楊華生+吳維剛+譚麗霞+聞麗珍+王希霖+江亭+吳璐

[摘要]炒麥芽一直沿用“炒黃炒香”的入藥傳統(tǒng)，而“炒黃炒香”終點(diǎn)的判斷一直是炒制研究的重點(diǎn)與難點(diǎn)。該實(shí)驗(yàn)建立指標(biāo)成分與NIRS之間的定量校正模型用于快速檢測(cè)總還原糖、總氨基酸、總黃酮、A₄₂₀及含水量，并提出基于“成分變化率”的炒制終點(diǎn)判斷方法。以近紅外光譜儀采集不同炒制時(shí)間樣品光譜，建立基于近紅外光譜的定量分析模型，并對(duì)光譜預(yù)處理、建模波段等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)選；采用HCA，PLS-DA研究成分與“炒香”的關(guān)系，確定炒制終點(diǎn)。所建立的校正模型性能良好，采用所建模型進(jìn)行在線分析，預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際測(cè)定值相關(guān)系數(shù)均大于0.9，預(yù)測(cè)相對(duì)偏差小于10%；HCA方法將在不同炒制時(shí)間的麥芽分為4類，PLS-DA分析表明總還原糖對(duì)區(qū)分不同炒制時(shí)間的麥芽具有顯著的貢獻(xiàn)率，當(dāng)總還原糖的變化率為80%時(shí)，即可判斷“炒香”終點(diǎn)的到達(dá)。結(jié)果表明，近紅外光譜可快速準(zhǔn)確地測(cè)定麥芽不同炒制時(shí)間樣品中總還原糖、總氨基酸、總黃酮、A₄₂₀及含水量，并可判斷“炒香”工藝終點(diǎn)，為中藥炒制工藝的評(píng)價(jià)及終點(diǎn)判斷提供新的研究方法。

[關(guān)鍵詞]近紅外光譜； 麥芽； 炒制過(guò)程； 在線監(jiān)測(cè)； 終點(diǎn)判斷

[Abstract]Hordei Fructus Germinatus has been always used by "stir-frying" as a traditional medicine and the endpoint judgment of "fragrant" and "yellow" has been the focus and difficulty in frying process research. In this study， a quantitative calibration model between index components and NIRS was established in order to rapidly detect the contents of reducing sugar， total amino acids， total flavonoids， A₄₂₀ and moisture； besides， an endpoint judgment method of frying process was put forward based on the "component change rate". Near-infrared spectra of samples with different frying time were collected， and a quantitative analysis model based on near-infrared spectroscopy was established to optimize the parameters such as spectral pretreatment and modeling band. HCA and PLS-DA were used to study the relationship between component and "stir-frying"， and the endpoint of frying process was determined. The established calibration model had a good performance that the correlation coefficients between the predicted results and the actual measured values were both more than 0.9， with predicted relative deviations less than 10%. Hordei Fructus Germinatus with different frying time was divided into 4 categories by HCA analysis. PLS-DA analysis showed that total reducing sugar had a significant contribution to distinguishing the Hordei Fructus Germinatus of different frying time. When the change rate of total reducing sugar was 80%， it could judge that the endpoint of frying had been obtained. Results showed that NIRS could not only quickly and accurately determine the contents of reducing sugar， total amino acid， total flavonoid， A₄₂₀ and moisture in Hordei Fructus Germinatus samples of different frying time， but also judge the endpoint of frying in the process. This study provided a new method for the evaluation and endpoint judgment of "stir-frying" process in research of traditional Chinese medicine.

[Key words]near-infrared spectroscopy； Hordei Fructus Germinatus； stir-frying process； on-line monitoring； endpoint judgment

麥芽是禾本科植物大麥Hordeum vulgare L.的成熟果實(shí)經(jīng)過(guò)發(fā)芽干燥的炒制加工品，主要含有麥黃酮、槲皮素等黃酮類及淀粉酶、蛋白酶等消化酶類有效成分，也含有還原糖、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分^[1-2]。麥芽在臨床應(yīng)用上主要有生麥芽、炒麥芽、焦麥芽3種形式。生麥芽健脾和胃，疏肝行氣，炒麥芽行氣消食回乳，焦麥芽消食化滯，可見(jiàn)，麥芽不同的炮制品功能主治存在較大差別。炒麥芽一直沿用“炒黃炒香”入藥的傳統(tǒng)^[3-4]，生麥芽、炒麥芽、焦麥芽功效與炒制的“火候”密切相關(guān)。目前，麥芽炒制時(shí)或以淀粉酶為評(píng)價(jià)指標(biāo)，但炒制后淀粉酶的活性必然下降，這并不能科學(xué)闡釋炒麥芽消食作用較生麥芽強(qiáng)的作用機(jī)制^[5]；或以麥芽的色澤及香味為評(píng)價(jià)指標(biāo)，但多以操作者的個(gè)人經(jīng)驗(yàn)為判據(jù)，難免存在個(gè)體差異^[6]；或以麥黃酮等有效成分為評(píng)價(jià)指標(biāo)優(yōu)選炒制工藝^[7]，然而，麥黃酮等有效成分的多與少與“炒黃炒香”并無(wú)必然聯(lián)系。

近年來(lái)，中藥炮制時(shí)產(chǎn)生的基于還原糖及氨基酸、蛋白質(zhì)的Maillard反應(yīng)產(chǎn)物（Maillard reaction products）已引起中醫(yī)藥研究者廣泛關(guān)注，Maillard反應(yīng)一般產(chǎn)生揮發(fā)性香味物質(zhì)，一方面這些香味物質(zhì)可能具有某些藥理作用，另一方面這些香味物質(zhì)也被作為炒制終點(diǎn)的判據(jù)，在炒制中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)香味物質(zhì)的變化，以提高工藝優(yōu)選的客觀性及科學(xué)性；近年來(lái)，近紅外光譜（near infrared spectroscopy，NIRS）作為一種快速、無(wú)損的檢測(cè)技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用到中藥的炮制、制劑工藝的在線監(jiān)測(cè)等方面^[8-10]。

本實(shí)驗(yàn)以麥芽“炒黃炒香”為研究對(duì)象，建立總還原糖、總氨基酸、A₄₂₀、總黃酮及含水量與NIRS之間的定量校正模型，考察麥芽在炒制過(guò)程中，Maillard反應(yīng)原料總還原糖、總氨基酸及Maillard反應(yīng)產(chǎn)物的表征參數(shù)A₄₂₀與“炒黃炒香”的關(guān)系，以及麥芽中有效成分總黃酮的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，應(yīng)用聚類分析法（hierarchical cluster analysis，HCA）、偏最小二乘判別分析法（partial least squares discriminate analysis，PLS-DA）研究成分與“炒香”的關(guān)系，確定炒制終點(diǎn)，以期為麥芽炒制工藝的評(píng)價(jià)以及功效機(jī)制闡述提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

ANTARIS Ⅱ FT-NIR 近紅外光譜儀（賽默飛世爾科技公司）；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) UV759（上海精科儀器有限公司）；電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；非接觸式紅外測(cè)溫儀（東莞萬(wàn)創(chuàng)電子制品有限公司）；水分測(cè)定儀（上海越平科學(xué)儀器有限公司）。

葡萄糖（批號(hào)A1629013）、亮氨酸（批號(hào)C1628269）均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，蘆丁對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)10080-201409）；3，5-二硝基水楊酸，氫氧化鈉，酒石酸鉀鈉，硝酸鋁，苯酚，氫氧化鈉，亞硝酸鈉，茚三酮等試劑皆為分析純。

生麥芽（產(chǎn)地安徽、江西，批號(hào)分別160401，150901，150801，1607091，16042109，15081107，1511186，1511186，1502034，1509027）分別購(gòu)自亳州市佰世信中藥飲片有限公司、江西彭氏國(guó)藥堂飲片有限公司、樟樹(shù)市慶仁中藥飲片有限公司，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)付小梅副教授鑒定為禾本科植物大麥H.vulgare的成熟果實(shí)，經(jīng)發(fā)芽干燥而得。

2 方法

2.1 近紅外樣品收集

前期研究確定麥芽的炒制溫度為220 ℃。取生麥芽1 kg，除去雜質(zhì)，將其置于已加熱到220 ℃的鍋內(nèi)，不斷翻炒，頻率為1次/s，利用非接觸式紅外測(cè)溫儀監(jiān)測(cè)炒鍋溫度。從麥芽投入鍋中開(kāi)始計(jì)時(shí)，分別在0（生麥芽），2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30 min時(shí)取出約50 g樣品，放涼，篩去灰屑，得生麥芽及不同時(shí)間炒制樣品16份。共炒制10批，總樣品數(shù)為160份。

2.2 近紅外光譜采集

室溫條件下，以空氣為背景，分辨率8 cm^-1，掃描次數(shù)64次，掃描范圍4 000～1萬(wàn) cm^-1。取麥芽，分別粉碎成最粗粉、粗粉、中粉、細(xì)粉以及麥芽顆粒（未粉碎），共5個(gè)不同粒徑的樣品，分別采集光譜，考察粒徑對(duì)近紅外光譜的影響；在確定粒徑的基礎(chǔ)上，設(shè)置裝樣厚度分別為10，15，20 mm，考察裝樣厚度對(duì)近紅外光譜的影響。在相同光譜采集條件下，重復(fù)采集同一麥芽樣品光譜9次，計(jì)算光譜RSD；另取同一批次麥芽9份，在相同光譜采集條件下采集樣品光譜，計(jì)算其RSD，考察近紅外光譜的精密性與重復(fù)性。將160個(gè)麥芽樣品進(jìn)行掃描，每個(gè)樣品掃描3次，以平均光譜為該樣品光譜。

2.3 總還原糖含量測(cè)定^[11]

精密稱取烘干至恒重的葡萄糖對(duì)照品100.0 mg，置于100 mL量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，得1.0 g·L^-1葡萄糖對(duì)照品溶液。精密吸取對(duì)照品溶液0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 mL于6支25 mL量瓶中，補(bǔ)充蒸餾水至2 mL，混勻，加入2.0 mL DNS試劑，搖勻后沸水浴中保持7 min，取出后迅速以流水冷至室溫，加蒸餾水至刻度。以相應(yīng)試劑作空白，540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密稱取麥芽樣品粗粉3 g，置于錐形瓶中，加蒸餾水100 mL，90 ℃加熱提取50 min，過(guò)濾，濾液冷卻至室溫，用蒸餾水定容至100 mL，得麥芽供試品溶液。精密吸取一定量的供試品溶液置于25 mL量瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法測(cè)定540 nm波長(zhǎng)處的吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度。方法學(xué)考察后對(duì)160個(gè)麥芽樣品中總還原糖含量進(jìn)行測(cè)定。

2.4 總氨基酸含量的測(cè)定^[12]

精密稱取亮氨酸對(duì)照品10.0 mg，置于100 mL量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，得1.0 g·L^-1亮氨酸對(duì)照品溶液。精密吸取對(duì)照品溶液 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 mL于8支25 mL量瓶中，補(bǔ)充蒸餾水至4 mL，混勻，依次加入pH 6.8磷酸鹽緩沖液1.0 mL，2%茚三酮溶液2.0 mL，于100 ℃水浴加熱15 min，室溫冷卻10 min，加蒸餾水至刻度，搖勻。以相應(yīng)試劑作空白，570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以亮氨酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密稱取麥芽樣品粗粉3 g，置于錐形瓶中，加70%乙醇100 mL，90 ℃回流提取3 h，過(guò)濾，濾液冷卻至室溫，用70%乙醇定容至100 mL，得樣品溶液。精密吸取一定量的樣品溶液置于25 mL量瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法測(cè)定570 nm波長(zhǎng)處的吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度。方法學(xué)考察后對(duì)160個(gè)麥芽樣品中總氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定。

2.5 總黃酮含量的測(cè)定^[13]

精密稱取蘆丁對(duì)照品100.0 mg，置于100 mL量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，得1.0 g·L^-1蘆丁儲(chǔ)備液。精密吸取蘆丁儲(chǔ)備液20 mL，置于100 mL量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，得0.2 g·L^-1蘆丁對(duì)照品溶液。精密吸取對(duì)照品溶液 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0 mL于10支 25 mL量瓶中，補(bǔ)充蒸餾水至10 mL，混勻，加入5%NaNO₂溶液1 mL，混勻后放置6 min，再加10% Al（NO₃）₃溶液1 mL，混勻并放置6 min，再加4% NaOH溶液10 mL，加蒸餾水至刻度，搖勻，以相應(yīng)試劑作空白，500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。麥芽總黃酮樣品處理方法同2.4項(xiàng)下樣品溶液的制備方法。精密吸取一定量的樣品溶液置于25 mL量瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線下測(cè)定方法測(cè)定500 nm波長(zhǎng)處的吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度。方法學(xué)考察后對(duì)160個(gè)麥芽樣品中總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定。

2.6 A₄₂₀的測(cè)定

麥芽在炒香過(guò)程發(fā)生Maillard等非酶促褐變反應(yīng)，其產(chǎn)物在420 nm處有最大吸收，其值A(chǔ)₄₂₀常用于表征褐變程度。取2.4項(xiàng)下樣品溶液，以蒸餾水做空白，在420 nm下測(cè)定吸光度，按公式“A_相對(duì)=A₄₂₀/取樣量”計(jì)算單位質(zhì)量的吸光度，考察麥芽在炒制過(guò)程中的褐變程度。

2.7 含水量測(cè)定

稱取樣品粉末2 g，精密稱定，水分測(cè)定儀測(cè)定含水量，每個(gè)樣品測(cè)定3次，取平均值作為樣品含水量。

2.8 NIRS模型的建立

2.8.1 異常光譜的剔除 測(cè)量?jī)x器、測(cè)量方法及環(huán)境的改變，樣品的復(fù)雜性、多樣性等許多不確定因素會(huì)導(dǎo)致異常光譜的產(chǎn)生。異常光譜的干擾是影響分析模型的重要因素，因此建立模型前，須先排除異常光譜，以使模型更加準(zhǔn)確。馬氏距離法把近紅外光譜矩陣進(jìn)行中心化處理后計(jì)算各個(gè)樣品到樣本平均光譜的馬氏距離，根據(jù)樣本馬氏距離設(shè)置閾值檢驗(yàn)異常樣品的存在。馬氏距離法剔除異常樣品能夠提高所建模型的精確性和可靠性^[14]。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用OPUS軟件，以 160 個(gè)樣品的平均光譜為參照光譜，在 95%置信限下計(jì)算樣本的馬氏距離，判斷異常光譜。

2.8.2 光譜預(yù)處理 在4 000～1萬(wàn) cm^-1對(duì)近紅外光譜分別進(jìn)行平滑、一階導(dǎo)、MSC等預(yù)處理方式，然后運(yùn)用OPUS軟件的PLS法建立麥芽中總還原糖、總氨基酸、總黃酮、A₄₂₀和含水量等5個(gè)指標(biāo)的 NIRS 定量分析模型，隨機(jī)選取樣本量的1/4為內(nèi)部驗(yàn)證集，以模型的交互驗(yàn)證誤差均方根（RMSECV）和相關(guān)系數(shù)（r）為模型評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇RMSECV值最小且r 相對(duì)較大模型的光譜預(yù)處理方法。

2.8.3 波段的選擇 NIRS全光譜中除了包含有效信息，還包含噪音等冗余信息，不僅增加了建模的工作量，而且使模型復(fù)雜化，而且在一定程度上也會(huì)影響模型的精度。目前，NIR光譜結(jié)合PLS法建立模型中，波長(zhǎng)的選擇方法主要有相關(guān)系數(shù)法、無(wú)信息變量消除法、遺傳算法、間隔偏最小二乘法等^[15]。不同的指標(biāo)在近紅外光譜中對(duì)應(yīng)的有效波段也可能不相同，本實(shí)驗(yàn)用間隔偏最小二乘法對(duì)各成分進(jìn)行最佳建模波段選擇。模型的評(píng)價(jià)與選擇同2.8.2項(xiàng)。

2.8.4 定量模型的建立 運(yùn)用OPUS 軟件，剔除異常光譜后，選擇相應(yīng)的光譜預(yù)處理方法和建模波段，隨機(jī)選擇109個(gè)樣品分別作為校正集的樣品，運(yùn)用PLS 法建立NIRS定量校正模型。以模型的相關(guān)系數(shù)（r）及校正集的預(yù)測(cè)誤差均方根（RMSEC）考察模型對(duì)校正集樣本的預(yù)測(cè)誤差，當(dāng)RMSEC較小且r相對(duì)較大時(shí)，說(shuō)明模型具有較好的預(yù)測(cè)能力。

2.9 NIRS模型的驗(yàn)證

為進(jìn)一步確定模型的預(yù)測(cè)能力，利用47個(gè)驗(yàn)證集麥芽樣品對(duì)NIRS 模型進(jìn)行外部驗(yàn)證。以驗(yàn)證集的預(yù)測(cè)誤差均方根（RMSEP）考察模型對(duì)驗(yàn)證集樣本的預(yù)測(cè)誤差，以相對(duì)預(yù)測(cè)偏差（RSEP）為模型預(yù)測(cè)能力的考察指標(biāo)，當(dāng)RMSEP與RMSEC接近，RSEP較小時(shí)，說(shuō)明模型的預(yù)測(cè)效果較好。

2.10 “炒香”終點(diǎn)的判斷

麥芽炒制過(guò)程中，由于生麥芽產(chǎn)地，批號(hào)等不同，生麥芽中各成分含量也不一樣。為了消除炒制過(guò)程中生麥芽差異性，便于對(duì)炒制過(guò)程各指標(biāo)成分的變化趨勢(shì)進(jìn)行綜合測(cè)評(píng)分析，本實(shí)驗(yàn)對(duì)各指標(biāo)成分進(jìn)行歸一化處理，得相對(duì)值（相對(duì)值=炒制樣品量/生麥芽量），以10批麥芽各時(shí)間點(diǎn)的平均相對(duì)值為y軸，以時(shí)間為x軸作圖，考察麥芽炒制中各成分變化總體趨勢(shì)；在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行HCA，PLS-DA分析后，根據(jù)貢獻(xiàn)率大小分析成分的變化規(guī)律，結(jié)合近紅外光譜模型確定炒制終點(diǎn)。

3 結(jié)果

3.1 麥芽NIRS的采集

麥芽粒徑對(duì)NIRS的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。圖1表明，麥芽顆粒（未粉碎）、最粗粉、粗粉、中粉、細(xì)粉的近紅外光譜幾乎平行，在同一波數(shù)下，其log（1/R）依次下降，為滿足在線監(jiān)測(cè)的需求，選擇麥芽顆粒采集近紅外光譜；不同裝樣厚度光譜見(jiàn)圖2。圖2表明，裝樣厚度不同，光譜會(huì)出現(xiàn)上下偏移現(xiàn)象，可能是由于光進(jìn)入固體內(nèi)部所經(jīng)過(guò)的光程不同所致，在裝樣厚度大于15 mm后，光譜高度重合，變化不明顯，故本實(shí)驗(yàn)確定裝樣厚度為15 mm；光譜精密性與重復(fù)性最大RSD分別為4.6%，5.8%，說(shuō)明采集的近紅外光譜精密性、重復(fù)性較好。

3.2 5個(gè)指標(biāo)成分測(cè)定

總還原糖、總氨基酸、總黃酮的回歸方程及線性范圍見(jiàn)表1；精密度的RSD分別為0.15%，0.14%，0.18%，精密性良好；重復(fù)性試驗(yàn)的RSD分別為1.8%，2.9%，3.5%，重復(fù)性良好；穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD分別為2.0%，0.57%，4.2%，說(shuō)明供試品溶液在顯色后1 h內(nèi)穩(wěn)定；回收率分別為98.53%，96.10%，103.2%，RSD分別為2.5%，1.6%，3.8%（N=6）。

160個(gè)樣品中總還原糖、總氨基酸、總黃酮、A₄₂₀和含水量最高分別為 28.70%，1.73%，0.55%，0.725 3，12.72%；最低分別為 0.13%，0.26%，0.27%，0.052 2，1.45%，均值是9.14%，0.85%，0.39%，0.212 3，6.06%。

3.3 NIRS模型的建立

160個(gè)麥芽樣品所得原始光譜見(jiàn)圖3；馬氏距離異常光譜判別結(jié)果見(jiàn)圖4，建模前剔除了4個(gè)異常樣品，分別為16，48，65，144號(hào)樣品；通過(guò)分析所獲得的各模型，5種指標(biāo)成分的最佳處理方式及其RMSCEV和r見(jiàn)表2；在不同的波段建立模型，5種指標(biāo)成分最佳建模波段見(jiàn)表3； 以109個(gè)樣品建立模型，考察校正集樣品的實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值的相關(guān)性，所得總還原糖、總氨基酸、總黃酮、A₄₂₀和含水量模型的相關(guān)系數(shù)r分別為0.981 0，0.956 6，0.963 3，0.992 6，0.980 0，RMSEC分別為1.47%，0.107%，0.013 5%，0.017 5 g^-1，0.471%，表明模型的相關(guān)性良好。

3.4 模型的驗(yàn)證

47個(gè)驗(yàn)證集樣本的 NIRS模型中，5個(gè)指標(biāo)的 NIRS 預(yù)測(cè)值與實(shí)際測(cè)得值都十分接近，RMSEP 分別為1.77%，0.075 7%，0.016 7%，0.021 3 g^-1，0.501%，均與校正模型的RMSEC接近，RSEP 分別為8.97%，8.52%，4.08%，8.61%，7.77%，均小于10%，可以滿足中藥實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中分析精度的要求。

3.5 麥芽“炒香”終點(diǎn)判斷

3.5.1 炒制過(guò)程動(dòng)力學(xué)研究 5個(gè)指標(biāo)相對(duì)值變化見(jiàn)圖5?？傔€原糖、總氨基酸、總黃酮、A₄₂₀、含水量的零級(jí)動(dòng)力學(xué)回歸方程分別為C_總還原糖=-0.035 7 t+0.983 8，C_總氨基酸=-0.023 4 t+1.073 7，C_總黃酮=0.012 6 t+0.988 9，C_A420=0.148 5 t+0.290 3，C含水量=-0.023 t+0.953 9，R²分別為0.950 9，0.963 5，0.948 9，0.909 3，0.986 0，回歸方程表明，總還原糖、總氨基酸相關(guān)性較好，總還原糖、總氨基酸是發(fā)生Maillard反應(yīng)的原料，因此，在麥芽炒制過(guò)程中，可能發(fā)生了Maillard反應(yīng)；A₄₂₀的R²為0.909 3，表明A₄₂₀對(duì)時(shí)間并不成線性關(guān)系，A₄₂₀可以在一定程度上表征Maillard反應(yīng)的量，A₄₂₀在0～10 min變化較小，褐變不明顯，12～20，22～26，28～30 min 3個(gè)時(shí)間段，A₄₂₀的增加速率逐漸加快；而麥芽中傳統(tǒng)有效成分總黃酮表現(xiàn)為緩慢上升，結(jié)果與其他文獻(xiàn)報(bào)道相似^[16]，可能與炒制增加藥物的溶出有關(guān)。

3.5.2 HCA分析 為進(jìn)一步考察炒制“火候”對(duì)5種指標(biāo)成分的影響，研究不同炒制時(shí)間樣品之間的規(guī)律，以歸一化處理后數(shù)據(jù)的平均值為基礎(chǔ)，以炒制品中5種成分的含量為指標(biāo)，利用SPSS 19.0軟件，對(duì)不同炒制時(shí)間樣品進(jìn)行HCA分析，結(jié)果見(jiàn)圖6，0，2，4，6，8，10 min聚為一類，此階段為炒制初始階段，可能對(duì)應(yīng)麥芽的“炒輕”階段；12，14，16，18，20 min聚為一類，此階段的樣品相較于0～10 min的樣品A₄₂₀明顯變大，炒制時(shí)此階段麥芽顏色開(kāi)始變?yōu)樽攸S色，有濃香氣，可能對(duì)應(yīng)麥芽的“炒黃”階段；22，24，26 min聚為一類，此階段的樣品A₄₂₀繼續(xù)迅速升高，炒制時(shí)此階段麥芽顏色開(kāi)始變?yōu)榻裹S色，有濃烈的焦香氣，可能對(duì)應(yīng)麥芽的“炒焦”階段；28，30 min聚為一類，麥芽顏色繼續(xù)加深，可能對(duì)應(yīng)麥芽的“炒炭”階段；綜合以上實(shí)驗(yàn)，麥芽“炒黃炒香”的時(shí)間初步確定為20 min。

3.5.3 PLS-DA分析 在麥芽炒制過(guò)程中，5個(gè)指標(biāo)成分的量均發(fā)生了變化，為得到可以反映“炒制”的主要因素，在聚類分析的基礎(chǔ)上，采用SIMCA-P 11.5軟件對(duì)4類樣品進(jìn)行PLS-DA分析，結(jié)果見(jiàn)圖7。結(jié)果表明，在麥芽炒制過(guò)程中，總還原糖、A₄₂₀、總氨基酸的VIP值均大于1，在區(qū)分麥芽不同炒制時(shí)間樣品中具有較為顯著的貢獻(xiàn)率。從另一層面說(shuō)明，炒制主要影響總還原糖、A₄₂₀、總氨基酸的含量，而對(duì)有效成分總黃酮以及含水量的影響較小。

3.5.4 基于變化率的麥芽炒香終點(diǎn)的確立 從麥芽炒制過(guò)程動(dòng)力學(xué)研究可知，麥芽炒制的過(guò)程在一定程度上可以認(rèn)為是麥芽中的還原糖、氨基酸在“熱”的作用下發(fā)生Maillard反應(yīng)的過(guò)程，炒制的“火候”會(huì)顯著影響Maillard反應(yīng)發(fā)生、發(fā)展及終止，而“火候”是指火力的強(qiáng)弱和時(shí)間的長(zhǎng)短，即“火候”是功率與時(shí)間的函數(shù)，炒制的溫度越高，時(shí)間越短，溫度越低，時(shí)間越長(zhǎng)。在中藥炒制過(guò)程中，由于炒制設(shè)備、溫度控制裝置的誤差，炒制溫度與設(shè)置的實(shí)際溫度可能存在一定的差異，因此，由于炒制溫度的差異，炒制時(shí)間也會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化。根據(jù)HCA分析結(jié)果，初步確定麥芽炒制的終點(diǎn)為20 min，在此基礎(chǔ)上分析0 min（生麥芽）、20 min時(shí)麥芽中各成分的含量，從成分變化率的角度進(jìn)一步確定麥芽“炒香”的終點(diǎn)，為麥芽炒制終點(diǎn)提供基于成分變化率的判斷方法。

在以上動(dòng)力學(xué)、HCA、PLS-DA的基礎(chǔ)上，選擇區(qū)分不同炒制時(shí)間VIP較大的總還原糖、A₄₂₀、總氨基酸量來(lái)研究麥芽的炒制過(guò)程，以確定炒香終點(diǎn)。定義0～20 min成分含量變化率（content change rate，CCR），其計(jì)算公式為“CCR_{0-20 min}=[（C_{0 min}-C_{20 min}）/C_{0 min}]×100%”，見(jiàn)表4，10批總還原糖、總氨基酸、A₄₂₀的平均變化率（CCR——）分別為80.8%，36.3%，-183%，RSD分別為11.3%，36.8%，49.5%，相對(duì)于總氨基酸、A₄₂₀而言，總還原糖RSD最小，表明總還原糖在炒制過(guò)程批與批之間的變化最小。因此，在實(shí)際炒制中，只要麥芽中還原糖含量變化率達(dá)到80%時(shí)，即已“炒香”，表明炒制達(dá)到終點(diǎn)，因此選擇總還原糖作為炒制終點(diǎn)的判據(jù)。因此，在一定的溫度范圍內(nèi)炒制麥芽，溫度高，炒制時(shí)間縮短，即無(wú)需20 min即可以達(dá)到“炒香”的目的，如溫度低，炒制時(shí)間延長(zhǎng)，炒制時(shí)間需大于20 min才可以達(dá)到“炒香”的目的。驗(yàn)證試驗(yàn)表明，麥芽中還原糖含量變化率達(dá)到80%時(shí)，麥芽顏色開(kāi)始變黃，且有香氣溢出，這與《中藥炮制學(xué)》記載炒麥芽的方法為“……炒至表面棕黃色，鼓起并有香氣時(shí)，取出……”的描述一致^[4]。

4 討論

近年來(lái)，NIRS已被用于中藥提取^[17]，藥物混合^[18]等操作工藝的在線監(jiān)測(cè)，其操作終點(diǎn)或以預(yù)設(shè)的藥物含量為判據(jù)，如當(dāng)提取液中指標(biāo)成分的含量低于預(yù)設(shè)數(shù)值時(shí)即表明終點(diǎn)到達(dá)，或以含量均勻度確定混合終點(diǎn)，或以NIRS差異度為依據(jù)來(lái)確定終點(diǎn)，這些方法各自具有一定的優(yōu)勢(shì)，但同時(shí)也有一定的適用范圍。麥芽炒制時(shí)，其成分依次隸屬于“生麥芽-炒麥芽-焦麥芽-麥芽碳”，是一個(gè)連續(xù)動(dòng)態(tài)過(guò)程，因此，樣品在炒制過(guò)程中的近紅外光譜會(huì)持續(xù)發(fā)生變化。本項(xiàng)目在考察炒制動(dòng)力學(xué)的基礎(chǔ)上，采用HCA，PLS-DA方法分析在炒制過(guò)程發(fā)生顯著變化的成分，并以此為研究對(duì)象，著重研究其“變化速率”與炒制終點(diǎn)的關(guān)系，以確定“炒香”終點(diǎn)，為在炮制、制劑過(guò)程中指標(biāo)成分持續(xù)變化的終點(diǎn)判斷研究提供參考。

中藥炒制實(shí)質(zhì)上是中藥中各成分在外界因素作用下發(fā)生變化的過(guò)程，本實(shí)驗(yàn)PLS-DA表明，麥芽中總還原糖在炒制過(guò)程中變化最大，而傳統(tǒng)意義上的總黃酮變化反而不明顯。因此，在炒制等工藝研究中，應(yīng)采用HCA，PLS-DA方法等找出可表征工藝的指標(biāo)量，如果僅選用傳統(tǒng)意義上的藥效成分為指標(biāo)，可能無(wú)法準(zhǔn)確指示工藝終點(diǎn)的到達(dá)。

NIRS分析需要大量樣品建立定量模型，以保證模型的代表性及預(yù)測(cè)的精確性，但在應(yīng)用NIRS監(jiān)測(cè)炮制、制劑工藝過(guò)程時(shí)，由于監(jiān)測(cè)的成分含量是由藥材因素（產(chǎn)地、批號(hào)）及工藝因素（火候）共同決定，如基于原始數(shù)據(jù)研究動(dòng)力學(xué)過(guò)程，可能由于藥材因素而模糊炒制工藝對(duì)“炒香”的真實(shí)影響，因此，在考察動(dòng)力學(xué)時(shí)，采用歸一化法可消除藥材因素的影響，提高優(yōu)選工藝參數(shù)的科學(xué)性。

聚類分析可將基于指標(biāo)成分分析相同或相近的樣本聚為一類，本實(shí)驗(yàn)表明，在一定時(shí)間段內(nèi)的樣本可成一類，說(shuō)明炒制時(shí)間雖然不同，指標(biāo)成分間并不存在明顯差異。因此，在中藥炮制，制劑工藝優(yōu)選研究中，也許并不存在最佳工藝“點(diǎn)”，而是存在最佳工藝“段”。

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[責(zé)任編輯 孔晶晶]