杜學(xué)鉛++周勇++齊攀

[摘要] 目的 研究MTH1與乳腺腫瘤的相關(guān)性。方法 選取2014年5月～2015年7月新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院57例乳腺蠟塊及部分組織。按乳腺良性腫瘤和乳腺惡性腫瘤分成兩組，分別為20例和37例。通過免疫組化的方法檢測兩組組織實(shí)質(zhì)、間質(zhì)中MTH1的含量。將惡性腫瘤組織按激素受體（HR）（HR包括雌激素和孕激素受體）陰性、陽性；淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移；Ki-67>20%、≤20%；人表皮生長因子受體2（HER-2）（-）、HER-2（+～+++）分別分兩組，通過免疫組化方法檢測各組實(shí)質(zhì)、間質(zhì)中MTH1的含量。進(jìn)一步應(yīng)用Western blot方法檢測乳腺腫瘤組織中MTH1的表達(dá)差異。結(jié)果 MTH1在乳腺腫瘤實(shí)質(zhì)及間質(zhì)中的含量，惡性腫瘤明顯高于良性腫瘤，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；MTH1在HR陽性和HR陰性的乳腺惡性腫瘤組織中的含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；MTH1在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺惡性腫瘤組織中含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；MTH1在乳腺惡性腫瘤實(shí)質(zhì)及間質(zhì)中的含量，Ki-67>20%組中明顯高于Ki-67≤20%組，HER-2（+～+++）組中明顯高于HER-2（-）組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。結(jié)論 乳腺惡性腫瘤組織中MTH1明顯高于乳腺良性組織，并且惡性程度與MTH1含量呈正相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 乳腺惡性腫瘤細(xì)胞；乳腺良性腫瘤細(xì)胞；MTH1；免疫組化

[中圖分類號] R737.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）01（b）-0102-04

Study on the correlation between MTH1 and mammary tumor

DU Xueqian1 ZHOU Yong2 QI Pan2 YUAN Longjian1 HENG Ruijuan1 YANG Liuqin2

1.Xinxiang Medical University， He'nan Province， Xinxiang 453000， China； 2.Department of Oncological Surgery， Xinxiang Central Hospital， He'nan Province， Xinxiang 453000， China

[Abstract] Objective To study the correlation between MTH1 and mammary tumor. Methods Fifty-seven paraffin-embedded samples of breast and some breast tissue obtained from Xinxiang Central Hospital from May 2014 to July 2015 were selected. They were divided into two groups， including mammary benign tumor and mammary malignant tumor， which contained 20 cases and 37 cases respectively. The content of MTH1 in breast parenchyma and mesenchyme was assayed by immunohistochemical staining. The malignant tumor group was divided into two groups respectively based on positive or negative hormone receptor （HR） （HR included estrogen receptor and progestrone receptor）， lymphatic metastasis or not， Ki-67>20% or ≤20%， human epidermal growth factor recptor 2 （HER-2） （-） or HER-2 （+-+++）， the content of MTH1 in breast parenchyma and mesenchyme was assayed by immunohistochemical staining. Western blot was used to detect the expression of MTH1 in breast tumor tissues. Results For the content of MTH1 breast parenchyma and mesenchyme， the mammary malignant tumor was significantly higher than that in mammary benign tumor， the difference was statistically significant （P < 0.05）. There was no significant difference of the content of MTH1 in breast malignant tumor between positive HR and negative HR （P > 0.05）. For the content of MTH1 in parenchyma and mesenchyme of breast malignant tumor， Ki-67>20% group was higher than that of Ki-67≤20% group， HER-2 （+-+++） group was higher than that of HER-2 （-） group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion The content of MTH1 in mammary malignant tumor is significantly higher than that in mammary benign tumor， and the content of MHT1 is positively correlated with the malignant grade of mammary tumor.

[Key words] Mammary malignant tumor； Mammary benign tumor； MTH1； Immunohistochemical staining

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，隨著經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，生活水平的不斷提高，乳腺癌（breast cancer）發(fā)病率逐年增長，發(fā)病率一直處于上升趨勢，2012年，全球約有170萬例乳腺癌新發(fā)病例和52.19萬例乳腺癌死亡病例[1]。中國乳腺癌發(fā)病率以每年3%的水平持續(xù)增長，一些大城市的乳腺癌發(fā)病率已經(jīng)居于女性惡性腫瘤首位[2]。腫瘤細(xì)胞在不斷復(fù)制過程中會(huì)產(chǎn)生大量活性氧族（ROS），而ROS可導(dǎo)致NTP氧化，DNA復(fù)制過程中用到NTP，如果氧化的NTP滲入到DNA中，合成出來的核酸會(huì)導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定[3-4]，會(huì)導(dǎo)致基因突變，這是所有癌癥分子的基礎(chǔ)部分，這是一種破壞性的損傷，導(dǎo)致突變及細(xì)胞死亡[5-7]。研究表明，惡性腫瘤需要高效MTH1，防止dNTPs被氧化后摻入DNA，導(dǎo)致?lián)p傷和細(xì)胞死亡，提示該蛋白可作為抗癌治療的靶標(biāo)[8-9]。本文旨在研究良、惡乳腺腫瘤組織細(xì)胞實(shí)質(zhì)與間質(zhì)中MTH1表達(dá)的差異性及不同狀態(tài)下乳腺惡性腫瘤細(xì)胞激素受體（HR）、人表皮生長因子受體2（HER-2）、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移及Ki-67組織細(xì)胞中MTH1之間的差異，為乳腺癌臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2014年5月～2015年7月新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院乳腺腫瘤組織蠟塊及部分相應(yīng)組織57例，所有標(biāo)本均經(jīng)病理科證實(shí)，其中包含37例乳腺惡性腫瘤組織蠟塊（髓樣癌2例、浸潤性導(dǎo)管癌25、小葉癌3例、導(dǎo)管原位癌6例及胸壁復(fù)發(fā)乳腺癌1例）和20例乳腺良性腫瘤（乳腺腺病7例、乳腺纖維腺瘤7例、乳腺葉狀腫瘤6例）。

1.2 主要儀器與試劑

顯微鏡（德國，蔡司公司）；LEICA免疫組化儀[德國，徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易有限公司]；β-actin一抗（武漢博士德有限公司）；MTH1一抗（美國abcam）；二抗HBR標(biāo)記羊抗兔IgG（南京諾唯贊生物科技有限公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（南京諾唯贊生物科技有限公司）；組織蛋白提取試劑盒（邁新生物技術(shù)開發(fā)公司）；S-P試劑盒（邁新生物技術(shù)開發(fā)公司）；DAB顯色試劑盒（邁新生物技術(shù)開發(fā)公司）；化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（美國，ProteinSimple）。

1.3 免疫組織化學(xué)方法

①切片厚度3 μm；②脫蠟，將切片浸于二甲苯中2次，每次10 min，100%乙醇5 min、95%乙醇5 min、90%乙醇5 min、85%乙醇5 min，自來水沖洗，PBS洗2次均5 min；③修復(fù)液（1∶50），高壓進(jìn)行修復(fù)，出氣后90 s，冷卻，3%過氧化氫溶液室溫浸泡8 min，PBS洗3次，每次5 min；④滴加一抗（abcam單克隆MTH1，工作濃度（1∶100）50 μL，4℃冰箱過夜，恢復(fù)室溫37℃，PBS洗3次，每次5 min；⑤滴加二抗HBR標(biāo)記羊抗兔IgG（工作濃度1∶500）50 μL，30 min，PBS洗3次，每次5 min；⑥用DAB顯色試劑盒顯色，顯色6 min后，充分水洗；中性樹脂封片，蓋上蓋玻片。選擇五組及相應(yīng)HE染色組織相，進(jìn)行400倍的顯微照相，經(jīng)登錄、編號、采集、分析、讀取數(shù)據(jù)、最后存盤，顯微照相。

1.4 蛋白印跡分析實(shí)驗(yàn)

①將少量組織轉(zhuǎn)移至玻璃勻漿器中并加入400 μL裂解液（含PMSF、酶抑制劑等）進(jìn)行裂解，冰上勻漿至組織塊消失。②裂解30 min后，移至1.5 mL離心管中，4℃離心5 min，取上清進(jìn)行分裝，-20℃保存。③進(jìn)行Bradford比色法測定蛋白質(zhì)濃度。④以50 μg蛋白上樣量進(jìn)行上樣。⑤電泳（濃縮膠20 mA，分離膠35 mA）。⑥轉(zhuǎn)膜（200 mA 90 min）。⑦轉(zhuǎn)膜完畢后，室溫封閉1.5 h。⑧一抗孵育：加入稀釋好的一抗，室溫孵育1.5 h。之后洗滌3次，每次5 min。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液洗滌，洗滌3次，每次5 min。⑨二抗孵育：按照適當(dāng)比例用Western二抗稀釋液稀釋，HRP標(biāo)記的二抗孵育2 h，洗滌3次，每次5 min，然后加發(fā)光液進(jìn)行照相。

1.5 判定標(biāo)準(zhǔn)

經(jīng)三位觀察者同時(shí)、獨(dú)立、互相保密進(jìn)行評分，結(jié)果取平均值。陰性表達(dá)為細(xì)胞無染色或非特異染色。陽性表達(dá)按染色強(qiáng)度分級：呈淡黃色計(jì)1分，呈較深褐色計(jì)2分，呈深褐色計(jì)3分；陽性范圍分級：0%～ <25%計(jì)1分，25%～<50%計(jì)2分，50%～<75%計(jì)3分，75%～100%計(jì)4分。上述兩種評分相加2～3分計(jì)為弱陽性（+），4～5分計(jì)為中等陽性（++），6～7分計(jì)為強(qiáng)陽性（+++）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采取χ2檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 在乳腺腫瘤細(xì)胞及不同狀態(tài)乳腺惡性腫瘤細(xì)胞中MTH1的表達(dá)情況

在乳腺腫瘤細(xì)胞及不同狀態(tài)乳腺惡性腫瘤細(xì)胞中MTH1的表達(dá)情況見圖1。圖1A～B實(shí)質(zhì)及間質(zhì)中免疫組化染色深度及染色細(xì)胞數(shù)目均明顯弱于圖1C～D。圖1E、F分別為Ki-67≤20%、Ki-67>20%的乳腺惡性腫瘤組織（HR陰性、HER2陰性，均無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其他免疫指標(biāo)一致），圖1F實(shí)質(zhì)、間質(zhì)中免疫組化染色深度均明顯高于圖1E。圖1G、H分別為HER-2（-）、HER-2（+～+++）的乳腺惡性腫瘤組織（HR陰性、Ki-67，均無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其他免疫指標(biāo)一致），圖1H實(shí)質(zhì)、間質(zhì)中免疫組化染色深度均明顯高于圖1G。

A為乳腺纖維腺瘤組織，B為乳腺纖維腺病組織，C為浸潤性小葉癌組織，D～H為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織。右下角小圖為相應(yīng)標(biāo)本HE染色圖1 在乳腺腫瘤細(xì)胞及不同狀態(tài)乳腺惡性腫瘤細(xì)胞中MTH1的

表達(dá)情況（20×20）

2.2 MTH1在不同狀態(tài)下的表達(dá)情況

MTH1在乳腺腫瘤組織實(shí)質(zhì)及間質(zhì)中含量，惡性腫瘤均明顯高于良性腫瘤，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。MTH1在有和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤組織中的含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。MTH1在HR陽性和陰性的惡性腫瘤組織中的含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。MTH1在乳腺惡性腫瘤實(shí)質(zhì)及間質(zhì)中的含量，Ki-67>20%組明顯高于Ki-67≤20%組，HER-2（+～+++）組明顯高于HER-2（-）組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表1～2。

2.3 MTH1在乳腺腫瘤細(xì)胞及不同狀態(tài)下惡性腫瘤細(xì)胞中的蛋白表達(dá)情況

乳腺惡性腫瘤組織MTH1表達(dá)明顯高于良性腫瘤組織。MTH1在有和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤組織中的含量沒有差異。MTH1在HR陽性和陰性的惡性腫瘤組織中的含量沒有差異。MTH1在乳腺惡性腫瘤實(shí)質(zhì)及間質(zhì)中的含量，Ki-67>20%組明顯高于Ki-67≤20%組，HER-2（+～+++）組明顯高于HER-2（-）組，差異顯著。見圖2。

3 討論

近年來研究認(rèn)識到，間質(zhì)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展并非由上皮或間質(zhì)單方面決定，而是由兩者相互作用所構(gòu)成的腫瘤-宿主微環(huán)境的平衡狀態(tài)所決定[10-11]。惡性腫瘤組織是酸性乏氧的環(huán)境，這樣的微環(huán)境能夠顯著激活，活性氧的產(chǎn)生，而活性氧的產(chǎn)生則會(huì)對DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂類造成氧化性損傷，進(jìn)而影響細(xì)胞的正常功能。MTH1是癌細(xì)胞生存中必不可少的分子，敲除MTH1會(huì)導(dǎo)致HELA細(xì)胞RNA氧化明顯增高[12]。因此，MTH1選擇性清除活性氧，保證了腫瘤細(xì)胞的正常增殖，而正常細(xì)胞不依賴于MTH1的功能維持生存。因此，針對MTH1靶向治療癌癥并不影響正常細(xì)胞的功能[13]。目前已發(fā)現(xiàn)克唑替尼（Crizotinib）的對應(yīng)異構(gòu)體能抗擊MTH1，臨床表現(xiàn)很好。

許多人類癌癥細(xì)胞中均檢測到MTH1，如肺癌、腎癌[14]。乳腺癌細(xì)胞中含有MTH1已被證實(shí)[15]。本研究通過免疫組化方法及Western bolt分析20例乳腺良性組織及37例乳腺惡性腫瘤組織實(shí)質(zhì)及間質(zhì)中MTH1的含量差異。乳腺惡性腫瘤組織中MTH1含量明顯高于乳腺良性組織，同時(shí)本研究也表明了在HER-2（+～+++）及Ki-67>20%的惡性腫瘤中MTH1的含量明顯高于HER-2（-）及Ki-67≤20%的惡性腫瘤。這些結(jié)果可能是由于癌細(xì)胞的代謝活動(dòng)要比正常細(xì)胞快，因此癌細(xì)胞更需要解決這些活性氧物質(zhì)的高水平問題。這些高水平活性氧物質(zhì)不僅對DNA或RAN造成損傷，而且也會(huì)對細(xì)胞中核苷三磷酸混合物造成危害，會(huì)產(chǎn)生氧化的DNA堿基，而這些氧化的DNA堿基則會(huì)錯(cuò)誤地整合到DNA和RNA中，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[16-17]。由于MTH1可以選擇性地將氧化的核苷從NTP混合物中清除，來緩解這一問題，使惡性腫瘤細(xì)胞可以不斷增殖[18-19]。另外，在Ki-67>20%和HER-2（+～+++）組含量尤為明顯。然而Ki-67>20%、HER-2陽性往往腫瘤惡性程度高，容易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，Ki-67>20%、HER-2陽性又是乳腺癌預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)，從而提示MTH1含量越高腫瘤預(yù)后越差。淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是由于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與腫瘤發(fā)現(xiàn)的早晚關(guān)系更為密切；而HR陽性和HR陰性兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能為抽樣誤差所致。

綜上所述，MTH1可以修復(fù)腫瘤細(xì)胞在不斷增殖過程中被氧化的核苷酸，從而減少腫瘤細(xì)胞在不斷增殖中，核苷酸被氧化所導(dǎo)致核酸的不穩(wěn)定性，致使惡性腫瘤細(xì)胞可以不斷增殖。理論上阻斷該途徑，可以很大程度地抑制腫瘤的增殖。在臨床上我們可以針對MTH1蛋白給予靶向治療，抑制乳腺癌實(shí)質(zhì)及間質(zhì)的無限增殖，從而達(dá)到治療乳腺癌的目的。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Torre L，Bray F，Siegel R，et al. Global cancer statistics，2012 [J]. CA cancer J Clin，2015，65（2）：87-108.

[2] Fan L，Strasser-Weippl K，Li JJ，et al. Breast cancer in China [J]. Lancet Oncol，2014，15（7）：e279-e289.

[3] Sonntag CV. Free-radical-induced DNA damage and its repair [J]. Springer Berlin，2006，10（19）：12-19.

[4] Dizdaroglu M，Jaruga P. Mechanisms of free radical-induced damage to DNA [J]. Free Radical Res，2012，4（6）：382-419.

[5] Friedberg EC，Walker GC，Schultz W，et al. DNA Repair and Mutagenesis [J]. ASM，2006，12（56）：2-8.

[6] Vogelstein B，Kinzler KW. The Genetic Basis of Human Cancer [M]. New York：McGraw-Hill，1998.

[7] Friedberg EC. DNA damage and repair [J]. Nature，2003， 4（21）：436-440.

[8] Huber KV，Salah E，Radic B. Stereospecific targeting of MTH1by（S）-crizotinib as an anticancer strateg [J]. Nature，2014，5（9）：222-227.

[9] Gad H，Koolmeister T，Jemth AS，et al. MTH1 inhibition eradicates cancer by preventing sanitation of the dNTP pool [J]. Nature，2014，5（58）：215-221.

[10] Liotta LA，Kohn EC. The microenvironment of the tumour-host interface [J]. Nature，2001，411（35）：375-379.

[11] Rubin H. Selected cell and selective microenvironment in neoplastic development [J]. Cancer Res，2001，61（3）：799-807.

[12] 戴大鵬，干偉，張立群，等.MTH1基因的低表達(dá)對HeLa細(xì)胞內(nèi)RNA氧化程度的影響[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2011， 40（6）：35-38.

[13] Gad H，Koolmeister T，Jemth AS，et al. MTH1 inhibition eradicates cancer by preventing sanitation of the dNTP pool [J]. Nature，2014，508（95）：215-221.

[14] Speina E，Arczewska KD. Contribution of hMTH1 to the maintenance of 8-oxoguanine levels in lung DNA of non-small-cell lung cancer patients [J]. J Natl Cancer Inst，2005，9（7）：384-395.

[15] Coskun E，Jaruga P，Jemth AS，et al. Addiction to MTH1 protein results in intense expression in human breast cancer tissue as measured by liquid chromatography-isotope-dilution tandem mass spectrometry [J]. DNA repair，2015，33（11）：101-110.

[16] 吳克偉，楊芬，劉俊齡，等.Hirsutanols A通過增加活性氧選擇性誘導(dǎo)多西他賽耐藥非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞PC14/TXT凋亡[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2014，26（8）：5-10.

[17] Riso P，Martini D，Moller P，et al. DNA damage and repair activity after broccoli intake in young healthy smokers [J]. Mutagenesis，2010，25（6）：595-602.

[18] Smits VA，Gillespie DA. Cancer therapy：Targeting the poison within [J]. Cell Cycle，2014，13（15）：2330-2333.

[19] Patel A，Burton DG，Halvorsen K，et al. MutT Homolog 1（MTH1）maintains multiple K RAS-driven pro-malignant pathways [J]. Oncogene，2014，34（20）：2586-2589.

（收稿日期：2016-11-05 本文編輯：張瑜杰）