羊腐蹄病診斷及防治方法研究進展

李穩(wěn)欣，馬利青，薛慧文，王光華

(1.青海大學畜牧獸醫(yī)科學院，青海西寧 810016；2.甘肅農業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅蘭州 730070)

文獻綜述

羊腐蹄病診斷及防治方法研究進展

李穩(wěn)欣1,2，馬利青1*，薛慧文2*，王光華1

(1.青海大學畜牧獸醫(yī)科學院，青海西寧 810016；2.甘肅農業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅蘭州 730070)

腐蹄病又稱蹄間腐爛或趾間腐爛，是一類引起反芻動物蹄部感染的傳染病，以跛行、指(趾)間皮膚腫脹和炎癥為主要特征。隨著集約化養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，羊腐蹄病發(fā)病率日益增加，給養(yǎng)羊業(yè)帶來巨大的經濟損失，嚴重制約著養(yǎng)羊業(yè)的健康快速發(fā)展。但到目前為止，國內學者對羊腐蹄病的診斷與防治方面總結性的報道較少。因此，根據實際情況制定出快速診斷和防治方法顯得非常重要。論文以近年來國內外最新的研究資料為基礎，從羊腐蹄病病原、臨床癥狀、診斷和防治方法等方面進行綜述,以期為羊腐蹄病診斷和防治提供參考。

腐蹄?。慌R床癥狀；診斷；防治方法

1960年Adams首次發(fā)現腐蹄病，此后該病在美國、比利時、荷蘭和澳大利亞等多個國家相繼報道[1]。我國牛、羊腐蹄病的發(fā)病率也在8%～50%之間[2]。據報道，羊群一旦發(fā)生此病，感染率可達80%～90%，還可傳染給正在發(fā)育的羔羊，嚴重的將被淘汰，該病已經成為危害反芻動物養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要疾病之一，世界許多畜牧業(yè)發(fā)達的國家將此病作為重要的傳染病進行防控。在中國，夏秋季是該病高發(fā)期，尤其是在濕地草場養(yǎng)殖的畜群，牛羊發(fā)病率顯著高于干燥草場養(yǎng)殖的畜群[3]。羊只感染該病會出現蹄部膿腫，蹄匣變性，隨后出現跛行、厭食、長臥不起等癥狀，處理不當會傳染圈舍其他羊只，嚴重影響?zhàn)B羊業(yè)發(fā)展。

目前，國內外對腐蹄病的診斷方法除了臨床診斷、病原學診斷和血清學診斷外，聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)、環(huán)介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification method,LAMP)和熒光原位雜交探針技術(fluorescence in situ hybridization,FISH)等分子生物學診斷方法也陸續(xù)應用到了對該病病原以及細菌型的鑒定。本文就近幾年國內外關于羊腐蹄病病原檢測技術和防治方法進行綜述。

1 病原

1.1 壞死桿菌

大多數研究人員認為腐蹄病主要是由壞死桿菌和節(jié)瘤擬桿菌協同感染引起[4]。壞死桿菌包括兩個亞種，一種是能夠引起動物腐蹄病的Fusobacteriumnecrophorumsubsp.necrophorum亞種(Fnn)，該亞種能產生大量白細胞毒素和溶血素；另一種是接種動物后不能引起動物腐蹄病的Fusobacteriumfunduliformesubsp.funduliforme亞種(Fnf)。壞死桿菌主要基因型有A型、B型和AB型：A型即Fnn亞種，是一種動物源型病原菌，B型即Fnf亞種，是一類人源型病原菌，而AB型的生物學特性介于前兩者之間，A型和AB型所分泌的白細胞毒素和溶血素比B型多，這可能是A型比B型毒性更大，對肝臟等組織器官損傷更為嚴重的主要原因。壞死桿菌的毒力因子有很多，包括對中性粒細胞、巨噬細胞、肝細胞和瘤胃上皮細胞有毒性的白細胞毒素(leukotoxin)、破壞細胞蛋白的血小板凝集素(platelet aggregation factor)、溶解動物紅細胞的溶血素(hemolysin)、損壞上皮細胞的皮膚壞死毒素(dermonecrotic toxin)、胞外酶(extracellular enzymes)、黏附素(adhesins)和具有裂解牛Ⅱ型膠原蛋白能力的溶膠原活性蛋白(collagenolytic protein)等。其中白細胞毒素是引起腐蹄病的主要毒力因子[5-6]，操縱子包括3個基因，分別是lktA、lktB和lktC，其中結構性基因為lktA基因，是一段由3 241個核苷酸組成的蛋白質，該細菌的外毒素分子質量比任何已知的溶血性巴氏桿菌、放線菌和金黃色葡萄球菌的細菌外毒素分子質量都大。因此，壞死桿菌中A型所分泌的白細胞毒素(lktA)是腐蹄病壞死桿菌檢測和疫苗研究的重要靶蛋白。

1.2 節(jié)瘤擬桿菌

節(jié)瘤擬桿菌(Dichelobacternodosus)歸屬擬桿菌科(Bacteroidaceae)擬桿菌屬(Bacteroides)。該菌存在多個血清型，全世界范圍內分布不一，一個動物群體可能存在該菌多個血清群。節(jié)瘤擬桿菌的致病因子是其表面的細胞外蛋白酶和極性纖毛，其毒力強弱與其分泌的蛋白溶解酶有一定關系，擁有強毒性的菌株所分泌的蛋白溶解酶可以損傷所侵入部位的蛋白組織[7]。節(jié)瘤擬桿菌主要侵害受感染動物蹄部，能分泌一種彈性蛋白，菌株的毒力越強，彈性蛋白分泌能力就越強，該蛋白軟化蹄角質，造成蹄部淺表炎癥，使蹄部的皮膚表層及其基層完整性受損，為壞死桿菌的入侵和感染提供便利條件。由于纖毛蛋白是該菌體的主要保護性抗原，是血清型分群依據，因而針對纖毛蛋白開展的研究工作較多。到目前為止，GenBank檢索D.nodosus纖毛蛋白基因序列共有77條。按血清群A、B、C、D、E、F、G、H、I和M歸類來自不同菌株的纖毛蛋白基因序列，這些序列在測序和注釋后，錄入核酸數據庫，豐富了纖毛序列的核酸序列數據，為通過序列比較分析，準確設計保守性引物，開展D.nodosus分子生物學檢測提供了條件。Bennett G等[8]研究報告顯示，在羊的腐蹄病病例中，節(jié)瘤擬桿菌約占60%，壞死桿菌約占30%。然而有其他學者認為，在羊的腐蹄病病例中，壞死桿菌的感染占40%左右，而節(jié)瘤擬桿菌的感染占30.7%左右。以上數據雖有所不同，但二者表明壞死桿菌和節(jié)瘤擬桿菌是感染羊腐蹄病的主要病原菌。

1.3 其他相關病原

很多研究者認為，腐蹄病是由多種微生物引起的疾病，在羊的腐蹄病病例中可分離到普雷沃菌(Prevotella)和卟啉單胞菌(Porphyromonas)；與腐蹄病相關的細菌還有微球菌(Micrococcus)、糞彎桿菌(Campylobacter)、變形桿菌(Proteusbacillusvulgaris)、葡萄球菌(Staphylococcus)、大腸埃希菌(Escherichiacoli)、鏈球菌(Streptococcus)、沙門菌(Salmonella)和化膿棒狀桿菌(Corynebacteriumpyogenes)等病原微生物[9-10]。由于羊蹄部長期暴露于外界環(huán)境中，環(huán)境中病原菌又復雜多樣，尤其在夏季患羊被蚊蠅叮咬，細菌和蠅蛆孳生常使患部不斷擴大惡化，致使病情加重。草料中的鈣、磷不平衡，維生素缺乏，導致角質疏松，蹄部變形，以及因飼養(yǎng)管理員對羊蹄部長期不修正，都會給腐蹄病的病原菌侵入提供機會。

2 臨床診斷

2.1 臨床癥狀

本病潛伏期1 d～3 d，從感染到發(fā)病的幾小時后，患病動物可出現單肢跛行，多數發(fā)生在后肢趾間隙和蹄冠部，按壓時患畜出現嚴重的疼痛反應并伴有發(fā)熱、腫脹等癥狀，喜臥不愿站立，局部檢查可見病畜蹄關節(jié)彎曲，蹄趾皮膚充血、腫脹，嚴重的可以引起球關節(jié)炎、蹄關節(jié)炎和蹄匣脫落等，一般患畜的體溫會輕微升高，有時可高達到40℃～41℃；患羊精神沉郁、食欲廢絕、體重下降、生產能力喪失和蹄殼脫落；如果不及時治療，病畜出現嚴重的全身癥狀后，有可能導致患病動物的死亡。

2.2 病理變化

被感染的病畜趾間隙皮膚表層濕潤，并附有一層氣味難聞的灰白色黏液，患畜感染3 d～4 d后，蹄部的被毛開始脫落，8 d～9 d后，病變逐步蔓延，可至蹄匣內壁底層的蹄角處，形成囊腫，致使患蹄的蹄角層與真皮層分離；嚴重時，炎癥可蔓延到患蹄的內外兩側壁，蹄角層的角質變得很薄極易從真皮層脫落。不過，此時的損傷只是局限在蹄部軟組織和真皮層；局部組織也會出現壞死，有的會形成肉芽組織，表面會機化或鈣化。大多數病死于蹄趾間患有腐爛病的動物，除了體表有病變外，有的也會在內臟器官上出現蔓延性或轉移性壞死灶，一般在肺臟器官內出現大小不一，數量不等，圓形質地堅硬，切面干燥，灰黃色結節(jié)?；谏鲜霭Y狀可以做出初步診斷。

3 實驗室診斷

3.1 病原分離鑒定

壞死桿菌和節(jié)瘤擬桿菌的培養(yǎng)條件苛刻，分離純化的難度大，必須進行嚴格的厭氧培養(yǎng)。目前，常用于分離兩種菌的培養(yǎng)基有哥倫比亞血平板、MEB固體培養(yǎng)基、卵黃培養(yǎng)基等；用于增菌的培養(yǎng)基有改良的MEB液體培養(yǎng)基、腦心浸液肉湯培養(yǎng)基、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基等。分離、純化好的壞死桿菌經革蘭染色，光學顯微鏡下呈現紅色，長絲狀，寬0.5 μm～1.75 μm，長100 μm～300 μm，經增菌培養(yǎng)傳代后，菌體長度縮短，直到為長桿狀后，基本不變。固體培養(yǎng)基生長菌，短桿狀或球狀菌菌體最常見。節(jié)瘤擬桿菌為革蘭陰性桿菌，光學顯微鏡下可見細菌一端、兩端或多處膨大，菌體平直或稍彎曲，大小是1 μm～1.7 μm×3 μm～6 μm。

3.2 血清學診斷

具有快速、敏感和高通量檢測等優(yōu)點的血清學診斷技術逐漸在腐蹄病病原診斷上得到廣泛應用。郭東華等[11]通過免疫試驗證實，壞死桿菌白細胞介素重組蛋白PL2可以介導小鼠產生很高水平的抗體。Guo D H等[12]也利用壞死桿菌中白細胞介素PL2重組蛋白作為抗原，建立了檢測奶牛腐蹄病壞死桿菌抗體的間接ELISA，并通過試驗證實，該方法具有較高特異性和敏感性，在腐蹄病壞死桿菌早期診斷中發(fā)揮潛在應用價值。Dhungyel O P等[13]曾用節(jié)瘤擬桿菌菌毛抗原作為ELISA診斷抗原進行了綿羊毒性腐蹄病的血清型診斷。

3.3 分子生物學診斷

為了滿足試驗的需求，基因探針和PCR等分子生物學診斷技術迅速發(fā)展并在動物病原診斷中廣泛運用，為腐蹄病病原早期診斷提供依據。

3.3.1 聚合酶鏈反應(PCR) 為了更準確的區(qū)分壞死桿菌和節(jié)瘤擬桿菌的血清型，國內外學者開始根據兩者特異性的基因設計引物，建立準確、快速的PCR檢測方法。其中，卲西群[14]根據不同基因型的特異性片段設計相應引物，篩選出節(jié)瘤擬桿菌基因型，建立了節(jié)瘤擬桿菌早期PCR診斷方法。姚志利等[15]根據壞死梭桿菌毒力因子白細胞毒素啟動子區(qū)的特異性序列設計了3條引物，建立了雙重PCR檢測方法對壞死梭桿菌進行分型檢測。Witcomb L A等[16]以壞死桿菌rpoB的和節(jié)瘤擬桿菌的rpoD基因設計引物并使用TaqMan○R探針建立了實時熒光定量PCR的檢測方法。目前，Kumar A等[6]、Farooq S等[4]、Sullivan L E等[17]和孫東波等[18]以壞死桿菌的16 S rRNA、白細胞毒素、溶血素等主要基因設計引物，在分子生物學水平上對壞死桿菌做出了檢測。李林等[19]、Farooq S等[4]、Vinod K N[20-21]、Frosth S[15]和locher I[22]等針對節(jié)瘤擬桿菌的纖毛蛋白、16 S rRNA、intA蛋白基因和AprV2/B2基因設計特異性引物對節(jié)瘤擬桿菌進行分子生物學檢測。

3.3.2 環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP) PCR雖然操作簡單，擴增產物也在很短時間內聚集，但需價值昂貴的試劑及PCR儀，并不適合基層臨床檢測。而LAMP能識別靶序列6個位點的4條特異性引物和具有鏈置換功能的BstDNA聚合酶，恒溫條件下可以快速擴增靶基因。試驗結果可通過肉眼觀察，也可通過瓊脂糖凝膠電泳來觀察目的條帶。該技術具有特異性強、靈敏度高、等溫高效、操作簡單等特點。Sun D B等[23-24]根據壞死桿菌白細胞介素基因設計引物建立了檢測奶牛腐蹄病壞死桿菌的Fn-LAMP檢測方法，以節(jié)瘤擬桿菌16 S rRNA作為擴增靶基因設計引物建立了檢測節(jié)瘤擬桿菌的Dn-LAMP檢測方法。因擴增產物具有可視化特點，所以，在臨床病原的檢測中得到廣泛應用。

3.3.3 斑點雜交和熒光原位雜交檢測方法 核酸探針技術是一種快速、靈敏和特異的檢測方法，能特異性地與待測樣品中特定DNA或RNA發(fā)生雜交反應，然后通過顯色確定檢測結果。姚志利根據壞死桿菌rpoB基因設計了一對589 bp的特異性引物，在分子水平上建立了檢測致病性壞死桿菌的斑點雜交檢測方法，該方法具有較高特異性，能鑒定壞死桿菌種屬。試驗通過對28份臨床樣本的檢測，其檢出率為60.7%，如果每個斑點點5 μL DNA樣品時，其最低檢測濃度為1×10-2pg/μL。Witcomb L A等[25-26]先后采用熒光原位雜交探針技術檢測節(jié)瘤擬桿菌和壞死桿菌，并通過熒光標記探針準確檢測血液和組織中微量的壞死桿菌和節(jié)瘤擬桿菌，從而解決了分離培養(yǎng)時細菌生長緩慢的難題。

3.4 鑒別診斷

羊腐蹄病要與臨床上癥狀較相似的口蹄疫、蹄膿腫、蹄葉炎、蹄白線裂以及其他非特異性的化膿菌感染的疾病加以鑒別診斷。口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的豬、牛、羊等偶蹄動物感染的一類在口腔黏膜以及乳房等部位發(fā)生炎癥和不同程度水皰或爛斑的傳染病，一般發(fā)病呈“大流行性”，潛伏期1 d～7 d。而羊腐蹄病主要感染羊蹄部角質層和蹄部軟組織，并不引起口腔病變。蹄膿腫是由壞死桿菌和化膿棒狀桿菌引起豬、牛、羊等易感動物蹄部腫爛，發(fā)生進行性壞死，引起蹄匣脫落的一類疾病。且蹄膿腫僅感染趾，常呈散發(fā)，一年四季均可發(fā)生。而羊腐蹄病多發(fā)于地面潮濕、多雨的夏秋季節(jié)。蹄葉炎是由變態(tài)反應引起，也可由蹄部血液循環(huán)障礙或外傷引起，常感染馬、牛、羊等動物，其蹄壁前半部的真皮小葉層及血管層呈彌漫性、無菌性炎癥，指動脈亢進，蹄壁增溫，叩壓蹄尖壁有疼痛反應。

4 防治方法

4.1 常規(guī)防治

患病初期，對患病羊只隔離，清掃圈舍，保持圈舍干燥。先用清水洗凈患羊蹄部滲出的污物，揭掉表層壞死腐爛的角質層，然后用20 g/L～3 g/L甲酚皂溶液清洗消毒患部，涂上磺胺軟膏，再用紗布包扎，取得了較好的治療效果。針對急性嚴重性病例，用慶大霉素、頭孢唑林、紅霉素和磺胺類等抗菌藥物進行全身防治以防敗血癥發(fā)生，同時聯合服用鋅制劑。有報道證實，羊腐蹄病發(fā)生與鋅和鈣缺乏有關。日糧中添加氨基酸鰲合鋅的飼料添加劑來飼喂家畜會大大降低蹄部疾病發(fā)生。目前，最常用的方法是用100 g/L硫酸銅、100 g/L硫酸鋅和1 g/L高錳酸鉀等進行蹄部藥浴。也有人采用涌泉穴封閉療法和中藥療法來預防和治療腐蹄病的發(fā)生，并取得了一定的療效[27]。

4.2 免疫預防

羊腐蹄病滅活苗、重組亞單位疫苗和基因工程苗已取得了顯著成效。Narayanan S K等[28]利用壞死桿菌白細胞介素基因研制出了羊腐蹄病疫苗，該疫苗對小鼠有很好的免疫保護作用。郭東華等[11，29]用大腸埃希菌表達系統(tǒng)表達并純化了壞死桿菌白細胞介素的5種蛋白，并通過免疫小鼠試驗證實，這5種重組蛋白和天然的白細胞介素都可介導小鼠產生抗白細胞介素的特異性抗體，并且抗體效價可達1∶12 800。呂思文[30]以腐蹄病壞死梭桿菌主要的毒力因子溶血素(hly)、lktA和43K外膜蛋白為研究對象，篩選出三者的抗原表位區(qū)，為后期制備多個抗原表位區(qū)相互結合的保護性抗原提供了理論基礎。吳洪超等[31-32]將壞死桿菌白細胞介素中的具有抗原性的兩個基因BSBSE、SH構建成Pet32a-BSBSE-SH表達載體，并成功在大腸埃希菌中融合表達，純化后加入佐劑制成壞死桿菌白細胞介素重組亞單位疫苗，同時又根據壞死桿菌血凝素相關外膜蛋白基因上的抗原表位設計引物，用擴增出的片段構建重組表達質粒pET-28a-p1、pET-32a-p2和pET-32a-p3，并在大腸埃希菌中誘導表達，通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和免疫印跡法(Western blot,WB)分析蛋白的表達情況和反應原性；以純化的重組蛋白為抗原免疫注射試驗兔，可以刺激兔產生特異性抗體，說明壞死桿菌血凝素相關外膜蛋白具有很好的免疫原性，為今后融合重組亞單位疫苗的研制提供基礎性依據。廖黨金等[33]采用奶牛壞死桿菌制劑預防綿羊腐蹄病取得顯著的效果。國內研制出的E型節(jié)瘤擬桿菌的纖毛蛋白基因和IL-2(白細胞介素2)融合基因的工程苗和C型節(jié)瘤擬桿菌基因工程苗，在羊群上有較好的免疫保護性。Gurng R B等[34]根據節(jié)瘤擬桿菌篩選出來的毒力菌株制備節(jié)瘤擬桿菌二價苗來免疫羊只，并通過對照試驗證實該疫苗具有很高的免疫原性。Bennett G N等[35]也首次將反向疫苗學技術應用到腐蹄病免疫預防上。就目前而言，重組亞單位疫苗、基因工程苗和反向疫苗學的研制技術還不夠成熟。因此，制備高效、安全的疫苗有待進一步研究。

5 結語

綜上所述，國內外學者在腐蹄病的病原學、臨床診斷、實驗室診斷以及防治方面已經開展了深入的研究。目前PCR、實時熒光定量PCR、LAMP及核酸探針等檢測方法已經開始應用于該病的精確診斷。在防治方法方面除加強日常飼養(yǎng)管理、提供全價日糧、定期修剪蹄部、搞好環(huán)境衛(wèi)生外，應用現代分子生物學技術，研制高效安全疫苗和新獸藥是發(fā)展趨勢，相信通過疫苗預防、營養(yǎng)調節(jié)、衛(wèi)生環(huán)境的改善、精確診斷以及合理用藥等綜合防治措施的實施，可有效減少該病的發(fā)病率，從而保障養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

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Progress on Diagnosis,Prevention and Treatment Methods of Footrot in Sheep

LI Wen-xin1,2,，MA Li-qing1，XUE Hui-wen2，WANG Guang-hua1

(1.QinghaiAcademyofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,QinghaiUniversity,Xining,Qinghai,810016,China；2.CollegeofVeterinaryMedicine,GansuAgricultureUniversity,Lanzhou,Gansu,730070,China)

Footrot,also called as decay between toes or hoofs is a infectious disease of ruminants characterized by lameness,swelling and inflammation of foot skin.With the rapid development of intensive livestock farming,the morbidity of sheep due to footrot is becoming increasingly serious.It can cause immeasurable economic loss and imposes serious restrictions on the sheep industry and development.Therefore,it is very important to develop quick diagnostic and prevention methods for this disease.However,there are few conclusive reports on this field in China.Based on the latest international and domestic research works,the pathogens,clinical symptoms,diagnosis,prophylaxis and treatment methods of sheep footrot were summarized.

footrot;clinical symptom;diagnosis;prevention and treatment method

2016-08-16

國家農業(yè)產業(yè)技術體系項目(CARS-40-4B)

李穩(wěn)欣(1989-)，女，河南開封人，碩士研究生，主要從事動物疫病相關研究。*通訊作者

S857.119;S857.165

A

1007-5038(2017)03-0097-05