張愛民+郭元虎+郝旺勝+馬振華
[摘要] 目的 探討斑貞1號聯(lián)合TMP、5-FU逆轉人胃癌細胞系SGC-7901/ADR與CDX2相關性。 方法 從2015年6—12月在包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院中心實驗室進行SGC7-901/ADR細胞培養(yǎng),設①空白對照組、②5-FU組、③斑貞1號組、④5-FU+斑貞1號組、⑤5-FU+斑貞1號+ TMP組觀察細胞毒性,選取各個藥物組作用濃度分別提取總mRNA,采用半定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)監(jiān)測人胃癌細胞SGC-7901/ADR細胞在不同藥物組的尾型同源基因 2(caudal- re lated hom e- odom aintranscription factor 2, CdX2)mRNA的表達情況。結果 對照組CDX2 mRNA 表達量為(2.01±0.26),5-FU組CDX2mRNA表達量為(1.94±0.24),5-FU組與陰性對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),而5-FU聯(lián)合斑貞1號及TMP處理組CDX2 mRNA表達量為(0.44±0.07),與其他組明顯降低比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論 斑貞1號聯(lián)合TMP及5-FU逆轉人胃癌SGC-7901/ADR細胞耐藥性可能與CDX2基因相關。
[關鍵詞] 胃癌;斑貞1號;TMP; 5-FU; 多藥耐藥;CDX2基因
[中圖分類號] R735.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742(2017)01(a)-0032-04
在我國,胃癌的發(fā)生率和死亡率居惡性腫瘤前3[1],手術治療一直是胃癌的首選治療手段,但除日本外的大多數(shù)國家早期診斷率較低,因此根治手術率仍然較低,化療在胃癌治療中顯得十分重要,但目前遇到最大問題是胃癌多藥耐藥性(MDR),近幾年發(fā)現(xiàn)尾型同源基因 2(caudal- re lated hom e- odom aintranscription factor 2, CdX2)在胃癌細胞的多藥耐藥性調節(jié)中扮演重要的角色。侯培珍[2]研究結果示斑貞1號、5-FU 和TMP聯(lián)合對人胃癌SGC-7901/ADR細胞有明顯的逆轉作用。該實驗從2015年6—12月在包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院中心實驗室進行SGC7-901/ADR細胞培養(yǎng),采用RT-PCR比較人胃癌細胞SGC-7901/ADR細胞在不同藥物組CDX2mRNA的表達量,進一步探討斑貞1號 + 5-FU+TMP對人胃癌SGC-7901/ADR細胞的作用機理,現(xiàn)報道如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
細胞系胃癌SGC-7901/ADR細胞(人胃癌細胞)。
1.2 藥物、試劑及主要儀器
自擬“斑貞1號”每mL含露蜂房、山茱萸、斑蝥、女貞子各0.2 g。5-FU (規(guī)格10 mL:0.25 g,國藥準字H310 20593)、TMP(規(guī)格40 mg,國藥準字H20031302)、RPMI1640培養(yǎng)基(RPMI是Roswell Park Memorial Institute的縮寫,1640是培養(yǎng)基代號)。其中含有10%胎牛血清,二甲基亞砜、胰蛋白酶,新生小牛血清兩步法RT-PCR試劑盒,Trizol,引物,PCR擴增儀、電泳儀(DF-D)、紫外分光度計、紫外透視成像系統(tǒng)。
1.3 實驗方法
1.3.1 細胞處理 以5×104/mL接種于6孔板上,每孔2 mL,培養(yǎng)24 h后,實驗孔依次加入等量的新的培養(yǎng)液; 5-FU稀釋液;斑貞1號稀釋液;斑貞1號 + 5-FU稀釋液;斑貞1號 + 5-FU+TMP稀釋液(選取各自的IC50值)。培養(yǎng)48 h后,PBS緩沖液沖洗,準備提取總mRNA。
1.3.2 RT- PCR檢測 以mRNA為模板經(jīng)逆轉錄合成cDNA, 每個反應體系25 uL,目的基因引物各0.5 uL,Takara Taq 1 uL,10×PCR Buffer(Mg2+Plus) 2.5 uL,dNTP Mixture 2 uL,ddH2O 13.5 uL;各樣品cDNA5 uL,β -action的正義列為5'-AGAGCGGCATGAAGAAGGAGTG-3',反義列為5ˊ-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3',CDX2基因序列的正義列引5-TCAGACCTACGCCGAATATGC-3,反義列引物為5'-GAAATGGGAGAAGGTAGTGTCAAA-3',滅菌蒸餾水13.5 uL。預變性→變性→退火→延伸條件分別是、98℃、2~4 min→98℃、8 s→55℃、12 s→72℃、55 s,共30個循環(huán),最后延伸72℃ 10 min。擴增結束,取樣品10 uL,經(jīng)100 V恒壓,2%瓊脂糖電泳60 min,采集電泳圖像,凝膠圖象分析系統(tǒng)掃描得出各電泳帶光密度值(即目的條帶與內參條帶光密度比值)。
1.4 統(tǒng)計方法
應用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計,計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示,并采用LSD t檢驗, P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2 結果
2.1 SGC7901/ADR細胞經(jīng)不同藥物處理后CDX2 mRNA的表達
5-FU組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。其他藥物組與對照組及組間比較均差異有統(tǒng)計學意義。
2.2 CDX2和β-action的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖分離的表達
CDX2和β-action的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖分離后分別位于247bp和548bp。A、B、C、D、E為CDX2表達,A1、B1、C1、D1、E1為β-action的表達。
3 討論
胃癌是中國常見的惡性腫瘤之一,至今為止手術仍是胃癌的主要治療方法。因早癌診斷率低,多數(shù)患者失去手術機會,所以化療在胃癌治療中顯得十分重要,但目前遇到最大問題是胃癌多藥耐藥性(MDR),郝旺勝等[3]研究發(fā)現(xiàn)人胃癌SGC-7901/ADR細胞對5-FU相對耐藥性為97.49%;有日本學者[4-5]發(fā)現(xiàn) CDX2 是腫瘤多藥耐藥性重要控制基因 MDR1 的直接上游基因通過構建 CDX2 沉默的病毒載體轉染SGC7901/DDP,發(fā)現(xiàn)胃癌細胞對順鉑、阿霉素、5-氟尿嘧啶等化療藥物的敏感性增加,將藥物泵出細胞的效率降低,胃癌細胞株的凋亡增加,并促使胃癌細胞停滯于 M 期;儲婧等[6]研究發(fā)現(xiàn)CDX2和腸型claudin- 3胃黏膜腸化生及腸型胃癌中表達具有相關性, Bae等[7]研究發(fā)現(xiàn),CDX2 的表達與結腸、直腸癌密切相關,且可作為結直腸癌的預后評估指標。Bonhomme 等[8]研究表明CDX2在結直腸癌組織中呈低表達, 能抑制腫瘤的發(fā)生且CDX2表達的減少與結直腸癌的預后不良有關,Hong KD等[9-10] CDX2在結直腸癌中表達研究的分析結果,在高中分化癌組織中的表達明顯高于在低分化癌組織中的表達。肖燾等[11]研究發(fā)現(xiàn) C D X2屬于腸道特異性的核轉錄因子, 對腸上皮細胞正常形態(tài)和功能維持起一定的作用基因長度22~23 KB,由3個外顯子和2個內含子構成,參與腸道發(fā)育過程多個步驟調節(jié),主要有細胞增殖、分化、遷移及惡變,在早期腸分化中起重要作用[12];在正常狀態(tài)下其表達難以測定,但在內毒素、細胞因子、癌基因等多種刺激因子下,可明顯表達[13-14]。CDX2促進腫瘤發(fā)生的機制主要是誘導細胞增殖、促進腫瘤新生血管的生成,同時抑制機體抗腫瘤的免疫應答反應[15-16],斑貞1號合劑(斑蝥、露蜂房、女貞子、山茱萸),主要斑蝥素主要是抑制腫瘤細胞核苷酸合成,起到解毒殺瘤、殺傷腫瘤同時無骨髓抑制作用。女貞子對染色體損傷具保護作用。TMP可通過多種途徑,逆轉多藥耐藥,對腫瘤起到治療作用。楊葉等[17]研究已證實TMP能顯著增加SGC-7901/ADR細胞對5-FU的敏感性;斑貞1號和TMP聯(lián)合5-FU對人胃癌細胞有較強的逆轉作用。該研究顯示對照組CDX2 mRNA 表達量為(2.01±0.26),5-FU組CDX2mRNA表達量為(1.94±0.24),5-FU組與對照組比較COX-2mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),說明COX-2參與耐藥細胞對5-FU的耐藥性。斑貞1號和TMP聯(lián)合5-FU組COX-2mRNA表達量為(0.44±0.07),明顯低于其他用藥組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),說明可顯著抑制耐藥細胞COX-2mRNA的高表達,克服了由COX-2基因介導的多藥耐藥性,增強了治療效果。
綜上所述,斑貞1號聯(lián)合TMP及5-FU可以逆轉人胃癌SGC-7901/ADR細胞耐藥性,并初步探討其影響人胃癌耐藥細胞株的分子機制,為胃癌耐藥性逆轉的基因治療打下理論基礎,值得推廣,體外試驗結果在體內是否能發(fā)揮相同的作用,有待于進一步的研究和探討。如果實驗條件允許,不僅局限于CDX2的研究,可以進行多基因研究,此外選用實時熒光定量PCR實驗就會更加完美。
[參考文獻]
[1] Bosolino A, Cravero A, Ratto R. Gastric metastases: not only identified at autopsies [J].Actagastroenterologica Latinoameri cana,2013,43(4):316-320.
[2] 侯培珍,張娟,趙永峰.中西藥結合對胃癌細胞多藥耐藥性逆轉和誘導凋亡的實驗研究[J].第四軍醫(yī)大學學報,2008, 29(13):1181-1183.
[3] 郝旺勝,侯先文,侯培珍.斑貞1號聯(lián)合氟尿嘧啶對胃癌細胞SGC-7901/ADR的細胞毒作用[J].臨床薈萃,2008,23(24):1762-1764.
[4] Y Takakurar,T Hinoi,N Oue,et al. CDX2 regulates multidrug resistanue 1 gene expression in malignant intestinal epitelium[J]. Cancer Research,2010,70(17):6767-6778.
[5] Yan LH, Wang XT, Yang J,et al. Reversal ofmultidrug resistance in gastric cancer cells by CDX2 downregulation[J].World journal of gastroenterology:WJG,2014,18(26):4150-4155.
[6] 儲婧,秦蓉,王娜娜.胃癌及癌旁組織中 CDX2 和 clau- 等.din- 的表達及其意義[J].臨床與實驗病理學雜志,2011, 3.27(12):1280-1282.
[7] Bae J M,Lee T H,Cho N Y,et al. Loss of CDX2 expression is associated with poor prognosis in colorectal cancer patients[J]. 2015(5):1457-1467.
[8] Bonhomme C, Duluc I, Martin E,et al.The Cdx2 homeobox gene has atumour suppressor function in the distal colon inaddition to a homeotic role during gut development[J].Gut,2003(52):1465-1471.
[9] Hong KD, Lee D, Lee Y,et al.Reduced CDX2 expression predicts poor overall survival inpatients with colorectal cancer[J].Am Surg,2013(79):353-360.
[10] Olsen J, Espersen ML, Jess P, et al.The clinical perspec tives of CDX2 expression in colorectal cancer: a qualitative systematic review[J]. Surg Oncol,2014(23):167-176.
[11] 肖燾,蔡軍.CDX2與腫瘤的研究進展[J].南昌大學學報:醫(yī)學版,2011(51): 84-88.
[12] 高光,金仁順.SP 和 CDX2 表達的胃黏膜上皮化生胃癌的關系研究[J].腫瘤學雜志 2016,22(4):291-293.
[13] 蔣偉,張健鋒,毛振彪.胃癌組織及外周血中 CDX2 基因甲基化的關系及其臨床意義[J].交通醫(yī)學,2015,29(4):329-331.
[14] 毛宏杰.CDX2與Barrett食管的相關性研究[J].中外醫(yī)療,2010,29(13):40.
[15] 馮煥然,段巨洪,武文杰,等.胃癌患者血清炎性因子水平檢測的臨床意義[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學院學報,2014,31(4):284-286.
[16] 黎敏,李翠文,侯培珍.中西藥聯(lián)合對人胃癌SGC-7901/ADR細胞Bcl-2與Bax基因表達的影響[J].中外醫(yī)療, 2013, 32(7):11-13.
[17] 楊葉,侯培珍,張娟.川芎嗪聯(lián)合氟尿嘧啶對胃癌細胞SGC- 7901/ADR的殺傷作用[J].腫瘤防治研究,2008,35(9):624-626.
(收稿日期:2016-10-09)