蜻蜓鳳梨AfERF109基因的克隆及響應(yīng)乙烯的表達(dá)特性分析

雷明+王之+王加賓

摘要：以熱帶觀賞花卉蜻蜓鳳梨（Aechemia fasciata）為材料，在分析蜻蜓鳳梨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合cDNA末端快速擴(kuò)增（rapid amplification of cDNA ends，簡稱RACE）技術(shù)克隆了APETALA2/乙烯反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（APETALA2/Ethylene Response Element Binding Protein，簡稱AP2/EREBP）家族的1個轉(zhuǎn)錄因子編碼序列，并將其命名為AfERF109。AfERF109基因cDNA全長939 bp，開放閱讀框（open reading frame，ORF）長762 bp，編碼的蛋白含253個氨基酸殘基。AfERF109分子量為28.275 1 ku，理論等電點(diǎn)為5.24；AfERF109不含信號肽和跨膜域，預(yù)測其定位于細(xì)胞核；AfERF109含有1個典型的AP2結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域的二、三級結(jié)構(gòu)構(gòu)象保守；系統(tǒng)進(jìn)化分析該蛋白分屬ERF亞族的B-4類。實(shí)時熒光定量PCR分析表明，AfERF109轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量隨著植株年齡的增長上調(diào)，在開花后的花柄中表達(dá)量最高。此外，AfERF109轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量受外源乙烯處理呈現(xiàn)正調(diào)控趨勢。研究結(jié)果初步證實(shí)AfERF109參與乙烯調(diào)控路徑，可能參與蜻蜓鳳梨營養(yǎng)生長到生殖生長的時期轉(zhuǎn)換及花柄的發(fā)育，為進(jìn)一步研究AfERF109基因功能、通過基因工程手段調(diào)控蜻蜓鳳梨開花提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：蜻蜓鳳梨；AfERF109；克隆；乙烯；表達(dá)特性分析

中圖分類號： S668.301 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）11-0051-06

鳳梨科植物（Bromeliaceae）原產(chǎn)于南美洲，是一類廣泛分布于熱帶亞熱帶地區(qū)、形態(tài)多樣的植物之一[1-2]。人工栽培種中，按照用途可以將其分為重要的熱帶水果——食用鳳梨（俗稱菠蘿，Ananas comosus）和重要的熱帶花卉——觀賞鳳梨。常用作觀賞的鳳梨品種有光萼荷屬（Aechmea）、果子蔓屬（Guzmania）、鐵蘭屬（Tillandsia）、彩葉鳳梨屬（Neoregelia）、 水塔花屬（Billbergia）、 姬鳳梨屬（Crytanthus）、 巢鳳梨屬（Nidularium）等[3]。觀賞鳳梨株型優(yōu)美、花型奇特、花期持久，相應(yīng)市場發(fā)展突飛猛進(jìn)，已成為僅次于蘭花和紅掌的第三大熱帶花卉[4]。

為了滿足市場需求，調(diào)節(jié)上市時間，生產(chǎn)上普遍使用乙烯及其衍生物促進(jìn)鳳梨科植物開花。利用14C標(biāo)記的乙烯利處理鳳梨的結(jié)果表明，其吸收外源乙烯的部位為葉片[5]。阻斷內(nèi)源乙烯合成后，鳳梨在乙烯誘導(dǎo)和自然生長條件下開花時間均顯著延遲[6-8]，這表明施加外源乙烯及其衍生物增加了內(nèi)源乙烯含量，從而促進(jìn)了鳳梨開花，但一直以來內(nèi)源乙烯調(diào)控鳳梨等鳳梨科植物開花的機(jī)制并不清楚。

作為一種植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，乙烯參與了種子萌發(fā)、幼苗生長、開花誘導(dǎo)、果實(shí)成熟、器官衰老和病原菌響應(yīng)等植物生長發(fā)育過程[9-10]。在擬南芥中，乙烯受體蛋白結(jié)合乙烯后抑制了Raf-like Ser/Thr 蛋白酶 CONSTITUTIVE TRIPLE RESPONSE1（簡稱CTR1）的磷酸化能力，激活膜蛋白ETHYLENE INSENSITIVE2（簡稱EIN2），使得轉(zhuǎn)錄因子EIN3在核內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)[11-14]。EIN3蛋白則通過結(jié)合到Ethylene Response Factors（ERFs）基因（如ERF1）的啟動子區(qū)，調(diào)控后者的表達(dá)，最終啟動植物體對各種信號的應(yīng)答響應(yīng)[15]。

ERFs基因編碼的是一類家族蛋白，這類蛋白屬于APETALA2/Ethylene Response Element Binding Protein（簡稱AP2/EREBP）家族。以前一直認(rèn)為AP2/EREBP家族為植物所特有，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于植物、原生生物、藍(lán)藻和真菌中[16-17]。AP2/EREBP家族蛋白的共同特點(diǎn)是含有1或2個保守的AP2結(jié)構(gòu)域。ERFs屬于AP2/EREBP家族中的1個亞族，該亞族成員含有1個AP2結(jié)構(gòu)域，大部分為轉(zhuǎn)錄激活因子，少部分為轉(zhuǎn)錄抑制因子[18-22]。ERFs轉(zhuǎn)錄因子主要通過結(jié)合到靶基因啟動子區(qū)的核心AGCCGCC（簡稱GCC盒）順式元件和（或）干旱響應(yīng)元件（dehydration-responsive elements，簡稱DREs/CRT）上應(yīng)答生物和非生物脅迫，功能廣泛[23-27]。

目前關(guān)于乙烯促進(jìn)觀賞鳳梨科植物開花分子機(jī)制的研究相對較少。Li等曾通過轉(zhuǎn)錄組分析在蜻蜓鳳梨中篩選到一些響應(yīng)乙烯的AP2/EREBP家族基因[28]，Lei等證明了AP2/EREBP家族中的1個AP2同源基因AfAP2-1響應(yīng)了外源乙烯處理，且在擬南芥中過表達(dá)顯著延遲了開花[29]。筆者從蜻蜓鳳梨（Aechmea fasciata）中克隆到1個ERF亞族蛋白編碼基因AfERF109，通過實(shí)時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，簡稱qRT-PCR）技術(shù)研究其組織表達(dá)特異性，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)響應(yīng)了外源乙烯處理，為進(jìn)一步解析乙烯調(diào)控其表達(dá)的分子機(jī)制、通過基因工程手段調(diào)控鳳梨科植物生長發(fā)育的研究提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

蜻蜓鳳梨取自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所離體保存與繁育研究室大棚，環(huán)境溫度為30～32 ℃。所用材料均為移栽成活的試管苗，幼株為成活后株齡6個月的植株；成株為成活后株齡11～14個月的植株。外源乙烯利處理時，取10 mL體積分?jǐn)?shù)為400 μL/L的乙烯利灌心分別處理1、6、24 h，以清水灌心的材料為對照。不同組織材料在處理后迅速于液氮中冷凍，之后置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取及cDNA第1條鏈的合成

蜻蜓鳳梨總RNA的提取采用改良的CTAB法[30]。cDNA第1條鏈的合成采用TranScript-Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒（法國Transgene股份有限公司）。

1.3 5′和3′ RACE

克隆目的基因的5′和3′ RACE模板參照SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit說明書合成（美國Clontech公司）。PCR擴(kuò)增得到的特異性條帶采用美國OMEGA公司的膠回收試劑盒進(jìn)行回收。純化后的特異條帶分別連接到pEASY-blunt克隆載體上，測序。

1.4 生物信息學(xué)分析

用DNAMAN 6.0軟件比對氨基酸序列的同源性；用MEGA 6軟件和鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹；其他生物信息學(xué)分析軟件見表1。

1.5 實(shí)時熒光定量PCR

運(yùn)用Primer premier 5.0 設(shè)計用于實(shí)時熒光定量PCR的各基因特異性引物。選用TransStart Tip Green qPCR SuperMix（法國Transgene股份有限公司）進(jìn)行PCR反應(yīng)，在Therma PikoReal 96TM熒光定量PCR儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）上進(jìn)行。反應(yīng)體系（10 μL）：qRT-PCR混合反應(yīng)液SuperMix 5 μL，模板1 μL，正反向引物各0.3 μL，滅菌的去離子水補(bǔ)齊至10 μL；反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性7 min；在95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s的條件下擴(kuò)增40個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后于65 ℃ 30 s，20 ℃停止。每個樣品2個生物學(xué)重復(fù)，3次技術(shù)重復(fù)。數(shù)據(jù)分析采用雙delta法，選取蜻蜓鳳梨的β-actin（AfACTB）為內(nèi)參。通過制作標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率。所有引物序列見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 AfERF109 cDNA全長的克隆與序列分析

以蜻蜓鳳梨心葉cDNA為模板，利用RACE及PCR技術(shù)獲得1條長度為939 bp的AP2/EREBP家族基因的cDNA序列。分析后發(fā)現(xiàn)，其5′非編碼區(qū)、3′非編碼區(qū)長度分別為40、137 bp（包括30 bp的polyA）。該cDNA序列有1個762 bp的開放閱讀框，編碼253個氨基酸殘基。Blast比對后發(fā)現(xiàn)，該cDNA編碼序列與很多植物中AP2/EREBP家族中ERF亞族的ERF109或ERF109-like具有很高的相似性，故將其命名為AfERF109。

2.2 AfERF109屬于ERF亞族的B-4類

結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，AfERF109具有1個典型的AP2結(jié)構(gòu)域（圖1-A），因此，為了進(jìn)一步分析AfERF109蛋白的一級結(jié)構(gòu)特性，筆者將其與其他物種中的ERF109蛋白進(jìn)行同源性比對，結(jié)果表明，AfERF109與海棗（Phoenix dactylifera）的ERF109、油棕（Elaeis guineensis）的ERF109、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）的ERF109、小果野芭蕉（Musa acuminata subsp. malaccensis）的ERF109和小米（Setaria italica）的ERF109分別具有48.86%、48.34%、45.36%、45.21%、44.24%的同源性（圖1-B）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，AfERF109的AP2結(jié)構(gòu)域包含保守的YPG和RAYD元件（圖1-B）。此外，該保守的AP2結(jié)構(gòu)域的第14位和第19位分別為保守的丙氨酸（Ala，A）和天冬氨酸（Asp，D）殘基（圖1-B）。因此，根據(jù)這些結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，AfERF109被歸為AP2/EREBP家族的ERF亞族。

已知ERF亞族又可以分為B-1到B-6共6類，因此，為了進(jìn)一步分析AfERF109的類別，筆者將其與擬南芥ERF亞族B-1到B-6類別中的部分蛋白序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AfERF109在進(jìn)化關(guān)系上并不與AtERF109同屬于B-3類，而是與擬南芥RAP2.6和RAP2.6L等的進(jìn)化關(guān)系最近，同屬于B-4類（圖2）。

2.3 AfERF109是定位于細(xì)胞核的酸性親水蛋白

為了進(jìn)一步了解AfERF109蛋白的特性，筆者對其一系列理化性質(zhì)進(jìn)行了分析。ProtoParam在線軟件分析表明，AfERF109的分子量為28.275 1 ku，理論等電點(diǎn)為5.24；總平均親水性（grand average of hydropathicity，簡稱GRAVY）、脂肪系數(shù)（aliphatic index）分別為-0.892、56.80，表明AfERF109屬于酸性親水蛋白類，脂溶性較差。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證AfERF109的親疏水性，筆者利用ProtScale在線軟件對其進(jìn)行進(jìn)一步的分析該蛋白的絕大部分氨基酸都是親水性氨基酸（圖3-A），因此，AfERF109為親水性蛋白。為了解析AfERF109是否具有跨膜區(qū)，筆者利用TMHMM在線軟件對其進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該蛋白中可能位于跨膜螺旋中的氨基酸殘基數(shù)的分值為 0.421 56，遠(yuǎn)小于18，故推測其不含跨膜區(qū)（圖3-B）。進(jìn)一步用SignalP 4.1在線軟件對AfERF109信號肽預(yù)測的結(jié)果表明，該蛋白序列中不含信號肽（圖3-C）。AfERF109屬于AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子家族，理論上可結(jié)合到靶標(biāo)基因的啟動子區(qū)順式作用元件上調(diào)控后者的表達(dá)。因此，為了了解其是否定位于細(xì)胞核，筆者用ProtComp軟件進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明，AfERF109在核中的分值為6.15（總分為10），極有可能是一種定位于細(xì)胞核的非分泌蛋白。

2.4 AfERF109的二級和三級結(jié)構(gòu)

蛋白只有形成穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)才能執(zhí)行一定的功能。因此，筆者首先利用Jpred 4在線軟件對其二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。結(jié)果表明，AfERF109二級結(jié)構(gòu)中有4個β-折疊和2個 α- 螺旋，其中，在保守的AP2結(jié)構(gòu)域中含有3個β-折疊和1個α-螺旋（圖4-A）。筆者進(jìn)一步對AfERF109的60個氨基酸殘基組成的AP2結(jié)構(gòu)域進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)構(gòu)建。從圖4-B中可以看出，該三維結(jié)構(gòu)圖中含有3個反向平行的β-折疊，而在N端則具有1個典型的α-螺旋。該結(jié)構(gòu)與包括擬南芥的ERF1在內(nèi)的很多ERF蛋白的AP2結(jié)構(gòu)域構(gòu)象類似，表明預(yù)測的三維結(jié)構(gòu)合理。

2.5 AfERF109在蜻蜓鳳梨中的組織表達(dá)特性

為了研究AfERF109在蜻蜓鳳梨各組織中的表達(dá)特性，筆者分別選取了幼株、成株和抽薹39 d后成株的外葉、心葉、莖和根，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)對其進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，AfERF109在檢測的營養(yǎng)器官和生殖器官中均有表達(dá)，尤其是在抽薹39 d后成株的外葉、心葉和莖中的表達(dá)量相比幼株組織明顯上升（圖5）。

2.6 AfERF109的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)響應(yīng)了外源乙烯處理

已知ERF家族很多成員均可以響應(yīng)外源乙烯處理，影響靶標(biāo)下游基因的表達(dá)[27，29]。為了驗(yàn)證AfERF109對外源乙烯處理的響應(yīng)情況，筆者分別對乙烯處理不同時間后蜻蜓鳳梨幼株和成株的外葉、心葉、莖和根中AfERF109轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)情況進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，無論是在幼株還是在成株中，AfERF109轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量均響應(yīng)了外源乙烯處理（圖6）。幼株中，乙烯處理1 h后，外葉、莖和根中AfERF109的表達(dá)量明顯上升，到6 h則迅速下降到處理前的水平；在心葉中，AfERF109的表達(dá)量在乙烯處理6 h后上調(diào)（圖6-A）。成株中，乙烯處理1 h后，AfERF109在外葉、心葉和根中的表達(dá)量明顯上調(diào)，隨著處理時間的延長，表達(dá)量逐漸下降；在莖中，AfERF109的表達(dá)量則呈現(xiàn)下降—上升—下降的趨勢（圖6-B）。這些結(jié)果暗示在幼株和成熟株的不同組織中，AfERF109對外源乙烯響應(yīng)的方式不盡相同。

2 結(jié)論與討論

AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子是一類大家族，在水稻、擬南芥、大豆中分別有157、147、148個[31-32]。作為AP2/EREBP中的1個亞族，ERF中的很多成員參與了成花誘導(dǎo)和花器官發(fā)育的調(diào)控。在擬南芥中，過表達(dá)ERF96導(dǎo)致蓮座葉變小，開花延遲[33]。AP2/EREBP家族的1個同源基因EARLY BUD-BREAK（EBB）在楊樹（Populus）、葡萄（Vitis）、云杉（Picea asperata）、日本梨（Pyrus pyrifolia Nakai）等多年生木本植物中均正調(diào)控了花芽的形成[34-36]。此外，在矮牽牛（Petunia hybrida）中，PhERFs基因還參與了花器官尤其是花瓣和雌蕊的衰老調(diào)控[37]。本研究中，蜻蜓鳳梨從營養(yǎng)生長到生殖生長的過程中，AfERF109轉(zhuǎn)錄本在外葉、心葉和莖中的表達(dá)量顯著上升（圖5-A），直至成花39 d后的植株中依然持續(xù)高水平表達(dá)，暗示AfERF109可能參與了蜻蜓鳳梨從營養(yǎng)生長到生殖生長時期的轉(zhuǎn)換。鳳梨科植物花芽分化部位位于心葉圍繞的莖尖。從圖5-A中也可以看出，在每個檢測時期，AfERF109的轉(zhuǎn)錄本在莖尖的表達(dá)量均是最高的，尤其是在開花39 d后的莖中表達(dá)量相較于幼株莖中的表達(dá)量上升了92倍，表明AfERF109很可能參與了蜻蜓鳳梨的成花誘導(dǎo)和花器官發(fā)育過程。另外，在成花39 d后的植株中，蜻蜓鳳梨在花柄中的表達(dá)量在所有檢測的同時期營養(yǎng)器官和生殖器官中的表達(dá)量最高，甚至超過了莖中的表達(dá)量（圖5-B），進(jìn)一步證明了AfERF109在花柄發(fā)育中可能具有重要作用。AfERF109在其他生殖器官中的表達(dá)量則相對較低，尤其是在萼片和雄蕊中幾乎檢測不到，表明其可能并不參與這些器官的發(fā)育和分化（圖5-B）。

外源施加乙烯或乙烯衍生物（如乙烯利）可以促進(jìn)鳳梨科植物開花。擬南芥中，響應(yīng)乙烯信號的ERF基因是ERF1，ERF1再通過結(jié)合到下游靶標(biāo)基因啟動子區(qū)的順式元件上，通過一系列級聯(lián)反應(yīng)啟動了植物體對外源生物或非生物脅迫的應(yīng)答機(jī)制[15]。蜻蜓鳳梨幼株和成株各組織中AfERF109轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量對外源乙烯處理均有響應(yīng)，但是響應(yīng)的時間和幅度各有差異，表明在不同的組織中可能有其他的蛋白共同參與了這一調(diào)控路徑。未來通過克隆該基因的啟動子序列，分析其啟動子區(qū)包含的順式元件，驗(yàn)證其對脅迫處理的響應(yīng)，將有助于我們解析其具體的應(yīng)答機(jī)制。

此外，水稻中與擬南芥AfERF109同源的基因OsERF109也響應(yīng)了乙烯的正調(diào)控[38]。研究發(fā)現(xiàn)，OsERF109可通過結(jié)合到另一個ERF基因OsERF3啟動子區(qū)的DRE和GCC元件上調(diào)控后者的表達(dá)[39]，而在水稻中過表達(dá)或通過RNA干擾降低OsERF109表達(dá)量后則分別降低或增加了乙烯的合成量，參與了干旱脅迫[38]。因此，通過在蜻蜓鳳梨中過表達(dá)或沉默AfERF109，進(jìn)一步研究它在開花中的分子機(jī)制以及與乙烯之間的調(diào)控關(guān)系，有助于我們更好地解析乙烯誘導(dǎo)鳳梨科植物開花的分子機(jī)制，為人工調(diào)控鳳梨科植物開花提供理論依據(jù)。

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