微囊藻毒素—LR誘發(fā)的甲狀腺毒性對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響

趙明明+吳琴++成厚城++丁華++王婧++彭立軍+嚴偉

摘要：研究了微囊藻毒素-LR（MC-LR）對斑馬魚的毒性，將受精后的斑馬魚胚胎暴露于不同濃度的MC-LR（0、0.6、1.2和2.4 mg/L）。結果表明，144 h后斑馬魚生長受到抑制、體長顯著降低，同時其下丘腦-垂體-甲狀腺軸（HPT）相關基因的表達模式也發(fā)生了顯著變化。MC-LR可能通過調(diào)節(jié)HPT軸重要基因的表達來干擾甲狀腺激素的分泌，繼而干擾魚類胚胎的生長發(fā)育。

關鍵詞：微囊藻毒素-LR；斑馬魚；胚胎；HPT軸

中圖分類號：TS212.4；TS207.4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）24-6525-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.24.050

隨著人類社會生產(chǎn)力的提高及人口壓力的增大，淡水水體富營養(yǎng)化現(xiàn)象日趨嚴重，藍藻水華頻繁發(fā)生。藍藻水華次生代謝產(chǎn)生的多種毒素對人和動物的機體健康帶來了巨大威脅。在已發(fā)現(xiàn)的各種藍藻毒素中，微囊藻毒素（Microcystins，MC）是一種在藍藻水華污染中產(chǎn)生量大、出現(xiàn)頻率高和造成危害嚴重的藻毒素種類。至今已發(fā)現(xiàn)MC有80多種異構體[1]，在眾多異構體中，毒性較大、存在較普遍、研究較詳細的是MC-LR（L、R分別代表亮氨酸、精氨酸）[2，3]。

研究發(fā)現(xiàn)，MC對魚類的內(nèi)分泌系統(tǒng)具有干擾作用，可以干擾魚類甲狀腺激素分泌，引發(fā)魚類內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂以及魚類生長發(fā)育遲緩[4，5]，然而，有關MC干擾甲狀腺機能的分子機制研究還非常匱乏。甲狀腺是脊椎動物非常重要的腺體，屬于內(nèi)分泌器官，其分泌的甲狀腺激素具有調(diào)節(jié)動物體生長、發(fā)育、繁殖、機體代謝的重要作用。甲狀腺的功能與碘吸收，激素的合成、轉(zhuǎn)運，脫碘以及甲狀腺激素受體有很大關系[6]。哺乳動物下丘腦分泌促甲狀腺激素釋放激素（TRH）、刺激垂體分泌促甲狀腺激素（TSH），繼而TSH刺激甲狀腺分泌甲狀腺激素，這個體系構成了下丘腦-垂體-甲狀腺軸（HPT軸）（圖1）。HPT軸信號通路關鍵基因的表達是調(diào)控甲狀腺功能的重要因子。

與成年魚類不同，胚胎對MC更敏感，而且MC引起的胚胎發(fā)育遲緩效應可造成不可逆的損害，影響到各個階段的生長發(fā)育，而引發(fā)自然水體中魚類種群的退化。已有的MC對胚胎發(fā)育影響相關的試驗多屬于描述性試驗，缺乏對其內(nèi)在機制的揭示，也缺乏有效的預警手段。本研究擬通過研究斑馬魚HPT軸關鍵基因?qū)C染毒的響應，篩選MC干擾甲狀腺機能的標志性基因，擴展對MC的甲狀腺致毒機理的認識，可以評估MC對魚類乃至人類的潛在威脅，為防治MC的內(nèi)分泌毒性提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

微囊藻毒素MC-LR購自臺灣Express公司，經(jīng)LC-10A型高效液相色譜（日本島津公司）檢測，純度≥95%。

三卡因（MS-222）水溶液用于麻醉斑馬魚幼體，購自美國Sigma-Aldrich公司。其他化學試劑均為分析純，電泳所使用的化學試劑均購自美國Biosciences公司。

1.2 斑馬魚的飼養(yǎng)和胚胎毒性試驗

斑馬魚的飼養(yǎng)以及胚胎的采集參考文獻[7]。將野生型斑馬魚飼養(yǎng)在封閉的流動體系中，維持水溫（28.0±0.5） ℃，光照14 h、黑暗10 h的光照周期。斑馬魚用鹵蟲無節(jié)幼體飼養(yǎng)，每日2次。在水箱中放置大約20條雄性成魚和10條雌性成魚，在大量產(chǎn)卵后收集受精卵。受精后0.5～1.0 h，剔除發(fā)育異常的胚胎，選擇正常發(fā)育的胚胎隨機分組在燒杯中，每個燒杯30個胚胎。燒杯中添加濃度梯度為0、0.6、1.2和2.4 mg/L的MC-LR，并添加50 mL培養(yǎng)液，包含0.2 mmol/L Ca（NO3）2、0.13 mmol/L MgSO4、19.3 mmol/L NaCl、0.23 mmol/L KCl和1.67 mmol/L HEPES[8]。胚胎染毒時間持續(xù)到受精后144 h，大多數(shù)胚胎器官在這個時候已經(jīng)發(fā)育完全。每個濃度設3個平行，每個平行都在玻璃燒杯中添加50 mL培養(yǎng)液和30個發(fā)育正常的胚胎，選擇正常發(fā)育的幼體來進行后續(xù)試驗。

1.3 基因表達檢測

經(jīng)MC-LR暴露后，收集幼體并于-20 ℃保存在TRIzol試劑中，每個處理濃度取30個幼體的混合物做3個重復進行測定。離析、純化及測定總RNA、第一單鏈cDNA的合成、實時定量PCR（QPCR）等按照Li等[9]的操作執(zhí)行，用TRIzol regent提取總RNA、RNase-free DNase I消解。在260 nm下估算總RNA的濃度，并通過測定260 nm/280 nm的比值來驗證其質(zhì)量。1%的瓊脂-甲醛凝膠電泳并由溴化乙錠（EB）染色，以進一步純化提取的總RNA。第一單鏈cDNA的合成依照產(chǎn)品說明用商業(yè)試劑盒來完成。QPCR的分析使用Chrom 4TM檢測器在無菌條件下，用96孔酶標板來進行。經(jīng)MC-LR處理后，對照組與試驗處理組的甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）在表達水平無顯著差異，選擇GAPDH作為內(nèi)部參照物來控制數(shù)據(jù)質(zhì)量。引物序列的設計使用軟件Primer V3（表1）進行。熱循環(huán)設置為95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸45 s?；虻谋稊?shù)變化測試用2-ΔΔCt法，基因表達測定做3個重復。

2 結果與分析

2.1 MC-LR的胚胎毒性

MC-LR的暴露對斑馬魚胚胎發(fā)育造成了嚴重影響，MC-LR具有強烈的發(fā)育毒性。MC-LR暴露144 h后，相比于對照組[（86.7±1.68）%]的存活率，0.6 mg/L[（83.3±3.18）%]、1.2 mg/L[（82.5±3.53）%]以及2.4 mg/L[（79.8±3.29）%]暴露組的成活率均顯著受到抑制（圖2）。與對照組的孵化率[（86.0±0.86）%]相比，0.6和1.2 mg/L MC-LR暴露并不會顯著影響斑馬魚胚胎的孵化率，但2.4 mg/L MC-LR暴露會顯著抑制胚胎孵化率[（83.1±0.28）%]（圖3）。3個暴露組的結果表明，MC-LR不會對胚胎心率產(chǎn)生顯著影響（圖4）。與對照組體長（4.10±0.06） mm相比，MC-LR暴露對斑馬魚生長發(fā)育造成了顯著影響（圖5）。結果表明，MC-LR對胚胎生長發(fā)育具有比較強的抑制效應，MC-LR對胚胎生長發(fā)育的影響是通過影響其甲狀腺功能來實現(xiàn)的[10]，但其具體機制還有待進一步分析。

2.2 HPT軸基因表達分析

甲狀腺的功能與碘吸收以及甲狀腺激素的合成、轉(zhuǎn)運、脫碘與受體結合息息相關，而HPT軸對此過程具有重要的調(diào)節(jié)作用，為了探尋MC-LR抑制斑馬魚胚胎生長發(fā)育的分子機制，分析了與魚類生長發(fā)育顯著相關的HPT軸相關基因的表達（圖6）。CRH的轉(zhuǎn)錄水平在1.2和2.4 mg/L MC-LR暴露組顯著上調(diào)（7.12±0.98、3.80±1.52）。CRH可刺激垂體分泌TSH，最終促進機體分泌甲狀腺激素。同時檢測到了TSHβ轉(zhuǎn)錄水平在2.4 mg/L MC-LR暴露組的顯著下調(diào)（0.77±0.02）。結果表明，MC-LR暴露可能會通過抑制TSHβ的轉(zhuǎn)錄而抑制斑馬魚胚胎甲狀腺激素的分泌，而機體為了扭轉(zhuǎn)這種趨勢會通過負反饋上調(diào)CRH來彌補下調(diào)的TSH。

在魚類中，甲狀腺激素可通過甲狀腺激素受體調(diào)節(jié)胚胎的發(fā)育，甲狀腺激素受體主要有兩種類型，分別為TRα和TRβ[11]。在本試驗中TRα的轉(zhuǎn)錄水平在2.4 mg/L MC-LR暴露組顯著下調(diào)（0.53±0.02），而TRβ的轉(zhuǎn)錄水平在3個染毒組均無顯著變化。甲狀腺激素受體的不同亞型具有不同的器官表達特異性，且不同的亞型對MC-LR的響應也不相同，TRα可作為MC-LR影響魚類甲狀腺功能的生物標志物。

脫碘酶是調(diào)節(jié)魚類甲狀腺激素循環(huán)與含量的重要酶類，其主要有Deio1和Deio2兩種亞型。MC-LR暴露可導致Deio1在3個染毒組的基因表達水平顯著上升（依次為1.33±0.05、1.43±0.09、1.56±0.01），但對Deio2的轉(zhuǎn)錄無顯著影響。Deio1主要在肝臟、腎臟以及甲狀腺中表達，其主要作用是產(chǎn)生血液中的甲狀腺激素T3[12]。研究表明，MCs的其他異構體可通過促進Deio1的表達來促進被抑制的T3激素分泌[13]。本試驗結果表明，MC-LR可能同樣具有抑制T3分泌的功能，而斑馬魚機體通過負反饋調(diào)節(jié)Deio1的表達來緩解這種不利條件。

TG與NIS的基因表達均發(fā)生顯著上調(diào)，TG在3個MC-LR暴露組分別上調(diào)了1.54±0.06、1.59±0.04、1.55±0.11；而NIS在1.2和2.4 mg/L MC-LR暴露組顯著上調(diào)了1.47±0.11和1.32±0.09。TG是一個分子質(zhì)量為660 ku的二聚體蛋白，它在甲狀腺中產(chǎn)生和行使功能，其主要作用為合成甲狀腺激素。NIS是一種內(nèi)在膜蛋白，在甲狀腺細胞攝碘中起重要作用[14]。TG與NIS的過表達都可以促進甲狀腺激素的分泌，這可能是機體對MC-LR抑制甲狀腺激素分泌后的一種負反饋調(diào)節(jié)。

3 結論

本試驗闡明了MC-LR可抑制斑馬魚胚胎生長發(fā)育，具有胚胎發(fā)育毒性，并從HPT軸相關基因表達模式的改變分析了MC-LR引發(fā)胚胎發(fā)育毒性的可能機制，豐富了MC-LR致毒機理的研究。在藍藻水華爆發(fā)季節(jié)，藻細胞破裂后將大量MC-LR釋放入自然水體中，MC-LR的胚胎發(fā)育毒性會導致漁業(yè)減產(chǎn)，甚至通過食物鏈對人體造成危害，應引發(fā)公眾的關注。

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