張冠文+倪樹標(biāo)+陳云+曾成柱

0.引言

食品安全是建設(shè)小康社會的重要指標(biāo)，《國家十三五規(guī)劃綱要》將食品安全列為國家戰(zhàn)略，黨中央和國家高層直接推動，近幾年已經(jīng)出臺了大量政策和法規(guī)。

光譜類食品安全快速檢測儀被廣泛使用，已經(jīng)大規(guī)模布局到全國的基層食品藥品監(jiān)管所、農(nóng)檢站、蔬菜生產(chǎn)基地、農(nóng)貿(mào)市場、超市、食堂等單位，儀器在用數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過傳統(tǒng)實驗室分光光度計。此類儀器需要研究快速、簡便，同時不影響實驗結(jié)果準(zhǔn)確度的實驗方法。

然而光譜類食品安全快速檢測所參考的國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定過于簡潔，無論是對于基層實驗操作人員還是缺乏應(yīng)用基礎(chǔ)的相關(guān)儀器廠商均起不到具體指引作用，如《GB 5009.33-2010食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》規(guī)定“以零管調(diào)節(jié)零點，于波長538nm處測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線比較。同時做試劑空白”，再如農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《NY 5172-2002無公害食品水發(fā)產(chǎn)品》甲醛檢測一節(jié)規(guī)定“以空白為參比，與波長435nm處，以1cm比色杯進(jìn)行比色，測定吸光度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線計算結(jié)果”。

食品安全快檢儀器實際應(yīng)用過程中存在如下情況：

（1）快檢方法常常簡化樣品前處理步驟，引起干擾種類增多，例如樣品處理液帶有顏色或渾濁，加上儀器基本是單波長和單光束儀器，沒參比通道扣除空白，只一個“以零管調(diào)零”的操作難以滿足需求，會導(dǎo)致實驗結(jié)果誤差較大。

（2）基層用戶不會每天重做標(biāo)準(zhǔn)曲線，需要有對存儲的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校正后判斷其質(zhì)量的指標(biāo)。

（3）基層用戶不能自行做復(fù)雜數(shù)據(jù)處理，需要“一鍵測量”后直接輸出樣品檢測含量和實時打印原始記錄。

如何應(yīng)對這些情況，下文從標(biāo)準(zhǔn)曲線建立和空白扣除的角度進(jìn)行論述。

1.校準(zhǔn)曲線

校準(zhǔn)曲線包括工作曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線兩類，食品安全快檢沒有消解等復(fù)雜前處理，實際使用的是標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立此類標(biāo)準(zhǔn)曲線有幾個要點：

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線需要5個數(shù)據(jù)點，數(shù)據(jù)點選取時最高吸光度不適宜超過1ABS，且待測物的國家限量值應(yīng)包含在數(shù)據(jù)點中。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線截距與零做T檢驗后去除，包先金分析了標(biāo)準(zhǔn)曲線不去除截距時，樣品測量信號扣除空白后直接代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算會引起誤差。

（3）參與標(biāo)準(zhǔn)曲線計算的數(shù)據(jù)點和進(jìn)行實際樣品含量計算的數(shù)據(jù)點均需要是扣除空白的純反應(yīng)信號。

上述要點（2）、（3）滿足了基層用戶一鍵檢測直接輸出檢測結(jié)果的需求，免除樣品測量信號和空白信號分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算的煩瑣。儀器廠出廠預(yù)置標(biāo)準(zhǔn)曲線時，除了考察線性相關(guān)系數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)曲線截距需要與零做T檢驗，無顯著差異時去除截距，有顯著差異時應(yīng)找出原因修正。但基層用戶做標(biāo)準(zhǔn)曲線校正時T檢驗過于復(fù)雜，可直接用截距的數(shù)值大小做基本判定。這點也決定了參與標(biāo)準(zhǔn)曲線計算的數(shù)據(jù)點需要是扣除空白的純反應(yīng)信號，否則截距的數(shù)值大小沒法作為標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量的判據(jù)。

2.空白扣除獲取純反應(yīng)信號原理

下面討論食品安全快速檢測中用到的幾個吸光度，本應(yīng)用的溶劑均是水。

（1）基質(zhì)吸光度：即裝純凈水的比色皿放入儀器中時的吸光度值，該吸光度值包含了兩個來源：比色皿吸光度、水吸光度。

Abs基質(zhì)=Abs比色皿+Abs水 （1）

（2）零值空白檢測吸光度：即以零值空白標(biāo)液（即純凈水）加入檢測試劑后的吸光度值，該吸光度值包含了3個來源：比色皿吸光度、水吸光度、試劑本底吸光度（試劑本底顏色或渾濁帶來的吸光度）。

Abs零值空白=Abs比色皿+Abs水+Abs試劑本底 （2）

（3）標(biāo)樣檢測吸光度：即標(biāo)準(zhǔn)樣品加入檢測試劑后的吸光度值，該吸光度值包含了4個來源：比色皿吸光度、水吸光度、試劑本底吸光度、純反應(yīng)吸光度（即試劑與待測物反應(yīng)產(chǎn)生的顏色帶來的吸光度）。

Abs標(biāo)樣檢測=Abs比色皿+Abs水+Abs試劑本底+Abs純反應(yīng) （3）

（4）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線用的純反應(yīng)吸光度用下列公式計算：

Abs曲線計算=Abs標(biāo)樣檢測-Abs零值空白=Abs純反應(yīng) （4）

（5）樣品空白吸光度：食品安全快速檢測通常不會采用復(fù)雜的前處理方法，樣品處理液帶有顏色或渾濁是常見現(xiàn)象，由此導(dǎo)致“樣品空白吸光度”，該吸光度值包含了3個來源：比色皿吸光度、水吸光度、樣液本底吸光度（樣品處理液本底顏色或渾濁帶來的吸光度）。

Abs樣品空白=Abs比色皿+Abs水=Abs樣液本底 （5）

（6）樣品檢測吸光度：即樣品處理液加入檢測試劑后的吸光度值，該吸光度值包含了5個來源：比色皿吸光度、水吸光度、試劑本底吸光度、樣液本底吸光度、純反應(yīng)吸光度（即試劑與待測物反應(yīng)產(chǎn)生的顏色帶來的吸光度）。

Abs樣品檢測=Abs比色皿+Abs水+Abs樣液本底+Abs試劑本底+Abs純反應(yīng)（6）

（7）由上公式（6）可見，為獲得用于計算樣品待測物含量的純反應(yīng)吸光度，除了要扣除樣品空白吸光度（Abs比色皿+Abs水+Abs樣液本底），還要扣除試劑本底空白吸光度。理論上當(dāng)然也可以采用先扣除零值空白吸光度，再扣除樣液本底吸光度的方法獲取計算樣品待測物含量的純反應(yīng)吸光度，但這種處理會導(dǎo)致實際的實驗步驟過于復(fù)雜，不予采用。試劑本底空白吸光度計算如下：

Abs試劑本底空白=Abs零值空白+Abs基質(zhì)+Abs試劑本底 （7）

（8）用于計算樣品待測物含量的純反應(yīng)吸光度用如下公式計算：

Abs樣品計算=Abs樣品檢測-Abs樣品空白-Abs試劑本底空白=Abs純反應(yīng) （8）

3.空白扣除獲取純反應(yīng)信號實驗步驟設(shè)計

（1）依據(jù)上文公式（4）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

（a）以零值空白標(biāo)液（即純凈水）加入試劑反應(yīng)，放入儀器中，進(jìn)行空白測量（儀器廠商可設(shè)計“空白測量”按鈕），獲得零值空白檢測吸光度值——Abs零值空白。

（b）各濃度標(biāo)液依次加入試劑反應(yīng)，放入儀器中，進(jìn)行測量（儀器廠商可設(shè)計“測量”按鈕），獲得各濃度標(biāo)樣檢測吸光度值——Abs標(biāo)樣檢測。

（c）儀器軟件用各濃度標(biāo)樣檢測吸光度扣除零值空白吸光度，獲得建立標(biāo)準(zhǔn)曲線用的純反應(yīng)吸光度值——Abs曲線計算，然后與對應(yīng)的濃度系列擬合建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）依據(jù)公式（7）進(jìn)行試劑本底空白測量

（a）將裝零值空白標(biāo)液（即純凈水）的比色皿放入儀器中，進(jìn)行調(diào)零。這一步驟相當(dāng)于在下一測量步驟中扣除基質(zhì)吸光度——Abs基質(zhì)。

（b）在上述比色皿中加入試劑反應(yīng)后，放入儀器原通道中，進(jìn)行空白測量，獲得的吸光度值為試劑本底空白吸光度——Abs試劑本底空白。

（3）依據(jù)上文公式（8）進(jìn)行樣品測量

（a）將樣品處理液放入比色皿后，放入儀器中，進(jìn)行調(diào)零。這一步實際相當(dāng)于在下一測量步驟中扣除樣品空白——Abs樣品空白。

（b）向比色皿中加入試劑反應(yīng)后，分別放入儀器原通道中，進(jìn)行測量。

（c）步驟（a）相當(dāng)于扣除了樣品空白，儀器軟件計算時還需要再減去試劑本底空白——Abs試劑本底空白，才能得到樣品中待測物的純反應(yīng)吸光度值——Abs樣品計算，用此純反應(yīng)吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中即可獲得樣品處理液中待測物質(zhì)含量，用此樣品處理液中待測物質(zhì)含量結(jié)合樣品處理過程中帶來的換算關(guān)系，即可計算出樣品中待測物質(zhì)含量。

結(jié)語

使用掩蔽劑，使用雙光束、雙波長分光光度計對扣除樣液渾濁等空白干擾有效果，但已經(jīng)被大量采購和使用的光譜類食品安全快速檢測儀不具備這些硬件條件，需要用最小的代價更好地發(fā)揮這些儀器的效用，本文從標(biāo)準(zhǔn)曲線建立和空白扣除的角度，進(jìn)行了完整的原理設(shè)計和實驗步驟設(shè)計，簡單易行，存在不足之處，供同行參考。

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