徐 平，尹 亮，石延茂，任 艷，王效華，李雙鈴，袁 美

(山東省花生研究所/農業(yè)部花生生物學重點實驗室，山東 青島 266100)

花生是我國重要的油料作物、經濟作物和出口創(chuàng)匯作物。我國花生總產量的55%用于榨油，占我國國產植物油總量的26%左右[1]。當前我國花生品種的含油量為45%～55%，平均含油量50.57%[2-3]。據(jù)測算，花生榨油原料中含油量每提高1個百分點相當于產量提高2個百分點，加工企業(yè)的效益則可提高7個百分點以上。因此，提高花生含油量，對增加油脂加工企業(yè)的經濟效益，保障國家油脂安全具有重要意義[4]。傳統(tǒng)的花生育種時間長、效率低，隨著生物技術的發(fā)展，近年來可大大縮短育種年限的分子標記輔助選擇育種方法已受到越來越多育種者的青睞。栽培花生種(ArachishypogaeaL.，AABB，2n=4×=40)為異源四倍體，可能由二倍體野生種雜交演化而來，基因組高度保守[5-6]。然而，由于單一雜交及多倍化，花生育種過程中高頻使用少數(shù)骨干親本，使得生產上應用的花生品種間遺傳背景狹窄，遺傳多樣性降低，導致在花生栽培品種間開發(fā)有效穩(wěn)定的分子標記難度增大。所以在花生栽培品種之間開發(fā)穩(wěn)定的、含油量相關的分子標記對于高油花生的育種和種質資源的鑒定具有重要意義。

花生含油量是較為復雜的數(shù)量性狀，受環(huán)境影響大。大多數(shù)學者認為花生含油量性狀同時受到加性和非加性效應的控制[7]。隨著分子生物學技術的發(fā)展，近年來花生含油量性狀的分子標記研究取得了一定的進展，開發(fā)了一系列與花生含油量相關的SSR標記。Sarvamangala等利用SSR標記技術對花生的含油量進行了QTL定位，開發(fā)了與花生含油量相關基因緊密連鎖的分子標記[8-10]。InDel(Insertion-Deletion)標記是指在近緣種或同一物種不同個體之間基因組同一位點的序列發(fā)生不同大小核苷酸片段的插入或缺失[11]。相較于SSR標記，InDel標記有更豐富的多態(tài)性，更高的特異性以及檢測方便快捷的特點[12]，并已經在水稻、玉米、結球甘藍、黃瓜、番茄、辣椒等物種中開始應用[15-20]。在花生上，已有與抗病性和莢果性狀相關的InDel標記的報道。Liu等[21]率先利用EST數(shù)據(jù)開發(fā)了48個花生的InDel標記，其中16個標記在118份材料中表現(xiàn)多態(tài)性，5個與晚斑病和番茄斑萎病毒病顯著關聯(lián)；Meng等[22]利用這48個InDel標記評估了54個花生品種的遺傳多樣性與5個莢果性狀的相關性。但是，目前尚未見與含油量相關的InDel標記的報道。本試驗在對49個花生栽培品種的轉錄組進行分析獲得了61 942個InDel位點的基礎上，通過關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)29個InDel位點與花生含油量相關?；谶@些位點，通過設計引物及比較測序，以及在171個花生品種組成的自然群體中的擴增驗證，旨在開發(fā)用于分子標記輔助高含油量育種與種質評價的InDel標記。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

171個花生栽培品種，2016年均種植于山東省花生研究所試驗基地(青島萊西)。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取

在花生苗期取健康植株上的無病蟲害幼嫩葉片100 mg，保存于-80℃冰箱?；蚪MDNA提取使用植物基因組DNA提取試劑盒(DP305-2，北京天根生化科技有限公司)，具體操作步驟參照試劑盒說明。

1.2.2 InDel引物的設計和合成

利用下載的花生二倍體野生種序列(https://www.peanutbase.org/download)和29個花生含油量相關的InDel位點信息，提取InDel位點兩端各500 bp序列，使用primer3軟件設計了29對引物，由北京華大基因有限公司(青島)合成(表1)。

1.2.3 PCR反應及DNA片段分析

PCR擴增反應體系： 2μL 50 ng/μL DNA，0.4μL dNTPs，2μL PCR buffer 溶液，1.6μL MgCl2溶液，0.2μL Taq酶，11.8μL ddH2O和2μL InDel引物，總體積為20μL。PCR反應參數(shù)：94℃變性4 min；94℃變性30 s，55℃復性30 s，72℃延伸45 s，循環(huán)35次；25℃保存。PCR產物使用QIAxcel DNA High Resolution Kit(1200)(No.929002，QIAGEN INC)在QIAxcel Advanced system，全自動核酸分析系統(tǒng)(凱杰企業(yè)管理(上海)有限公司)上進行分析。

1.2.4 PCR產物目的片段的回收、T載體連接及測序

分別對花生栽培品種Peanut 16、Peanut 20和Peanut 21進行多態(tài)性引物的PCR擴增。目的片段的回收、純化使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，具體操作步驟參照回收試劑盒說明。將回收的目的片段與pMD18-T載體(寶生物工程(大連)有限公司)連接后，使用熱激法轉化大腸桿菌Trans5α感受態(tài)細胞(北京天根生化科技有限公司)，熱激后加入200μL 無抗LB液體培養(yǎng)基，37℃震蕩1 h，取培養(yǎng)的菌液 200μL 平鋪于LB 固體培養(yǎng)基(含有氨芐青霉素)上，將培養(yǎng)皿倒置放于37℃恒溫箱培養(yǎng) 16～20 h。每個差異片段挑選12個單克隆菌落，每個單克隆菌落在300μL LB液體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素)中培養(yǎng)4 h(37℃恒溫搖床中培養(yǎng)，轉速300 r/min)。根據(jù)插入片段的大小，使用 M13引物(M13-47F：5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'；M13-48R：5'-CACAGGAAACAGCTATGACCAT-3')進行陽性克隆的篩選。其反應體系為：2μL菌液，0.4μL dNTPs，2μL PCR buffer溶液，1.6 μL MgCl2，0.2 μL Taq酶，11.8 μL ddH2O和2 μL M13-47F/M13-48R通用引物，總體積 20 μL。PCR循環(huán)參數(shù)為：94℃變性 4 min；94℃變性 30 s，55℃復性30 s，72℃延伸45 s，循環(huán)30次；25℃保存。擴增產物使用1%瓊脂糖凝膠(含核酸染料1×Super GelRed(10 000×)，US Everbright INC生產)電泳，在凝膠成像儀中檢測其擴增片段大小與原來差異片段大小相當即說明該單克隆為陽性，將每個差異片段的3個單克隆送華大基因有限公司(青島)測序。使用Lasergene軟件進行去載體序列和序列比對。

表1 InDel引物序列及其在染色體上的信息

1.2.5 粗脂肪含量測定及分子標記分析

171個花生栽培品種的粗脂肪含量測定按GB/T 14488.1-1993分析。7個含油量存在差異的品種用于引物多態(tài)性的初步篩選，171個豐富變異的花生品種用于多態(tài)性引物的進一步PCR擴增以及片段多態(tài)性分析。利用DPS 9.05軟件[23]計算花生栽培品種的含油量和分子標記的二列相關系數(shù)，進而使用繪圖軟件Origin8 繪制不同標記類型對應含油量變異箱型圖。

2 結果與分析

2.1 多態(tài)性InDel分子標記的開發(fā)

隨機選取7個花生品種(Peanut 90、Peanut 91、Peanut 92、Peanut 93、Peanut 94、Peanut 95、Peanut 97)進行29對引物的多態(tài)性分析，結果顯示在本研究設計的29對引物中，僅有1對引物(ID14-3)在不同品種中表現(xiàn)出多態(tài)性(圖1)。引物ID14-3在7個品種中可擴增出2個片段大小不同的條帶，分別記為a條帶和b條帶(分別命名為ID14-3a，ID14-3b)，片段大小在250～300 bp之間。分別對a條帶和b條帶進行克隆測序，a條帶大小為278 bp，b條帶大小為272 bp。對這兩條序列進行BLAST分析，結果表明b條帶相較于a條帶有多個位點的變異，從而造成了b條帶比a條帶小6 bp (圖2)。

2.2 InDel分子標記與含油量的相關性分析

表2表明，171個花生品種平均含油量47.52%，Peanut 20含油量最高，達54.20%，Peanut 125含油量最低，為42.20%。利用ID14-3引物擴增檢測了171份品種結果顯示，63個花生品種可擴增檢測到ID14-3a標記，108個花生品種可擴增檢測到ID14-3b標記。含ID14-3a標記的63個花生品種平均含油量46.26%，含ID14-3b標記的108個花生栽培品種平均含油量48.33%(圖3)。將ID14-3a標記賦值為1，ID14-3b標記賦值為2，利用DPS 9.05計算的二列相關系數(shù)ρ=0.51431(p=0.00000)，相關性極顯著，因此推測ID14-3b標記與花生栽培品種的高含油量相關。

圖1 分子標記ID14-3在7個花生栽培種中的多態(tài)性分析Fig.1 Amplification pattern of ID14-3 primer among 7 peanut varieties

圖2 不同花生品種ID14-3引物擴增序列的比對分析Fig.2 Alignment of sequences amplified by ID14-3 primer among different varieties 注： 框中標出的是序列插入/缺失位置。 Note: Rectangle show the position of Insertion/deletion. 表2 花生品種的含油量及其ID14-3標記的帶型 Table 2 Oil content of peanut varieties and their pattern amplified by ID14-3 primer

品種編號SerialNo.含油量(%)Oilcontent帶型Band品種編號SerialNo.含油量(%)Oilcontent帶型Band品種編號SerialNo.含油量(%)Oilcontent帶型BandPeanut151.85bPeanut5849.53bPeanut11544.81aPeanut244.16aPeanut5948.26bPeanut11649.62bPeanut350.61bPeanut6045.58bPeanut11746.83bPeanut447.72bPeanut6146.51aPeanut11848.09aPeanut549.34aPeanut6246.20bPeanut11945.46bPeanut647.82aPeanut6344.90aPeanut12047.13bPeanut745.48aPeanut6447.27bPeanut12145.54bPeanut848.67bPeanut6547.68aPeanut12243.92aPeanut948.27bPeanut6651.48bPeanut12347.23bPeanut1042.65bPeanut6746.08bPeanut12452.32bPeanut1148.94bPeanut6842.46aPeanut12542.20aPeanut1242.77bPeanut6946.65bPeanut12643.09aPeanut1348.28bPeanut7042.42aPeanut12745.25aPeanut1449.67bPeanut7146.68bPeanut12846.12bPeanut1547.51bPeanut7244.50aPeanut12947.85bPeanut1649.66bPeanut7349.91bPeanut13047.92bPeanut1745.37bPeanut7448.26aPeanut13145.61bPeanut1851.81bPeanut7544.80aPeanut13250.38bPeanut1949.56aPeanut7645.72aPeanut13345.95bPeanut2054.20aPeanut7743.57aPeanut13444.19bPeanut2151.46bPeanut7850.22bPeanut13545.53bPeanut2250.20bPeanut7953.54bPeanut13647.46bPeanut2346.85aPeanut8050.70bPeanut13745.56bPeanut2445.26bPeanut8145.23bPeanut13848.35bPeanut2544.04bPeanut8247.94aPeanut13946.34aPeanut2647.61bPeanut8345.02bPeanut14046.47aPeanut2752.03bPeanut8449.08bPeanut14143.03aPeanut2848.79bPeanut8546.28aPeanut14246.45aPeanut2952.59bPeanut8647.25aPeanut14350.97bPeanut3050.68bPeanut8752.01bPeanut14448.61bPeanut3146.15bPeanut8852.49bPeanut14546.63aPeanut3248.50aPeanut8949.32bPeanut14648.66bPeanut3343.44bPeanut9050.94aPeanut14749.78bPeanut3447.03bPeanut9146.66bPeanut14845.99aPeanut3550.97bPeanut9246.72aPeanut14947.95bPeanut3648.94bPeanut9349.04bPeanut15045.84bPeanut3748.44aPeanut9449.36aPeanut15148.22bPeanut3846.77bPeanut9551.51bPeanut15247.24aPeanut3948.04bPeanut9648.22aPeanut15344.24aPeanut4047.80aPeanut9746.96bPeanut15446.88bPeanut4143.88aPeanut9850.28bPeanut15547.74aPeanut4247.73aPeanut9949.93bPeanut15648.70aPeanut4351.12bPeanut10047.29bPeanut15745.28aPeanut4449.56bPeanut10148.49aPeanut15847.39bPeanut4549.15bPeanut10247.34bPeanut15950.19bPeanut4647.32bPeanut10348.77bPeanut16047.67bPeanut4744.34aPeanut10449.01bPeanut16150.36bPeanut4850.25bPeanut10545.36aPeanut16247.28aPeanut4944.19aPeanut10647.87aPeanut16347.96bPeanut5043.40aPeanut10747.05bPeanut16444.46aPeanut5149.53bPeanut10846.96aPeanut16547.00bPeanut5247.64aPeanut10946.40bPeanut16644.86aPeanut5342.56aPeanut11049.50bPeanut16746.32aPeanut5446.81bPeanut11152.28bPeanut16849.08bPeanut5548.89aPeanut11248.20bPeanut16947.48bPeanut5643.05aPeanut11348.02bPeanut17050.28bPeanut5750.89bPeanut11444.29aPeanut17147.32a

圖3 InDel標記ID14-3b(A)和ID14-3a(B)對應花生品種的含油量差異箱型圖Fig. 3 Box plot for oil content of peanut varieties with InDel marker ID14-3b (A) and ID14-3a (B)

3 討 論

花生栽培品種之間基因組序列高度保守使得用于分子標記輔助育種的標記開發(fā)難度大大增加。本課題組前期利用轉錄組測序的海量數(shù)據(jù)獲得的61942個InDel位點，以及2年2點共4個環(huán)境測定的含油量數(shù)據(jù)，經關聯(lián)分析獲得29個InDel位點與含油量顯著相關(Wang等，待發(fā)表)。其中ID14-3位點在171個品種組成的自然群體中的分析顯示，含ID14-3b標記的品種平均含油量比含ID14-3a標記的平均含油量高2個百分點，相關性分析顯示標記與含油量極顯著，因此推測ID14-3是與控制花生含油量相關的基因位點。

根據(jù)與花生含油量相關的29個InDel位點均設計了引物，對7個栽培品種進行篩選，最終僅有1個引物的擴增表現(xiàn)穩(wěn)定的多態(tài)性，這可能與初篩的7個品種的基因型有關。此外，本研究所用的171個花生栽培品種不包含轉錄組分析用的49個栽培品種(Wang等，待發(fā)表)，但是依然可以檢測到ID14-3所在位點的多態(tài)性，表明該引物具有通用性，可用于花生含油量的分子標記輔助育種、遺傳多樣性和遺傳圖譜的構建等研究。

引物ID14-3是根據(jù)花生野生種B04染色體上127 849 985 bp位置的InDel位點設計而來。Wang等[24]對花生脂肪酸進行QTL定位，確定花生的B04染色體上存在2個與花生脂肪酸含量相關的QTL簇，其中一個QTL簇中的分子標記IPAHM108-2恰好位于ID14-3所在的InDel位點附近，進一步證明本研究開發(fā)的ID14-3a和ID14-3b標記與花生含油量相關，可為今后花生含油量的分子標記輔助育種和精細定位等提供標記基礎。

[1] 禹山林，楊慶利，潘麗娟，等. 花生種子含油量的遺傳分析[J]. 植物遺傳資源學報，2009，10(3): 453-456.

[2] 袁美，李雙鈴，任艷，等. 正交設計法研究花生粗脂肪含量測定方法[J]. 花生學報，2007，36(4):33-35.

[3] 姜慧芳，段乃雄. 花生品種蛋白質含量、含油量及脂肪酸組成的分析[J]. 花生科技，1996(1)：29-31,33.

[4] 姜慧芳，任小平，王圣玉，等. 野生花生高油基因資源的發(fā)掘與鑒定[J]. 中國油料作物學報，2010(1)：30-34.

[5] Kochert G, Stalker H T, Gimenes M, et al. RFLP and cytogenetic evidence on the origin and evolution of allotetraploid domesticated peanut,Arachishypogaea(Leguminosae) [J]. American Journal of Botany, 1996, 83: 1282-1291.

[6] Kochert G, Halward T, Branch W D, et al. RFLP variability in peanut cultivars and wild species [J]. Theoretical and Applied Genetics, 1991, 81: 565-570.

[7] 江建華，肖美華，王曉帥，等. 花生含油量研究進展[J]. 中國農學通報，2012，28(33)：1-6.

[8] Sarvamangala C, Gowda M V C, Varshney R K. Identification of quantitative trait loci for protein content, oil content and oil quality for groundnut (ArachishypogaeaL.)[J]. Field Crops Research, 2011, 122(1):49-59.

[9] 黃莉，趙新燕，張文華，等. 利用RIL群體和自然群體檢測與花生含油量相關的SSR標記[J]. 作物學報，2011，37(11)：1967-1974.

[10] 郭建斌. 花生含油量及脂肪酸組成的QTL分析[D]. 武漢：華中農業(yè)大學，2016.

[11] Weber J L, David D, Heil J, et al. Human diallelic insertion/deletion polymorphisms [J]. American Journal of Human Genetics, 2002, 71:854-862.

[12] 楊潔，赫佳，王丹碧，等. InDel標記的研究和應用進展[J]. 生物多樣性，2016(2)：237-243.

[13] 王林友，張禮霞，勾曉霞，等. 利用InDel標記鑒定水稻育種材料的秈粳屬性[J]. 核農學報，2013，27(7)：913-921.

[14] 桂君梅，王林友，范小娟，等. 基于InDel分子標記的秈粳雜交稻與粳粳雜交稻的雜種優(yōu)勢比較研究[J]. 中國農業(yè)科學，2016，49(2):219-231.

[15] 張體付，葛敏，韋玉才，等. 玉米功能性Insertion/Deletion(InDel)分子標記的挖掘及其在雜交種純度鑒定中的應用[J]. 玉米科學，2012，20(2)：64-68.

[16] 朱東旭，王彥華，趙建軍，等. 結球甘藍相對于大白菜連鎖群特異InDel標記的建立及應用[J]. 園藝學報，2014，41 (8): 1699-1706.

[17] 張圣平，苗晗，程周超，等. 黃瓜果實苦味(Bt)基因的插入缺失(InDel)標記[J]. 農業(yè)生物技術學報，2011，19(4):649-653.

[18] 張錄霞，甘中祥，李倍金，等. 利用InDel標記鑒定加工番茄雜交種純度[J]. 分子植物育種，2016，14(6)：1533-1537.

[19] 郭廣君，孫茜，劉金兵，等. 基于辣椒基因組重測序的InDel標記開發(fā)及應用[J]. 江蘇農業(yè)學報，2015，31(6) :1400-1406.

[20] 姜童，王輝，楊延杰，等. 干制辣椒雄性不育系與保持系間多態(tài)性InDel標記的篩選[J]. 北方園藝，2017(15)：24-28.

[21] Liu L, Dang P M, Chen C Y. Development and utilization of InDel markers to identify peanut (Arachishypogaea) disease resistance [J]. Frontiers in Plant Science, 2015, 6. DOI: 10.3389/fpls.2015.00988.

[22] Meng S, Yang X L, Dang P M, et al. Evaluation of insertion-deletion markers suitable for genetic diversity studies and marker-trait correlation analyses in cultivated peanut (ArachishypogaeaL.) [J]. Genetics and Molecular Research, 2016,15(3). DOI: 10.4238/gmr.15038207.

[23] 唐啟義. DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)[M]. 北京：科學出版社，2013.

[24] Wang M L, Khera P, Pandey M K, et al. Genetic mapping of QTLs controlling fatty acids provided insights into the genetic control of fatty acid synthesis pathway in peanut (ArachishypogaeaL.) [J]. PLos One 2015, 10(4). DOI: 10.1371/journal.pone.0119454.