于曉岳+楊華+鄒芳剛

摘要：SSR標(biāo)記法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到水稻品種真實(shí)性的鑒定中，此方法具有快速、穩(wěn)定等特點(diǎn)。本研究對比了不同退火溫度、DNA聚合酶以及PCR擴(kuò)增儀等因素對水稻品種真實(shí)性SSR分子檢測方法的影響，旨在探討如何根據(jù)實(shí)驗(yàn)室自身情況選擇適合的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件來順利地開展檢測工作。結(jié)果表明，55 ℃退火溫度的PCR產(chǎn)物較有利于水稻品種真實(shí)性SSR標(biāo)記的檢測；2種PCR儀性能比較一致，均適合水稻品種真實(shí)性SSR標(biāo)記的檢測；TaKaRa及生工Taq DNA聚合酶均適合水稻品種真實(shí)性SSR標(biāo)記的檢測，天根Taq DNA聚合酶不適合水稻品種真實(shí)性SSR標(biāo)記的檢測。不同實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)選擇以上3個(gè)適合實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行組合，以提高水稻品種真實(shí)性和純度分子檢測的準(zhǔn)確性。

關(guān)鍵詞：水稻；SSR；品種真實(shí)性檢測；退火溫度；PCR擴(kuò)增儀；DNA聚合酶

中圖分類號： S511.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）11-0057-03

SSR稱為簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat），也可以稱為微衛(wèi)星DNA（microsatellite DNA）。SSR是由1～6個(gè)核苷酸為重復(fù)序列組成的串聯(lián)重復(fù)序列，這些簡單重復(fù)序列隨機(jī)、均勻，并且廣泛存在于真核生物的基因組上[1] 。分子標(biāo)記（molecular markers）是以個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接反映。以這種簡單重復(fù)序列為基礎(chǔ)的標(biāo)記技術(shù)被稱為分子標(biāo)記技術(shù)，SSR分子標(biāo)記由Moore等于1991年創(chuàng)立[2]。由于SSR分子標(biāo)記具有非組織和發(fā)育階段特異性、不易受外界環(huán)境影響、多態(tài)性高、在基因組中分布廣泛、呈共顯性遺傳等優(yōu)點(diǎn)，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用在農(nóng)作物品種的真實(shí)性鑒定和純度鑒定中[3-6]。2014年我國農(nóng)業(yè)部修訂了2007年版本的水稻品種鑒定標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)布了行業(yè)推薦標(biāo)準(zhǔn) NY/T 1433—2014 《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程：SSR標(biāo)記法》，因分子標(biāo)記檢測具有快速、穩(wěn)定等特點(diǎn)，該技術(shù)規(guī)程在全國廣泛應(yīng)用；但是分子檢測結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性，與實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)操作人員的實(shí)驗(yàn)技能有一定的關(guān)系，為提高江蘇水稻品種真實(shí)性和純度鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究對江蘇省種子管理站種子質(zhì)量檢驗(yàn)室現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了組合比較，擬篩選較適合江蘇水稻品種真實(shí)性和純度鑒定的實(shí)驗(yàn)條件，在江蘇范圍內(nèi)推廣應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

以水稻品種淮稻5號和連粳7號為試驗(yàn)材料。

1.2 引物

選取NY/T 1433—2014《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程：SSR標(biāo)記法》（2014年6月1日實(shí)施）中12對SSR引物，引物名稱及序列詳見表1，引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 試劑

（1）DNA提?。哼x用OMEGA公司生產(chǎn)的植物基因組DNA提取試劑盒（E.Z.N.A. TM Plant DNA Kit D3485-01）提取2個(gè)品種的DNA。

（2）Taq DNA聚合酶：選用TaKaRa公司、天根生物科技（北京）有限公司及生工生物工程（上海）股份有限公司的Taq DNA聚合酶。

1.4 主要儀器

使用賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific）的NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)，檢測提取的DNA模板的濃度和質(zhì)量；分別用BIO-RAD公司生產(chǎn)的 My cycler和 Agilent Technologies公司生產(chǎn)的Sure Cycler 8800擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增；采用美國Bio-rad伯樂 GelDoc XR System凝膠成像系統(tǒng)對銀染后的聚丙烯酰胺凝膠拍照。

1.5 DNA 模板準(zhǔn)備

用試劑盒提取完DNA后，用超微量分光光度計(jì)檢測2個(gè)品種的DNA模板濃度，將其分別稀釋到相同濃度使用。

1.6 實(shí)驗(yàn)條件設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)采用50 ℃、55 ℃及60 ℃ 3個(gè)退火溫度和3種不同來源的Taq DNA聚合酶在2種PCR擴(kuò)增儀上對2個(gè)品種的DNA模板PCR擴(kuò)增，為便于標(biāo)記圖片和分析結(jié)果，分別對實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行編號（表2），并按照表3的實(shí)驗(yàn)條件組合進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA模板質(zhì)量檢測與稀釋

用DNA提取試劑盒提取的DNA模板，微量分光光度計(jì)檢測后結(jié)果見表4。D280 nm是蛋白和酚類物質(zhì)最高吸收峰的吸收波長，D260 nm是核酸最高吸收峰的吸收波長，D230 nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波長。純DNA的D260 nm/D280 nm比值為1.8，純DNA和 RNA的D260 nm/D230 nm比值為2.5。檢測結(jié)果表明，所提取DNA 模版質(zhì)量較高，蛋白質(zhì)、RNA、多糖和酚類等雜質(zhì)基本去除，能夠滿足進(jìn)行SSR分子標(biāo)記分析的質(zhì)量要求（表4）。根據(jù)每個(gè)樣品的原始DNA濃度，稀釋至50 ng/μL 備用。

2.2 退火溫度對品種真實(shí)性SSR標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量的影響

18個(gè)實(shí)驗(yàn)條件組合中有6組組合可比較3種不同溫度下品種真實(shí)性SSR標(biāo)記PCR產(chǎn)物的質(zhì)量。分別為ⅠaA、ⅡaA、ⅢaA，ⅠaB、ⅡaB、ⅢaB，ⅠbA、ⅡbA、ⅢbA，ⅠbB、ⅡbB、ⅢbB，ⅠcA、ⅡcA、ⅢcA，ⅠcB、ⅡcB、ⅢcB。以ⅠaA、ⅡaA、ⅢaA，ⅠaB、ⅡaB、ⅢaB等2組組合電泳圖譜（圖1）為例，對PCR產(chǎn)物電泳譜帶的清晰度比較可知，50 ℃退火溫度非特異性產(chǎn)物較多，電泳譜帶彌散背景較多；55 ℃退火溫度，擴(kuò)增特異性目標(biāo)條帶清晰，電泳譜帶背景干凈，便于后續(xù)的比較分析；60 ℃退火溫度擴(kuò)增特異性目標(biāo)條帶不及55 ℃退火溫度擴(kuò)增特異性目標(biāo)條帶清晰，且其他5組組合中也是如此，因此，以55 ℃退火溫度的PCR產(chǎn)物較有利于水稻品種真實(shí)性SSR標(biāo)記的檢測。

2.2 不同擴(kuò)增儀對品種真實(shí)性SSR標(biāo)記PCR產(chǎn)物質(zhì)量的影響

18個(gè)實(shí)驗(yàn)條件組合中有9組組合可比較2種不同品牌擴(kuò)增儀的PCR產(chǎn)物的質(zhì)量，分別為ⅠaA、ⅠaB，ⅠbA、ⅠbB，ⅠcA、ⅠcB，ⅡaA、ⅡaB，ⅡbA、ⅡbB，ⅡcA、ⅡcB，ⅢaA、ⅢaB，ⅢbA、ⅢbB，ⅢcA、ⅢcB。以其中2組組合ⅢbA、ⅢbB和ⅢcA、ⅢcB電泳圖譜（圖2）為例，結(jié)果表明無論是條帶特性高低與否、背景清晰與否，儀器對結(jié)果的影響并不明顯，其他幾個(gè)組合的結(jié)果亦如此，本實(shí)驗(yàn)表明2種PCR儀性能比較一致，均適合水稻品種真實(shí)性SSR標(biāo)記的檢測。

2.3 不同品牌的Taq DNA聚合酶對品種真實(shí)性SSR標(biāo)記方法檢測結(jié)果的影響

18個(gè)實(shí)驗(yàn)條件組合中有6組組合可比較3種不同品牌的聚合酶擴(kuò)增后的結(jié)果，分別為ⅠaA、ⅠbA、ⅠcA，ⅡaA、ⅡbA、ⅡcA，ⅢaA、ⅢbA、ⅢcA，ⅠaB、ⅠbB、ⅠcB，ⅡaB、ⅡbB、ⅡcB，ⅢaB、ⅢbB、ⅢcB。以ⅠaA、ⅠbA、ⅠcA和ⅠaB、ⅠbB、ⅠcB電泳圖譜（圖3）為例，TaKaRa及生工Taq DNA聚合酶的PCR產(chǎn)物電泳譜帶特異性高，目標(biāo)條帶清楚、雜帶少、背景清晰，便于后期的成像分析；天根Taq DNA聚合酶的PCR產(chǎn)物電泳譜帶特異性尚可、目標(biāo)條帶較清楚，但雜帶多、背景不清晰。其他幾個(gè)組合的結(jié)果亦如此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TaKaRa及生工Taq DNA聚合酶均適合水稻品種真實(shí)性SSR標(biāo)記的檢測，天根Taq DNA聚合酶不適合水稻品種真實(shí)性SSR標(biāo)記的檢測。

3 小結(jié)與討論

在利用分子標(biāo)記法鑒定品種真實(shí)性的方法中，一個(gè)重要環(huán)節(jié)是PCR的擴(kuò)增，只有擴(kuò)增出特異性高、雜質(zhì)少的擴(kuò)增產(chǎn)物，才能在后續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳、染色后得到條帶清晰、背景干凈的指紋圖譜，方便后續(xù)的讀圖、分析和鑒定。而影響PCR反映的條件主要分為2個(gè)方面：一是PCR體系和反應(yīng)環(huán)境。本研究中主要對這2種影響因素中的Taq DNA聚合酶、退火溫度以及不同公司的儀器進(jìn)行了比較分析，結(jié)果表明，55 ℃ 退火溫度的PCR產(chǎn)物較有利于水稻品種真實(shí)性SSR標(biāo)記的檢測；2種PCR儀性能比較一致，均適合水稻品種真實(shí)性SSR標(biāo)記的檢測；TaKaRa及生工Taq DNA聚合酶均適合水稻品種真實(shí)性SSR標(biāo)記的檢測。

綜上所述，如果準(zhǔn)備開展SSR標(biāo)記法對水稻品種真實(shí)性進(jìn)行鑒定，應(yīng)根據(jù)所在實(shí)驗(yàn)室的具體情況對PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)環(huán)境等進(jìn)行相應(yīng)的預(yù)實(shí)驗(yàn)和對比，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的儀器設(shè)備和資金預(yù)算等多個(gè)方面，選擇適合的條件以滿足真實(shí)性室內(nèi)分子檢測工作開展的需要，保證鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。當(dāng)然，SSR標(biāo)記法也有著一些局限性，隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，新技術(shù)、新方法也將運(yùn)用到品種真實(shí)性檢測中，例如毛細(xì)管電泳法、熒光標(biāo)記法、SNP分子標(biāo)記法、芯片技術(shù)乃至二代、三代測序技術(shù)等[7-8]。但無論哪種新型技術(shù)，由于分子方法的結(jié)果有不可預(yù)見性，在檢驗(yàn)室開展和應(yīng)用一項(xiàng)技術(shù)前，都應(yīng)該根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的具體情況開展一系列的摸索和對比試驗(yàn)，只有這樣才能保證實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果的穩(wěn)定性、重演性、準(zhǔn)確性，真正為農(nóng)業(yè)主管部門、執(zhí)法部門提供最快速、最有利的技術(shù)支撐，在種子市場凈化乃至整個(gè)種業(yè)發(fā)展中發(fā)揮巨大的作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]羅 兵，孫海燕，徐港明，等. SSR分子標(biāo)記研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（12）：5210-5212，5246.

[2]Moore S S，Sargeant L L，King T J，et al. The conservation of dinucleotide microsatellites among mammalian genomes allows the use of heterologous PCR primer pairs in closely related species[J]. Genomics，1991，10（3）：654-660.

[3]周 會(huì)，蘇 秀，毛雙林，等. 雜交水稻品種真實(shí)性和純度的SSR分子標(biāo)記鑒定[J]. 種子世界，2014（3）：34-35.

[4]張冰清，陸徐忠，吳新杰，等. 利用SSR標(biāo)記進(jìn)行雜交油菜品種鑒定[J]. 中國油料作物學(xué)報(bào)，2014，36（6）：728-734.

[5]王 飛. SSR分子標(biāo)記在棉種真實(shí)性和純度中的應(yīng)用研究[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2013.

[6]郭奕生，何德銀. SSR分子標(biāo)記在玉米品種真實(shí)性鑒定上的應(yīng)用[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，41（12）：12-15.

[7]許 鯤，李 鋒，吳金鋒，等. SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳法與國家冬油菜區(qū)試指紋鑒定平臺(tái)的構(gòu)建[J]. 中國油料作物學(xué)報(bào)，2014，36（2）：150-159.

[8]李 雪，田紅麗，王鳳格，等. SSR和SNP兩種標(biāo)記技術(shù)在玉米品種真實(shí)性鑒定中的比較分析[J]. 分子植物育種，2014，12（5）：1000-1004.