)核的病因?；蚨鄳B(tài)性可以影響基因轉(zhuǎn)錄激活，從而改變細(xì)胞因子的產(chǎn)生水平?；蚨鄳B(tài)性的存在并不會(huì)直接導(dǎo)致某種疾病的發(fā)生，但會(huì)使得個(gè)體在某種特殊環(huán)境或其他危險(xiǎn)因素存在時(shí)疾病易感性發(fā)生改變。因此，筆者下一步將從細(xì)胞因子的基因多態(tài)性層面進(jìn)行研究，以進(jìn)一步探索糖尿病患者結(jié)核病易感性的遺傳學(xué)病因。

[1] 全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組, 全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查辦公室. 2010年全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告. 中國(guó)防癆雜志, 2012, 34(8):485-508.

[2] 羅凱. 肺結(jié)核合并糖尿病的防治. 臨床肺科雜志, 2011, 16(1): 91-92.

[3] Varadaradjalou S, Féger F, Thieblemont N, et al. Toll-like receptor 2 (TLR2) and TLR4 differentially activate human mast cells. Eur J Immunol, 2003, 33(4): 899-906.

[4] Pickup JC, Crook MA. Is type Ⅱ diabetes mellitus a disease of the innate immune system? Diabetologia, 1998, 41(10): 1241-1248.

[5] Medzhitov R, Preston-Hurlburt P, Janeway CA Jr. A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity. Nature, 1997, 388 (6640): 394-397.

[6] Takeda K, Akira S. TLR signaling pathways. Semin Immunol, 2004, 16(1):3-9.

[7] Shimazu R, Akashi S, Ogata H, et al. MD-2, a molecule that confers lipopolysaccharide responsiveness on Toll-like receptor 4. J Exp Med, 1999, 189(11): 1777-1782.

[8] Andrade BB, Singh A, Narendran G, et al. Mycobacterial antigen driven activation of CD14++CD16-monocytes is a predictor of tuberculosis-associated immune reconstitution inflammatory syndrome. PLoS Pathog, 2014, 10(10): e1004433.

[9] Hotamisligil GS. Inflammation and metabolic disorders. Nature, 2006, 444(7121): 860-867.

[10] Lumeng CN, Deyoung SM, Bodzin JL, et al. Increased inflammatory properties of adipose tissue macrophages recruited during diet-induced obesity. Diabetes, 2007, 56(1): 16-23.

[11] Reiling N, H?lscher C, Fehrenbach A, et al. Cutting edge: Toll-like receptor (TLR)2- and TLR4-mediated pathogen recognition in resistance to airborne infection withMycobacteriumtuberculosis. J Immunol, 2002, 169(7): 3480-3484.

[12] 吳語(yǔ)寧. 人結(jié)核病患者血清特異性抗體與CD14基因多態(tài)性相關(guān)性的初步研究. 長(zhǎng)春:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué), 2013.

[13] 錢(qián)榮立. 關(guān)于糖尿病的新診斷標(biāo)準(zhǔn)與分型. 中國(guó)糖尿病雜志, 2000, 8(1): 5-6.

[14] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部. 肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS288-200). 北京: 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部, 2008.

[15] Strohmeier GR, Fenton MJ. Roles of lipoarabinomannan in the pathogenesis of tuberculosis. Microbes Infect, 1999, 1(9): 709-717.

[16] Kaisho T, Akira S. Toll-like receptor function and signaling. J Allergy Clin Immunol, 2006, 117 (5): 979-987.

[17] Singh A, Boden G, Rao AK. Tissue factor and Toll-like receptor (TLR) 4 in hyperglycaemia-hyperinsulinaemia. Effects in healthy subjects, and type 1 and type 2 diabetes mellitus. Thromb Haemost, 2015, 113(4): 750-758.

[18] 楊孟雪, 楊波, 李顯文, 等. 肥胖癥伴糖尿病患者血清對(duì)人源單核細(xì)胞TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響. 中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2014, 39(9): 917-923.

(本文編輯：李敬文)

Association between serum levels of inflammatory cytokines toll-like receptor 4 and lipopolysaccharide receptor 14 and occurrence of type 2 diabetes mellitus complicated with pulmonary tuberculosis

LIYu-ze*,LIUYu-qin,CHENXiang-li,HOUShao-ying,Hayder,JIANGHui,LIDian-zhong.

*HeilongjiangProvincialTuberculosisControlCenter,Harbin150500,China

s:JIANGHui,Email：jianghui7722@163.com;LIDian-zhong,Email：lidianzhong2010@163.com

Objective To investigate the relationship between serum levels of inflammatory cytokines Toll-Like receptor 4 (TLR4), lipopolysaccharide receptor 14 (LPS receptor) and type 2 diabetes mellitus complicated with tuberculosis (T2DMTB). Methods We recruited 40 cases with T2DMTB and type 2 diabetes mellitus (T2DM) respectively, and 40 cases of healthy people from the Heilongjiang province fourth hospital between September 2014 and June 2015. The demographic characteristics of the subjects were collected. In addition, 3 to 4 ml venous blood was collected in the early morning. The serum levels of TLR4 and CD14 were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and compared. Results The serum grades of TLR4 in the control group, T2DM group and T2DMTB group were (10.21±2.29) ng/ml, (19.40±1.80) ng/ml and (15.27±2.52) ng/ml, respectively. The differences among the three groups were significant (F=76.33,P<0.01). The serum grades of CD14 in the control group, T2DM group and T2DMTB group were (9.17±1.62) ng/ml, (16.48±1.54) ng/ml and (10.86±1.65) ng/ml, respectively. The differences among the three groups were significant (F=113.92,P<0.01). The serum grades of TLR4 and CD14 in T2DM and T2DMTB groups were significantly higher than healthy control group, but the serum levels of TLR4 and CD14 in T2DMTB group was significantly by compared with T2DM group (P<0.05). Conclusion The serum levels of TLR4 and CD14 in T2DMTB group were higher than those in control group, but lower than that in T2DM group. The changes of the serum levels of TLR4 and CD14 with T2DMTB suggest that they play an important prompt role on the pathogenesis of T2DMTB.

Tuberculosis； Pulmonary； Diabetes mellitus； Type 2； Chemokines； Evaluation studies

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.02.008

黑龍江省衛(wèi)生廳科研項(xiàng)目(2012-432)

150500 哈爾濱，黑龍江省傳染病防治院(李雨澤、劉玉琴、姜輝、李殿忠)；哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院[陳向麗(碩士研究生)、侯紹英]；哈爾濱工業(yè)大學(xué)[Hayder(伊拉克籍碩士研究生)]

姜輝，Email：jianghui7722@163.com；李殿忠，Email：lidianzhong2010@163.com

2016-11-13)