不對(duì)稱PCR的引物濃度優(yōu)化及在柑橘基因型分析上的應(yīng)用

魏召新+朱世平+陽(yáng)佳位

摘要：對(duì)柑橘不對(duì)稱PCR的引物比例濃度進(jìn)行優(yōu)化篩選，并以不同柑橘品種的基因組片段為模板驗(yàn)證不對(duì)稱PCR在柑橘品種基因型分析中的可行性。結(jié)果表明，不對(duì)稱PCR雙側(cè)的引物最佳濃度因引物不同而不同，當(dāng)濃度為10 ∶1時(shí)均能達(dá)到理想效果，可見不對(duì)稱PCR可以用于柑橘基因型分析。

關(guān)鍵詞：不對(duì)稱PCR；單鏈構(gòu)象多態(tài)性；柑橘；引物濃度比；基因型分析

中圖分類號(hào)： S666.201 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）11-0046-02

不對(duì)稱PCR利用不等量的一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生單鏈產(chǎn)物（ssDNA），這對(duì)引物分別稱為非限制性引物與限制性引物。在PCR反應(yīng)的最初10～15個(gè)循環(huán)中，其擴(kuò)增產(chǎn)物主要是雙鏈DNA（dsDNA），但當(dāng)限制性引物消耗完后，非限制性引物引導(dǎo)的PCR就會(huì)產(chǎn)生大量的單鏈產(chǎn)物。不對(duì)稱PCR作為一個(gè)基礎(chǔ)試驗(yàn)技術(shù)，方法簡(jiǎn)單、成本低廉、用途廣泛，用于制備單鏈模板以用于雙脫氧測(cè)序[1]，用于cDNA擴(kuò)增以研究真核生物的DNA外顯子[2]，用于單鏈探針制備[3]，還可與酶聯(lián)免疫法結(jié)合檢測(cè)柑橘CTV病毒[4]，甚至結(jié)合毛細(xì)管電泳技術(shù)對(duì)人進(jìn)行疾病診斷[5]。

不對(duì)稱PCR制備ssDNA須多次摸索優(yōu)化2條引物的比例。常規(guī)不對(duì)稱PCR是利用單側(cè)引物進(jìn)行一次PCR，然后進(jìn)行電泳檢測(cè)，這種方法要消耗大量的DNA模板。而二次PCR是先用等濃度的引物PCR擴(kuò)增制備dsDNA，然后以此dsDNA為模板，再以其中的一條引物進(jìn)行第2次PCR，制備ssDNA，大大減少模板的消耗量，產(chǎn)生的dsDNA與ssDNA由于分子量不同可以在電泳中分開，并可利用單鏈構(gòu)象多態(tài)性鑒別不同樣品之間的差異。

利用不對(duì)稱PCR進(jìn)行基因差異分析，不僅具有PCR-SSCP研究單核苷酸多態(tài)性（SNP）的功能，而且簡(jiǎn)化了操作步驟，提高了工作效率。柑橘資源豐富、品種繁多、種屬間易于雜交、芽變材料多、基因組大（約367 Mbp）[6]，隨著甜橙[7]和單倍體克里曼丁橘[8]成功測(cè)序推動(dòng)，SNP研究必將得到進(jìn)一步拓展和深化，盡管有利用不對(duì)稱PCR對(duì)基因突變效率進(jìn)行檢測(cè)的報(bào)道[9]，但利用SNP應(yīng)用于柑橘基因研究方面還比較少，因此本試驗(yàn)對(duì)不對(duì)稱PCR體系中上下游引物濃度比進(jìn)行優(yōu)化，并以柑橘為材料進(jìn)行基因型研究的可行性。

1 材料與方法

根據(jù)柑橘的基因序列設(shè)計(jì)3對(duì)引物，產(chǎn)物片段長(zhǎng)度在 100～300 bp。采用二次PCR方式，均采用25 μL體系，ddH2O 18.35 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTPs（25 mmol/L）1.0 μL，MgCl2 1 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，rTaq 0.15 μL，模板1.0 μL。引物M1源于Unigen Cit.47.1，上游引物為5′-CCGAGAAAACGCAAAAGCTA-3′，下游引物為5′-TTGTACTCGAGCAGCGACAC-3′。引物M2源于Unigen Cit.107.1，上游引物為5′-CCCTGAGACGAAGAACAAGG-3′，下游引物為5′-CTGGCAAGCAACTGGAAGAC-3′。引物M3源于Unigen Cit.10080.1，上游引物為5′-ACCATGACCGCTGAGGAATA-3′，下游引物為5′-GGAAAACAGGGCAACTTCAG-3′。其中，第2次PCR引物對(duì)在一側(cè)引物保持原濃度的條件下，另一側(cè)引物按比例稀釋，模板以第1次PCR產(chǎn)物稀釋100～200倍后，各組分均按第1次PCR體系體積加入反應(yīng)體系。

PCR反應(yīng)條件沿用前期優(yōu)化過(guò)的PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸 30 s，33 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 延伸10 min 。取3 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，加6 μL 98%去離子甲酰胺，10 mmol/L EDTA（pH值8.0），0.25% 二甲苯青，0.25%溴酚藍(lán)變性劑混勻，上樣于10%聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE），10 ℃ 110 V條件下電泳5 h，銀染顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 不對(duì)稱PCR引物濃度比優(yōu)化

以特洛維塔甜橙的DNA為模板，采用M1和M2引物對(duì)進(jìn)行引物不同濃度的不對(duì)稱PCR比較，電泳結(jié)果見圖1和圖2。圖1和圖2中各對(duì)應(yīng)的泳道其產(chǎn)物PCR條件和電泳條件均相同，唯一不同的是引物，電泳后的效果差異明顯，圖1中上下游引物從40 ∶1時(shí)產(chǎn)物帶開始明顯不清晰，但圖2中的單雙鏈產(chǎn)物始終存在。

由圖1的電泳結(jié)果可見，隨著單側(cè)引物濃度的降低，雙鏈產(chǎn)物和單鏈產(chǎn)物也逐漸減少，上下游引物比例在10 ∶1時(shí)，單鏈產(chǎn)物量未明顯降低，不影響產(chǎn)物電泳及顯色觀察；上下游引物比例變?yōu)?0 ∶1時(shí)，單鏈產(chǎn)物量明顯減少。此外，在上下游引物濃度比為1 ∶5、1 ∶10、1 ∶20和1 ∶40時(shí)，帶型明顯不能對(duì)應(yīng)正常PCR-SSCP的帶型，而引物相反濃度的電泳結(jié)果正確對(duì)應(yīng)正常PCR-SSCP的帶型，這說(shuō)明下游引物所產(chǎn)生的單鏈之間形成了多種構(gòu)象。

由圖2的電泳結(jié)果可見，M2引物對(duì)不同濃度比例的優(yōu)化結(jié)果有所不同，隨著單側(cè)引物濃度的增加，雙鏈產(chǎn)物也逐漸增加，但單鏈產(chǎn)物量增加不明顯。此外，在上下游引物濃度比例為80 ∶1、60 ∶1、40 ∶1和20 ∶1的電泳圖中，可見一特殊條帶（圖2中箭頭所示），此條帶僅在下游引物中出現(xiàn)，在相反的上下游引物濃度比中未出現(xiàn)，并且不能對(duì)應(yīng)到正常PCR-SSCP的帶型，這應(yīng)該是下游引物產(chǎn)生的單鏈之間形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

2.2 不同模板的不對(duì)稱PCR驗(yàn)證

由圖3中電泳結(jié)果可見，以模板1、2、3、4進(jìn)行不對(duì)稱PCR所得產(chǎn)物帶型因模板不同而相同。同一個(gè)模板，因上下游引物濃度比例不同也會(huì)產(chǎn)生不同的帶型，通過(guò)比較上下游引物不對(duì)稱PCR的帶型和常規(guī)PCR-SSCP的帶型，可以推斷帶型的來(lái)源。反之，可以以不對(duì)稱產(chǎn)物帶型的不同推斷產(chǎn)物之間存在差異，以此鑒別產(chǎn)物的差異，也可以判斷不同材料的基因型以進(jìn)行聚類分析。

圖3中1、2、3和4由左至右依次是以不同的柑橘品種特洛維塔、圓金柑、長(zhǎng)壽金柑和紅河大翼橙為模板，利用M3引物對(duì)按上下游引物1 ∶1常規(guī)PCR-SSCP、10 ∶1和1 ∶10進(jìn)行二次不對(duì)稱PCR的結(jié)果。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過(guò)不對(duì)稱PCR研究單側(cè)引物在雙鏈模板上延伸的合理?xiàng)l件，同時(shí)探索利用該方法進(jìn)行基因型鑒定的可行性。以上試驗(yàn)結(jié)果表明，不對(duì)稱PCR可以用于單鏈產(chǎn)物擴(kuò)增，也可以用于部分柑橘品種區(qū)分、等位基因分析及目標(biāo)片段的基因型鑒定。

不對(duì)稱PCR反應(yīng)擴(kuò)增長(zhǎng)度有限，在多次試驗(yàn)中，目標(biāo)片段長(zhǎng)度在500 bp以上的結(jié)果均不理想，因此利用普通Taq酶進(jìn)行不對(duì)稱PCR時(shí)，所擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度不宜過(guò)長(zhǎng)，一般宜控制在500 bp以下。而研究長(zhǎng)片段時(shí)，宜改用或改進(jìn)試驗(yàn)方法，Sofia等在研究歐洲栗內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶基因的一段片段（1 231 bp）時(shí)，就改用了不對(duì)稱巢式PCR技術(shù)，采用多個(gè)引物進(jìn)行研究[10]。此外，用其他方法可以對(duì)引物進(jìn)行常規(guī)預(yù)擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)PAGE檢測(cè)目標(biāo)雙鏈僅1條帶，無(wú)雜帶干擾，以獲得帶型簡(jiǎn)單易于分析的結(jié)果。從本試驗(yàn)結(jié)果比較可見，不同引物的PCR效率是不同的，甚至模板也能影響引物的擴(kuò)增效率，因此必要時(shí)可以對(duì)引物進(jìn)行初步篩選或結(jié)合其他方式進(jìn)一步分析，Gruz等利用不對(duì)稱PCR技術(shù)結(jié)合熔解曲線分析能夠?qū)魏塑账岫鄳B(tài)性進(jìn)行高通量的基因分型[11]。

常規(guī)的PCR條件下，不對(duì)稱PCR所使用的引物的量不同，一次PCR所獲得單鏈產(chǎn)物較少，要獲得更多單鏈產(chǎn)物，模板濃度應(yīng)足夠大，或進(jìn)行二次PCR。盡管曾鴻普等一次不對(duì)稱PCR就得到了較為清晰的結(jié)果[12]，但在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，第1次PCR產(chǎn)物稀釋100～200倍后作為二次PCR的模板進(jìn)行不對(duì)稱PCR，不僅大大減少了模板用量，而且?guī)颓逦?、易于分析，結(jié)果更為理想。

單側(cè)引物濃度不變，另一側(cè)引物稀釋為原濃度的1/10后進(jìn)行不對(duì)稱PCR，目標(biāo)雙鏈和單鏈產(chǎn)物帶清晰，濃度比例較為適當(dāng)，也說(shuō)明二次不對(duì)稱PCR同時(shí)使用上下游引物更容易獲得高濃度的dsDNA。此外，本試驗(yàn)結(jié)果表明單鏈產(chǎn)物在利用單鏈構(gòu)象多態(tài)性進(jìn)行凝膠檢測(cè)時(shí)，單鏈在凝膠上所體現(xiàn)的形式因單鏈產(chǎn)物及其自身所形成的構(gòu)象不同而可能有多種，因此基于SSCP的產(chǎn)物檢測(cè)應(yīng)注意在相同條件下進(jìn)行多重比較，以避免誤判，方能獲得更為可靠的分析結(jié)果。

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