同源重組介導的重組病毒研究進展

趙銀龍+李健+朱海霞

摘要：病毒同源重組是以同源臂為基礎的將目的基因整合到病毒基因組中的技術。將表達盒串聯(lián)到轉移載體，通過同源重組構建重組病毒從而實現(xiàn)病毒基因改造、外源基因表達以及重組活載體疫苗制備等。就重組病毒的優(yōu)缺點、構建原理及應用進展進行了概述，對重組病毒構建的難點進行了分析，全面系統(tǒng)地闡述了重組病毒的構建模式，針對基因框（啟動子-報告基因-目的基因-調控元件-終止子）給出具體的構建方案，同時對其未來發(fā)展前景進行了展望，以期為今后重組病毒的構建提供理論基礎。

關鍵詞：同源重組；表達盒；轉移載體；重組病毒；病毒載體

中圖分類號： S852.65 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）11-0001-05

病毒分子生物學和免疫學的發(fā)展使得從事病毒研究的人員得以從分子水平上對微生物的基因進行克隆和表達，對病毒進行體外改造逐漸成為現(xiàn)代病毒分子生物學研究的熱點之一。國內外學者利用DNA重組技術先后開展了包括亞單位疫苗、合成肽疫苗和核酸疫苗等新型疫苗的研究，并取得了一定的成果，但這些疫苗大多免疫原性較低。后來人們利用基因工程技術將免疫原性基因插入病毒（如腺病毒、痘病毒、偽狂犬病毒等）構建活載體病毒，可產生一種具有常規(guī)弱毒疫苗和滅活苗效果的基因工程活載體疫苗。重組病毒作為疫苗可以部分模擬病毒入侵機體的過程，將病原的保護性抗原編碼基因片段或者重組多肽克隆入載體，誘導產生特異性反應，使機體產生相應的細胞免疫和體液免疫。

重組病毒的構建是建立在體外同源重組的基礎上，篩選一個含親本毒株的復制非必需片段，通過質粒轉移載體與病毒基因組DNA之間的同源重組將外源基因導入病毒基因組中，既保留了親本毒株的生物學特性，又可使重組病毒得到復制增殖。目前，已有多種表達病原蛋白的重組病毒構建成功，表達FMDV衣殼蛋白前體的P1-2A基因和蛋白酶3C基因的rPRV TK-/gE-/P1-2A-3C，能誘導產生高水平的中和抗體和FMDV特異的淋巴細胞反應[1]。在國內，郭萬柱教授率先系統(tǒng)地開展了偽狂犬病病毒（PRV）分子生物學研究[2]。同源重組是基因工程中常用的技術手段，在基因打靶和基因克隆方面具有重要作用。但該技術應用于重組病毒研究又不同于反向遺傳操作技術（病毒拯救）、RNA干擾和PCR改造等，該方法避免了基因的直接體外操作，不會引入額外的DNA序列，簡化了試驗步驟。Rumenapf等利用桿狀病毒囊膜糖蛋白GP64的跨膜區(qū)域（TM）和細胞質區(qū)域（CTD）在小鼠和豬中表達JEV的E蛋白也能誘導產生高效價的特異性抗體[3]。利用雞痘病毒成功表達了多種禽類病毒的保護性抗原基因，如IBDV的VP2基因、MDV的gB基因、AIV的HA基因、NDV的HN和F基因及REV的env基因等[4-8]。

1 轉移載體構建原理

1.1 表達盒的構建

為了將外源基因插入親本病毒基因組，使構建的重組病毒能真實有效地表達，必須串聯(lián)啟動子、增強子、標記基因、終止子和Poly（A）等反應元件（圖1）。其中啟動子最為重要，決定著外源基因的表達水平。一般構建表達盒帶有真核啟動子CMV、T7和SV40等就能順利啟動外源基因，也可以串聯(lián)2個啟動子。而痘病毒應用病毒自身的轉錄系統(tǒng)在胞漿內復制，所以外源基因的表達要求使用痘病毒自身的內源啟動子 P7.5/11[9-12]。P7.5/11為早晚期串聯(lián)啟動子，其結構獨特，最重要的是P7.5/11非常保守，在痘病毒科重組病毒領域有廣闊的應用前景[13]。另外，采用獨立的早晚期啟動子分別啟動報告基因和外源基因的表達（圖2），避免了翻譯時通讀的發(fā)生，增加了重組病毒的穩(wěn)定性。由于重組病毒表達的外源蛋白是宿主免疫反應的目標，因此使用病毒的晚期啟動子表達外源基因有利于病毒逃避宿主的免疫反應，建立持續(xù)感染[9]。

如果能在同一載體中插入來自不同病原的保護性抗原基因，實現(xiàn)多種抗原的共表達，這樣既可以同時對多種疾病進行預防，又可以避免疫苗載體之間的相互干擾，最大限度地發(fā)揮重組病毒的效用（圖3）。重組病毒在遺傳上可能不穩(wěn)定，連續(xù)傳代后位于相同啟動子之間的外源基因可能丟失[14]。為了降低重組病毒的遺傳不穩(wěn)定性，并克服多個相同啟動子之間可能存在的干擾現(xiàn)象[15]，在1個MFG載體上使用了2個IRES元件，使3個外源基因同時得到有效表達。目前，研究外源基因多是B細胞表位和T細胞表位、抗原肽等。進一步研究表明，應用免疫轉移電泳法也確定了許多病毒中和抗原的主要結構蛋白均為衣殼蛋白和糖蛋白，它們暴露于病毒粒子表面，可以誘導機體產生中和抗體[16]。由于傳統(tǒng)滅活疫苗是外源性抗原，不能通過MHCI類抗原遞呈途徑來有效激活T淋巴細胞，誘導的細胞免疫水平較低，因此利用病毒載體表達病原體抗原基因和適當類型的細胞因子，通過表達細胞因子來發(fā)揮特定的免疫調節(jié)作用以提高重組病毒免疫效力，很多研究者在設計的抗原基因中增加了Th刺激因子，如2B、3ABC、3D、IFN-γ以及IL-1等部分序列[17]。

1.2 外源基因的靶向位點

作為良好的重組表達系統(tǒng)，親本病毒復制非必需區(qū)的克隆與篩選是先決條件。親本病毒基因組龐大，其中許多基因是病毒復制非必需的，可供作為外源基因靶向位點。但是，外源基因在不同的部位插入病毒基因組，可能會產生不同的效果。通常是構建某段基因缺失的同源重組臂，這些基因是病毒的主要毒力基因，刪除相關的基因，使其不帶毒力或致弱毒力；但是病毒粒子仍然保持較好的抗原性，可以組裝成成熟的病毒粒子，為下一步重組病毒做準備。在重組痘病毒、腺病毒、豬偽狂犬病毒和傳染性喉氣管炎病毒等研究中，廣泛采用了TK[18]、US2[19]、US10[19]、gB[20]、gD[20]、E3[21]、FL11[22]等外源基因的靶向位點。最初確定非必需區(qū)常常采用鳥槍法，盲目地克隆病毒基因組，再用于篩選，工作量大且繁瑣。隨著各病毒全基因組的逐漸公布，復制非必需區(qū)遺傳背景研究的深入，為確定非必需區(qū)的研究建立了豐富的理論基礎，可以實現(xiàn)僅用PCR技術就能獲得靶向位點，容易進行遺傳操作。同源臂的長短也是影響重組病毒構建的重要因素，一般情況下在0.13～6.00 kbp之間都可以進行有效的重組，Amano等采用 P7.5 啟動下的lacZ作為報告基因，檢測同源臂長度對于轉染效果的影響，當片段長度在0.73～4.50 kbp范圍時，獲得同源重組得到重組病毒的概率為0.073%～0.620%，說明重組的效率主要和同源臂的長度有關，和插入的基因無關[23]。

同源臂的構建策略分為2類（圖4）。一類是外源基因靶向位點（TK為例）左右各延伸1段基因片段，因復制非必需區(qū)中包含酶切位點，單酶切后平末端需要Klenow補平，CIP去磷酸化，再去串聯(lián)表達盒（圖5），此方法連接效率低，影響同源重組；另一類是分別延伸靶向位點兩側的基因，構建非必需區(qū)中間缺失的同源臂（圖6）。人為引入酶切位點，有利于連接，提高同源重組水平，為隨后的重組病毒構建提供可靠的材料保證。

1.3 同源重組

利用PCR技術以病毒基因組為模板克隆目的基因，構建親本病毒某段非必需區(qū)缺失的突變株，含左右同源臂。由于親本病毒一般基因組龐大，而且基因組DNA又沒有感染性，不便直接操作，通常是將轉移載體分開構建，既可以保證將外源基因靈活地插入轉移載體，也可以準確地選擇合適的其他反應元件，得到表達盒和同源臂2個獨立的系統(tǒng)，解決病毒構建的前期工作。各個反應元件都需要適合的酶切位點進行串聯(lián)。最后將構建好的含有表達盒的轉移載體和脂質體共轉染病毒預先感染的哺乳動物細胞，完成同源重組。基于所設計的轉移載體特性，傳統(tǒng)的同源重組方法是親本病毒感染哺乳動物細胞后再轉染。這種方法雖然可以產生重組病毒，但將親本病毒和重組病毒分開較難，因為重組效率本身低，重組病毒與親本病毒相比更不具有生長優(yōu)勢，因而需要篩選多代才能獲得純化的重組病毒。目前常采用轉移載體和親本病毒基因組共轉染的方法，一般經3代篩選即可獲得具有感染活性的重組子，方便以后重組病毒高效地表達外源基因[24]。

利用病毒存在廣泛的復制非必需區(qū)，構建1個或多個不同病原體保護性基因的重組病毒。但病毒載體核酸序列較長，對病毒基因進行酶切和直接連接外源基因等遺傳操作比較困難，因此，同源重組在構建重組病毒的研究中嶄露頭角。實際上重組病毒的效率不高，涉及諸多影響因素：（1）病毒載體的選擇。重組子表達的量依賴于親本病毒DNA的復制情況，由于病毒的復制能力具有較強的種類特異性，需要選擇適合的載體構建不同的重組病毒。（2）外源基因的長短。插入的目的片段太長時，同源重組的效率很低，只有較短時才比較有效。（3）同源臂的長短。研究表明常用的左右同源臂片段約是 1.0 kbp，過長或過短都會影響重組。（4）就基因表達調控機理和重組活疫苗的生物安全而言，應首選病毒自身的啟動子，但是應用中要選擇強啟動子，才能使病毒滴度增高，外源基因在細胞中得以有效表達，并且有良好的免疫原性和遺傳穩(wěn)定性。（5）表達盒的串聯(lián)方式多種多樣，可以雙啟動子順向連接、雙啟動子反向連接、雙標記基因等。如果標記基因的啟動子和另外一個外源基因的啟動子是不同的，那么2個啟動子無論相對位置如何，各自的啟動效率和重組病毒的穩(wěn)定性都是一樣的，但如果2個啟動子是相同的，且啟動子的2個基因順向連接，那么重組病毒在傳代的過程中就有可能發(fā)生分子內的啟動子同源重組，將2個啟動子之間的基因剪除，從而失去這一基因的表型。最終能篩選得到不帶選擇標記的重組痘苗病毒，并具有篩選周期短、工作量小、較能準確篩選重組病毒等優(yōu)點，非常適用于疫苗株的構建[25]。

1.4 重組病毒的篩選

以報告基因對表達盒的功能進行驗證，篩選出具有高效表達蛋白能力的重組病毒。常用的途徑：（1）β-半乳糖苷酶基因（LacZ）是來自大腸桿菌乳糖操縱子中的一個基因，其最大的優(yōu)勢是易于用組織化學法檢測其原位表達，而且其表達產物對細胞的存活和生長基本無毒性作用。但由于LacZ基因組較大，約3.1 kbp，串聯(lián)它時很困難，外源基因表達盒構建會受影響。（2）gpt（黃嘌呤鳥嘌呤磷酸轉移酶）也是常用的篩選標記之一。由于在鳥嘌呤合成途徑中，催化IMP到XMP反應的是IMP脫氫酶，而MPA是該酶的不可逆阻斷劑。鳥嘌呤只能通過替代途徑在gpt的參與下合成。動物細胞本身不能合成gpt，但重組的病毒可以提供gpt從而使病毒完成核酸代謝，使細胞分裂得以生長、增殖[26]。（3）GFP來源于海洋生物水母，EGFP是一種優(yōu)化的突變型GFP，它所產生的熒光要比野生型GFP強35倍，大大增強了該報告分子的靈敏度[27]。作為動植物以及微生物基因工程研究上的一種選擇性標記，它具有檢測靈敏度高、操作簡便、對機體毒性小且不需要任何底物或輔助因子等優(yōu)點[28]。（4）胸腺嘧啶脫氫核苷激酶（thymidine kinase，TK），是核苷酸合成補救中的一種酶，能把胸苷轉化為胸苷磷酸，保證核苷酸的順利合成。在HAT選擇培養(yǎng)基中，TK基因缺陷受體細胞不生長，相反外源基因轉化細胞生長。這種篩選系統(tǒng)前提是單一選擇TK基因作為非必需片段構建重組病毒，不能被廣泛采用，十分局限。

2 病毒活載體的應用

載體是供插入目的基因并將其導入宿主細胞內表達或復制的運載工具。近幾年，以病毒載體為基礎構建的重組活載體疫苗成為疫苗研究領域的主要方向[29]。目前，作為載體的病毒多為哺乳動物病毒，如腺病毒（adenovirus）、偽狂犬病毒（Pseudorabies virus）、痘病毒（Pox virus）、桿狀病毒（baculovirus）等，其中桿狀病毒表達載體系統(tǒng)也是應用同源重組技術，是近些年研究的熱點。

2.1 腺病毒載體

腺病毒（adenovirus，Adv）屬于腺病毒科，線狀、無包膜的雙鏈DNA病毒，基因組大小約36 kbp，由240個六鄰體和12個五鄰體構成二十面體病毒殼體。五鄰體位于二十面體頂角，均有1個纖維蛋白突起與其相連，纖維蛋白頭部與腺病毒的組織親合性密切相關。腺病毒感染細胞分4個階段：感染、早期事件、晚期事件和包裝。

第1代腺病毒E1/E3基因表達盒，插入外源基因的長度可達8 kbp。去除E1區(qū)阻止了依賴E1區(qū)和E2區(qū)功能蛋白的轉錄與隨后病毒DNA的復制及病毒外殼蛋白的產生，這種方法效率很低[30]。第2代腺病毒建立在第1代基礎上，在E1、E3缺失的基礎上進一步去除E4區(qū)，減弱病毒自身蛋白表達，降低炎癥反應。第3代腺病毒載體又稱輔助病毒依賴型腺病毒載體（helper-dependent adenovirus，HD-Ad）[31]，表達系統(tǒng)分為3部分：（1）空殼載體；（2）腺病毒自身編碼序列；（3）輔助病毒。外源DNA的裝載容量提高，表達外源基因時間延長。

2.2 豬偽狂犬病毒載體

豬偽狂犬病毒（PRV）屬于皰疹病毒科中的豬皰疹病毒型。病毒基因組為線狀雙鏈DNA，長度為150 kbp，由長獨特區(qū)（UL）、短獨特區(qū)（US）、US兩側的重復序列（TRS）、內部重復序列（IRS）組成。豬偽狂犬?。≒R）是由豬偽狂犬病毒（PRV）引起的急性傳染病，每年給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經濟損失，多種家畜和野生動物均可被感染[32]。對豬偽狂犬病的控制主要是使用疫苗。豬偽狂犬病毒以其特殊的基因組結構、宿主的廣泛性和生物安全性成為研制活載體疫苗的重要載體工具。

目前，PRV基因缺失疫苗株常常是通過缺失gE、gI、gG、gC、TK等非必需基因，缺失分為單基因缺失和多基因缺失。Zhang等構建了表達口蹄疫病毒衣殼前體肽P12A和非結果蛋白3C的偽狂犬病毒載體疫苗（PRV-P12A3 C），結果表明部分仔豬的臨床癥狀減輕，囊泡出現(xiàn)延遲[33]。

2.3 痘病毒

2.3.1 雞痘病毒載體 雞痘病毒（Fowlpox virus，F(xiàn)PV）基因組大小為288 kbp，基因組是雙鏈DNA，包括1個由相同的2個9.5 kbp大小的末端倒置重復序列包圍的核心編碼區(qū)，它含有260個開放閱讀框，大小為260～309 kbp，比其他已報導的脊椎動物的基因組都大。過去對FPV基因組的研究工作，主要是利用純組織培養(yǎng)的FPV傳代毒株，并且獲得了約1/3的病毒基因組信息，包括免疫逃避假說和宿主范圍功能。雞痘病毒（FPV）是近些年來研究開發(fā)并逐漸轉向實際應用的一種新的病毒載體。為了設計更安全、有效、合理的FPV疫苗和以FPV為基礎的表達載體，要求研究者對與病毒毒力和宿主范圍有關的基因有一個全面的認識，對這些基因在病毒致病機理、免疫逃避和宿主范圍方面的作用有深入的了解。

對于雞痘病毒載體研究的內容主要集中在雞痘病毒載體啟動子的優(yōu)化，提高外源基因在雞痘病毒載體中的表達需要強啟動子，F(xiàn)PV自身啟動子研究還不夠詳細、表達量偏低。目前大部分雞痘病毒載體都選用痘苗病毒（Vaccina virus，VV）的早、晚期啟動子[34]。

2.3.2 羊痘病毒載體 羊痘病毒是痘病毒科（Poxviridae），脊索動物痘病毒亞科（Chordopoxrinae），羊痘病毒屬（Capripox virus）成員?；蚪M由共價結合的雙股DNA組成，基因組呈線性，全長約150 kbp，DNA無感染性，編碼至少147種基因。病毒基因組保守區(qū)的非復制區(qū)域可以整合外源DNA，羊痘病毒是繼痘苗病毒和禽痘病毒（Fowlpox virus，F(xiàn)PV）之后一種重要的動物病毒載體，因為對人不具有感染性，對外源基因的耐受性強，是一種更為理想的活病毒載體。羊痘病毒毒力有關基因如胸苷激酶基因（TK）、核苷酸還原酶基因（RR）、蛋白激酶基因（RK）和P32基因等。TK基因缺失不影響病毒的增殖，卻能顯著降低病毒毒力，TK基因缺失的羊痘病毒被廣泛地應用于疫苗的研究中。

羊痘病毒基因組龐大復雜，不易在某一個特定的位置直接插入外源基因，所以要先利用1個質粒載體構建1個轉移載體。不僅可以預防羊痘的發(fā)生，還可以插入其他外源病毒保護性抗原，重組病毒所表達的外源基因隨載體病毒復制、轉錄、蛋白合成加工，誘導產生針對相應病原的免疫應答。Diallo 等構建了表達小反芻獸疫病毒（Peste des petits ruminants virus，PPRV）H基因的重組山羊痘病毒，動物試驗中需要 10 TCID50 才能保護小反芻獸疫[35]。張強等構建了 Asia1 型口蹄疫病毒P1-2A和3C基因的重組山羊痘病毒弱毒株[36]。

2.3.3 痘苗病毒載體 痘苗病毒基因組的大小約為 187 kbp，可以編碼150～200種多肽，包括早期蛋白和晚期蛋白。以侵入細胞后病毒DNA開始復制的時間為界，人為地將病毒復制分為早期和晚期2個過程。其中應用得最多的是早、晚期蛋白啟動子P7.5。而痘苗病毒基因組允許插入較長的外源DNA片段（25 kbp）并且不會造成病毒感染性的喪失[37]。目前有很多痘苗病毒毒株用作載體表達各種類型的外源基因，較為常用的毒株是痘苗病毒W(wǎng)R株（western reserve strain）。此外，還有很多毒株如痘苗病毒天壇株[38]、Wyeth株、Copenhagen株及NYCBH株等。

2.4 桿狀病毒載體

桿狀病毒（baculovirus）是一類具有囊膜包裹的雙鏈環(huán)狀DNA病毒，自然界中主要感染鱗翅目、膜翅目和雙翅目昆蟲。其基因組大小為80～160 kbp，位于直徑為30～60 nm、長 300 nm 的桿狀核衣殼中，具有較大的柔韌性，可以容納較大片段的外源基因插入。苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（Autographa californica multicapsid nucleo polyhedro virus，AcMNPV）是眾多桿狀病毒中研究最多的。它異于其他病毒載體，成為病毒載體研究熱點是因為桿狀病毒表達載體適合翻譯后修飾和重組蛋白的高水平表達。有研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲桿狀病毒可以進入多種哺乳動物細胞，并在合適的哺乳動物啟動子控制下表達外源基因，但其基因組在細胞中不復制，且對哺乳動物細胞的生長無明顯影響[39]。Lu等研究發(fā)現(xiàn)含有PRRSV ORF7的C端編碼區(qū)域的特異shRNA的VSV-G假型化桿狀病毒成功地抑制了PRRSV在Marc145細胞中的復制[40]。Starkey等構建了表達乙肝病毒（Hepatitis B virus，HBV）特異的shRNA重組桿狀病毒，在體外能成功地阻斷HBV復制[41]。由于桿狀病毒具有最理想疫苗轉移載體的典型特征，所以桿狀病毒作為哺乳動物基因轉運載體不斷發(fā)展，研究也表明桿狀病毒載體是疫苗發(fā)展過程中極其有效的工具。

3 重組病毒的優(yōu)、缺點

新型重組病毒不斷涌現(xiàn)，不但保持了原有病毒的優(yōu)點，更對許多不足之處作出了重大改進，從而使這方面的研究有了新突破，重組病毒表達外源基因的優(yōu)點在于：（1）宿主范圍廣，可用于多種動物，也包括人類。（2）有大量的非必需片段可用作插入外源基因的位點，方便串聯(lián)表達多個目的片段，構建多價苗。（3）免疫期長，可對機體產生持久的免疫力。（4）安全性好，易于被人們接收，目前常采用基因操作技術，將病原微生物中與致病性有關的毒力基因敲除或插入其他外源基因，使之成為無毒株或弱毒株。（5）重組毒易于大量生產、成本低、保存和使用相對比較方便。（6）誘導位點專一，免疫方式簡單、易控制。但是在實際應用中也發(fā)現(xiàn)，重組病毒目前也存在許多不可忽視的缺點：（1）與臨床要求相比，病毒滴度低。（2）重復給予時機體可能產生免疫耐受。（3）在體外獲得同源重組的效率很低，并且有可能造成外源基因的丟失而喪失感染性?？傊?，利用重組病毒可治療一些特殊疾病，同時探索病毒載體所面臨的安全性和毒性問題[42]。但是，需要進一步改善和開發(fā)能高效轉移基因、表達高度組織特異性、安全可靠的重組病毒。

4 總結與展望

通過體外連接構建重組病毒的方法，其基本過程是將含外源基因的轉移載體與經過酶切處理的親本毒株基因組DNA臂在體外同源重組，然后將連接產物轉染已預先感染親本病毒的哺乳動物細胞，這種嵌合的基因組在親本病毒的作用下組裝成為重組病毒粒子。這種技術可在DNA靶標分子的任意位點進行基因敲除、敲入、點突變等操作，利用這種方法構建重組病毒首先要滿足一個基本條件，就是從親本病毒基因組復制非必需區(qū)內找到一個唯一的限制性內切酶位點或通過基因操作技術在基因內引入適當?shù)奈稽c，以供外源基因的插入。TK、gE、gI基因決定病毒的毒力，為重要的毒力因子。TK基因的缺失能顯著降低病毒毒力，但不影響病毒的增殖，是外源基因插入的首選位點[43]。但要在重組病毒領域有重大突破，還有大量的工作要做。首先對親本毒株基因組的認識還有待進一步深入，其次了解親本毒株各個基因的精確功能也很重要，基于感染重組病毒疫苗應用到自然宿主以后，有可能發(fā)生毒力返強的現(xiàn)象。另外，重組病毒毒株在自然環(huán)境下能否與流行毒株發(fā)生基因組交換或重組，也是需要考慮的。

重組病毒可用于基因治療、活載體疫苗、轉基因動物、基因功能研究等領域，以病毒為載體構建重組病毒有助于蛋白的體外表達及功能研究，同時對研究病毒的致病機理和研制活載體疫苗都有積極作用[44]。近些年，科研人員對重組病毒進行了大量的研究，重組病毒技術得以不斷成熟和完善，進一步提高了重組病毒的安全性，優(yōu)化了不同表達盒及病毒載體。另外，多價載體疫苗將是未來疫苗開發(fā)研究的主要方向之一，構建一個成功而實用的重組病毒疫苗，并進行動物免疫試驗，實現(xiàn)一針多效，達到免疫接種的目的，為下一步商業(yè)化疫苗奠定了堅實的理論基礎?？傊S著病毒分子生物學研究不斷深入和研究方法不斷更新，重組病毒將取得更大的突破，有望獲得更廣泛的應用前景。

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