萊氏野村菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基的正交優(yōu)化設(shè)計

楊淑儀+王彥+管清真+陶新娉+劉守柱

摘要：研究不同碳源和氮源對萊氏野村菌[Nomuraea rileyi （Farlow） Samson]培養(yǎng)性狀的影響，并篩選出產(chǎn)孢能力最強的培養(yǎng)基。以SMAY為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別更換碳源和氮源，研究培養(yǎng)性狀的差異；采用正交試驗對碳源和氮源含量進行優(yōu)化。結(jié)果表明，不同碳源對萊氏野村菌有不同的作用，單糖類碳源有利于產(chǎn)孢，多糖類碳源有利于菌落生長，最有利于產(chǎn)孢的碳源是葡萄糖；酵母提取物是最有利于萊氏野村菌產(chǎn)孢的氮源，蛋白胨是最有利于菌落生長的氮源，蠶蛹粉與酵母提取物聯(lián)合使用對產(chǎn)孢能力有增效作用。最有利于萊氏野村菌產(chǎn)孢的培養(yǎng)基組成為葡萄糖0.4%+酵母提取物1.6%+蠶蛹粉0.4%。

關(guān)鍵詞：萊氏野村菌[Nomuraea rileyi （Farlow） Samson]；正交試驗；產(chǎn)孢培養(yǎng)基

中圖分類號：Q939.95 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）23-6164-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.23.040

Abstract：The effects of different carbon and nitrogen sources on the cultural characteristics of Nomuraea rileyi were studied， and the best media for the sporulation was screened out. Taking SMAY as basic media， the different cultural characteristics of N. rileyi was compared by replacing different carbon and nitrogen sources， and the best combination of carbon and nitrogen by orthogonal test was screened out. The results showed that different type of carbon source has the different effect on N. rileyi. Monosaccharide is beneficial to the sporulation， while polysaccharide is suitable for the colony growth， and the best carbon source for sporulation is glucose. As nitrogen source， yeast extracts is the best nitrogen to the sporulation， while peptone is good to the colony growth. There is a significant synergism effect when yeast extracts combined with silkworm pupae powder. The best media for the sporulation of N. rileyi is glucose 0.4%+yeast extracts 1.6%+silkworm pupae powder 0.4%.

Key words： Nomuraea rileyi； orthogonal design； cultural media； sporulation

萊氏野村菌[Nomuraea rileyi （Farlow） Samson]是一種全世界廣泛分布的昆蟲病原真菌（entomopathogenic fungi），對多種農(nóng)業(yè)害蟲都有很好的控制作用，尤其對鱗翅目夜蛾科害蟲具有更強的寄生能力[1]。相較于另外兩種被廣泛應(yīng)用的蟲生真菌金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae）和球孢白僵菌（Beauveria bassiana），N. rileyi更容易在田間引起害蟲疾病的流行，因而在自然環(huán)境中經(jīng)常能發(fā)現(xiàn)被萊氏野村菌感染死亡的罹病蟲體。在溫度、濕度適宜的條件下，N. rileyi可有效降低害蟲的種群數(shù)量，國外已有多次應(yīng)用成功的報道[2，3]。相對而言，中國對N. rileyi的開發(fā)利用依然較為薄弱。

大部分真菌的研究工作都需要對真菌進行室內(nèi)人工培養(yǎng)，且不同真菌對培養(yǎng)基的養(yǎng)分組成要求差異較大。培養(yǎng)N. rileyi一般采用薩氏麥芽糖酵母瓊脂培養(yǎng)基（Sabouraud maltose agar supplemented yeast extract，SMAY），該種培養(yǎng)基在真菌的菌絲生長、產(chǎn)孢量、產(chǎn)孢速度等方面較為均衡，但生長周期較長，產(chǎn)孢量較低，更換合適的碳源及氮源后，則可以提高產(chǎn)孢速度及產(chǎn)孢量[4]，說明碳源和氮源的選擇對N. rileyi的生物學特性有極大的影響。不同的菌株亦可能對碳源和氮源有不同的反應(yīng)，如適宜萊氏野村菌MZ060806菌落生長的最佳碳源是蔗糖，最佳氮源是水解酪蛋白[5]，適宜Nr16菌落生長的最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源是酵母浸膏[6]，說明針對不同的菌株，其最優(yōu)培養(yǎng)基的組成成分有所不同。鑒于此，為了更好地開展對N.rileyi的相關(guān)研究，針對一株來源于美國的菌株Nr5772進行了培養(yǎng)基的優(yōu)化設(shè)計及組分篩選。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

萊氏野村菌Nr5772，由美國佛羅里達大學昆蟲病理研究室Drion G. Boucias教授提供，接種在SMAY平板培養(yǎng)基上，每隔1個月轉(zhuǎn)接一次，保存于4 ℃冰箱中備用。

1.2 培養(yǎng)基制備

以SMAY培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基（麥芽糖1%，酵母浸膏1%，蛋白胨1%，瓊脂粉1.2%），分別更換不同的碳源和氮源，制作不同組分的平板，每種平板各做3皿，置于無菌操作室中過夜后接種。

1.2.1 碳源選擇 單糖類選擇常見的葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖，二糖類選擇蔗糖、乳糖、海藻糖，多糖類選擇支鏈淀粉、纖維素、甲殼素，分別替代SMAY中的麥芽糖，含量1%，制作成不同碳源的培養(yǎng)基平板。

1.2.2 氮源選擇 SMAY的碳源不變，分別以酵母提取物、蛋白胨、尿素、魚粉、蠶蛹粉作為氮源，各組分含量均為1%；另設(shè)酵母提取物+魚粉、酵母提取物+蠶蛹粉作為復(fù)合氮源，制作成不同氮源的平板，以SMAY培養(yǎng)基作為對照。

1.2.3 碳源和氮源的正交優(yōu)化設(shè)計 試驗篩選出最佳的碳源和氮源后，選擇3種組分，每種組分含量設(shè)置為0.4%、1.0%、1.6%，采用L9（34）正交表進行三因素三水平正交試驗，優(yōu)化培養(yǎng)基組成比例。

1.3 菌落接種及數(shù)據(jù)測量

將Nr5772孢子粉用含0.1%吐溫-80的無菌水稀釋成8×106個孢子/mL的孢子懸浮液，用10 μL移液槍垂直接種到平板表面，并盡量使液滴擴散成圓形，每皿接種3滴，各處理接種3皿。接種3 h后移入光照培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)（25 ℃，L∶D=12∶12），3 d后采用十字交叉法測量各菌斑的直徑作為菌落的原始直徑，12 d后測量菌落直徑的增長情況；15 d時沿菌落邊緣取下已產(chǎn)孢的菌落，移入10 mL離心管中，加入5 mL含0.1%吐溫-80的無菌水，玻璃棒勻漿后，用血球計數(shù)板計量孢子濃度，以此作為產(chǎn)孢量。各處理重復(fù)測定3次。試驗過程中，每天觀察菌落的生長情況，并記錄產(chǎn)孢時間。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進行方差分析，正交試驗結(jié)果采用單變量一般線性模型進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對Nr5772生長的影響

接種后經(jīng)觀察，Nr5772在不同碳源的培養(yǎng)基上生長狀況不一樣。從表1可以看出，大部分培養(yǎng)基在5 d時已經(jīng)開始產(chǎn)孢，半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖為碳源的產(chǎn)孢較慢，其中甘露糖為碳源的僅個別菌落邊緣有孢子產(chǎn)生，直到12 d時仍未大量產(chǎn)孢。從菌落直徑增長率來看，單糖類碳源對Nr5772營養(yǎng)生長的促進作用較弱，增長率在68.70%～146.28%之間；二糖類碳源菌落直徑的增長率在165.52%～187.18%之間；多糖類菌落直徑的增長率在184.13%～200.00%之間，對營養(yǎng)生長的促進作用最明顯。由此可以看出，不同類型的碳源對Nr5772的營養(yǎng)生長效應(yīng)不同，多糖效果最好，單糖效果最差。從各培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量來看，情況正好相反，單糖培養(yǎng)基的產(chǎn)孢能力好于多糖培養(yǎng)基，其中葡萄糖培養(yǎng)基的產(chǎn)孢能力最好，產(chǎn)孢量達4.85×108個孢子/mL，其次是二糖類培養(yǎng)基。Nr5772在不同碳源培養(yǎng)基中的生長狀況見圖1。

2.2 不同氮源對Nr5772生長的影響

不同氮源對萊氏野村菌Nr5772的生長具有明顯不同的效應(yīng)（表2、圖2）。對Nr5772營養(yǎng)生長最有效的氮源是蛋白胨，明顯好于酵母提取物，也高于復(fù)合氮源魚粉和蠶蛹粉，與對照SMAY相近；魚粉對Nr5772營養(yǎng)生長的促進作用最小，但與酵母提取物一起使用時促進作用則大幅提高。從產(chǎn)孢量分析來看，酵母提取物對分生孢子的形成具有明顯的促進作用，好于蛋白胨、魚粉和蠶蛹粉，與對照SMAY相近；魚粉和蠶蛹粉單獨使用時產(chǎn)孢作用較弱，但與酵母提取物聯(lián)合使用時則可明顯提高Nr5772的產(chǎn)孢能力，說明魚粉、蠶蛹粉與酵母提取物混配有明顯的增效作用，尤以蠶蛹粉+酵母提取物的增幅最大，顯著高于SMAY的產(chǎn)孢量。各培養(yǎng)基均在5 d后開始產(chǎn)孢，產(chǎn)孢速度與最終的產(chǎn)孢量之間沒有明顯的相關(guān)性。試驗中尿素含量設(shè)置為1%，未見孢子萌發(fā)、菌落生長，說明在此濃度下，尿素對萊氏野村菌孢子具有殺滅作用。

2.3 碳源和氮源的正交優(yōu)化設(shè)計

試驗結(jié)果表明，對萊氏野村菌Nr5772產(chǎn)孢促進作用最佳的碳源是葡萄糖，最佳的氮源是酵母提取物+蠶蛹粉，在此基礎(chǔ)上，采用正交設(shè)計對葡萄糖、酵母提取物、蠶蛹粉的含量比例進行試驗，以確定最有利于產(chǎn)孢的培養(yǎng)基組成。

從表3可以看出，葡萄糖、酵母提取物和蠶蛹粉不同含量比例對產(chǎn)孢時間沒有明顯的促進作用，大部分在5 d左右開始產(chǎn)孢。

不同組合的培養(yǎng)基對Nr5772菌落生長影響較小，生長最快的是組合7，即葡萄糖1.6%+酵母提取物0.4%+蠶蛹粉1.6%；對數(shù)據(jù)進一步進行正交分析，從表4可以看出，酵母提取物第III類平方和最大，表明酵母提取物是對菌落生長促進作用最大的因子，而葡萄糖和蠶蛹粉的作用較?。粚ζ咸烟?、酵母提取物和蠶蛹粉的3個含量水平分別進行方差分析，結(jié)果表明葡萄糖與蠶蛹粉含量0.4%、1%、1.6% 3個水平均沒有顯著差異，酵母提取物含量0.4%處理顯著好于1.0%、1.6%處理，說明低含量的酵母提取物有利于菌落的生長。根據(jù)方差分析結(jié)果，最有利于菌落生長的組合應(yīng)當為葡萄糖1.6%+酵母提取物0.4%+蠶蛹粉1.6%。

不同含量葡萄糖、酵母提取物和蠶蛹粉對Nr5772產(chǎn)孢能力有明顯的影響，產(chǎn)孢量相差較大（表3），效果最好的是組合6，即葡萄糖1.0%+酵母提取物1.6%+蠶蛹粉0.4%。正交分析結(jié)果（表4）表明，對產(chǎn)孢能力影響最大的因素是酵母提取物，其次是蠶蛹粉，葡萄糖影響最小，說明氮源對產(chǎn)孢的影響高于碳源。各因素不同水平之間產(chǎn)孢量亦有明顯差異，葡萄糖和蠶蛹粉含量0.4%時產(chǎn)孢量最大，隨著含量的提高產(chǎn)孢量下降；酵母提取物含量1.6%時產(chǎn)孢量最好。從分析結(jié)果來看，葡萄糖0.4%+酵母提取物1.6%+蠶蛹粉0.4%是最佳產(chǎn)孢組合。Nr5772在不同組合培養(yǎng)基中的生長狀況見圖3。

3 小結(jié)與討論

碳源和氮源是真菌生長過程中必不可少的基本原料，碳源和氮源的種類及含量變化對真菌的生長性狀有明顯影響。本研究中，多糖類碳源有利于萊氏野村菌Nr5772的營養(yǎng)生長，菌絲生長快，而以單糖作碳源時菌絲生長較慢，此結(jié)果與孔瓊等[5]的研究相近，與彭小東等[6]的研究有所差異，可能是由于所用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基不同，兼之培養(yǎng)的時間不同所致?？篆偟萚5]、彭小東等[6]的研究證實單糖、二糖有利于產(chǎn)孢，與本研究的結(jié)果一致，試驗進一步分析了葡萄糖含量對產(chǎn)孢的影響，發(fā)現(xiàn)低含量時葡萄糖對產(chǎn)孢的促進作用好于高含量，即在一定范圍內(nèi)，低碳利于產(chǎn)孢，高碳利于菌絲生長，對以收獲分生孢子為目的的N. rileyi培養(yǎng)具有一定的實踐指導(dǎo)意義。

在供試的幾種氮源中，蛋白胨是促進菌落生長最好的物質(zhì)，菌絲生長量最大，但對真菌的產(chǎn)孢促進作用較?。粏为氂媒湍柑崛∥镒龅磿r，真菌的產(chǎn)孢能力較好而菌落生長能力較低，因而蛋白胨與酵母提取物混配使用可以優(yōu)勢互補，此結(jié)果說明，SMAY作為培養(yǎng)萊氏野村菌的標準培養(yǎng)基，其氮源的構(gòu)成是合理的。正交試驗結(jié)果表明，酵母提取物是N. rileyi產(chǎn)孢必不可少的成分，是主要因素。雖然酵母提取物來源于酵母，但如果用酵母粉替代酵母提取物，產(chǎn)孢量則會明顯下降[7]，說明提取物中含有刺激產(chǎn)孢的因子。

作為一種昆蟲寄生菌，昆蟲的組織成分應(yīng)當是適合N. rileyi生長的天然營養(yǎng)基質(zhì)，因而在培養(yǎng)基中添加昆蟲成分應(yīng)當有利于真菌生長?；诖朔N假設(shè)，選擇中國常見的經(jīng)濟昆蟲—蠶，同時也是N. rileyi的天然寄主[8]，把蠶蛹粉作為一種天然的復(fù)合氮源添加到培養(yǎng)基中，以測定其對N. rileyi生長的影響。結(jié)果與預(yù)期一致，蠶蛹粉可以有效增加Nr5772的產(chǎn)孢量，較SMAY培養(yǎng)基產(chǎn)孢效果明顯提高，但因蠶蛹粉中含有較多的幾丁質(zhì)等多糖類，添加量不宜過多。魚粉作為另外一種天然復(fù)合有機物，對N. rileyi的促生作用低于蠶蛹粉?？傊?，以獲得分生孢子為主要培養(yǎng)目的時，在培養(yǎng)基中添加蠶蛹粉比較有利。

以上試驗結(jié)果適于在實驗室內(nèi)進行少量培養(yǎng)時使用，如果要進行大規(guī)模培養(yǎng)以獲得大量的分生孢子用于田間試驗，還需對培養(yǎng)基進行進一步的優(yōu)化，更改更廉價的碳源和氮源，以方便工業(yè)化生產(chǎn)。

本研究探討了不同碳源和氮源對萊氏野村菌培養(yǎng)性狀的影響，發(fā)現(xiàn)最有利于該菌產(chǎn)孢的碳源是單糖，氮源是酵母提取物；最有利于菌落生長的碳源是多糖，氮源是蛋白胨；對產(chǎn)孢量起決定作用的因子是酵母提取物，并且與蠶蛹粉聯(lián)合使用可以提高產(chǎn)孢能力。正交試驗結(jié)果表明，適合萊氏野村菌產(chǎn)孢的培養(yǎng)基組合為葡萄糖0.4%+酵母提取物1.6%+蠶蛹粉0.4%。

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