肖林霞+盧其能+李潤根

摘要：研究了光質(zhì)、光強(qiáng)、外植體來源對虎杖愈傷組織增殖及其白藜蘆醇積累的影響。結(jié)果表明，綠光和黃光有利于虎杖愈傷組織增殖，藍(lán)光最適合于愈傷組織中白藜蘆醇的積累；長期培養(yǎng)條件下，弱光和中強(qiáng)光比強(qiáng)光更利于白藜蘆醇的積累；以莖段作為外植體，虎杖愈傷組織的增殖速度和白藜蘆醇含量都明顯高于葉片和葉柄。

關(guān)鍵詞：虎杖；愈傷組織；白藜蘆醇；光質(zhì)；光強(qiáng)；外植體

中圖分類號： S567.23+9.043 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）11-0060-04

白藜蘆醇（resveratrol）是一種具有多種生物活性的非黃酮類多酚化合物，是植物受到外界刺激而產(chǎn)生的一種植物抗毒素，主要存在于虎杖、葡萄、花生等植物中，且在虎杖根莖中含量最高。白藜蘆醇不僅能提高植物的抗病性，還具有多種有益于人類健康的藥理作用，主要包括抗氧化、抗腫瘤、抗炎抗菌、抗衰老、預(yù)防心血管疾病、雌激素作用、保護(hù)肝臟等[1-2]。因此，白藜蘆醇不僅能用于醫(yī)藥和保健品市場，還能用于化妝品市場，需求量大。目前，白藜蘆醇的主要來源依然是從天然植物中提取，為了防止植物資源被過度采挖，已有較多的利用生物技術(shù)（如組織培養(yǎng)、生物轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)）來生產(chǎn)白藜蘆醇的研究。但光質(zhì)、光強(qiáng)、外植體對虎杖愈傷組織生長及其白藜蘆醇含量的影響還鮮有報道。因此，本試驗研究了LED光質(zhì)、光強(qiáng)、外植體來源對虎杖愈傷組織增殖及其白藜蘆醇含量的影響，旨在獲得適合虎杖愈傷組織白藜蘆醇積累的光照條件和外植體來源，為將來利用組織培養(yǎng)技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)白藜蘆醇提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

虎杖采自江西省吉安市新干縣。

1.2 方法

1.2.1 虎杖愈傷組織的誘導(dǎo)

取虎杖的幼嫩莖段，消毒后接至快繁培養(yǎng)基中，獲得無菌小苗后將其接至生根培養(yǎng)基中，獲得虎杖幼苗。按曹庸等誘導(dǎo)虎杖愈傷組織的方法[3]，略作改動進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。將無菌幼苗的葉片剪成適當(dāng)大小，葉柄和莖段切至適當(dāng)長度，接至愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS+0.3 mg/L KT+1.0 mg/L 2，4-D）中，黑暗條件下培養(yǎng)，溫度為（25±1） ℃。約20 d后即得到愈傷組織，并用該培養(yǎng)基進(jìn)行繼代。

1.2.2 LED光質(zhì)對虎杖愈傷組織增殖及其白藜蘆醇積累的影響

將來源于葉片的5塊大小一致的虎杖愈傷組織接至上述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于綠、藍(lán)、紅、黃、白LED光照及黑暗下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為3 000 lx，溫度為（25±1） ℃，每處理重復(fù)15瓶。在培養(yǎng)6、12、18、24、30 d后，隨機(jī)取不同光質(zhì)及黑暗條件下的愈傷組織3瓶，合并同一處理下的愈傷組織，稱其總質(zhì)量，計算愈傷組織增殖倍數(shù)，提取并測定其白藜蘆醇含量，再根據(jù)愈傷組織質(zhì)量，計算白藜蘆醇總量。本試驗重復(fù)3次。

1.2.3 光照強(qiáng)度對虎杖愈傷組織增殖及其白藜蘆醇積累的影響

將來源于葉片的5塊大小一致的虎杖愈傷組織接至上述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于不同光強(qiáng)的藍(lán)色LED光質(zhì)下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度分別為1000、3 000、5 000 lx，溫度為（25±1） ℃，每處理重復(fù)15瓶。隨后的處理同光質(zhì)組。

1.2.4 外植體來源對虎杖愈傷組織增殖及其白藜蘆醇積累的影響

分別將來源于葉片、葉柄、莖段的5塊大小一致的虎杖愈傷組織接至上述培養(yǎng)基中，置于相同光照強(qiáng)度的藍(lán)色LED光質(zhì)下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為3 000 lx，溫度為（25±1） ℃，每處理重復(fù)15瓶。隨后的處理同光質(zhì)組。

1.2.5 虎杖愈傷組織白藜蘆醇的提取與測定

1.2.5.1 白藜蘆醇的提取

參考劉小麗等超聲提取虎杖中白藜蘆醇的方法[4]，稍作改動。精確稱取2 g虎杖愈傷組織，用研缽搗碎研磨成勻漿后轉(zhuǎn)移到100 mL的錐形瓶中，加入20 mL 85%的乙醇，超聲波50 ℃提取30 min后，減壓抽慮得到澄清的提取液，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50 ℃濃縮至干，加入1 mL甲醇超聲溶解，并用0.45 μm的有機(jī)濾膜過濾即得供試品溶液，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5.2 白藜蘆醇的檢測

白藜蘆醇的含量使用安捷倫1200系列液相色譜系統(tǒng)測定。色譜柱為C18（150 mm×4.6 mm），流動相采用甲醇-重蒸水（35 ∶65）混合溶劑，流速為0.8 mL/min，檢測波長為306 nm，每次進(jìn)樣10 μL，柱溫為30 ℃。

1.2.5.3 白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

精確稱取10 mg白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至100 mL，得到濃度為 100 μg/mL 的對照品溶液，分別吸取該溶液1、2、3、4、5、6、7 mL，并定容至50 mL，即得濃度分別為2、4、6、8、10、12、14 μg/mL 的對照品溶液。依次取10 μL進(jìn)樣后，以測得的白藜蘆醇峰的峰面積（y）為縱坐標(biāo)，以白藜蘆醇濃度（x）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為y=85.377x-83.386，r2=0.999 3。

供試品溶液按與對照品溶液相同的色譜條件進(jìn)樣，獲得白藜蘆醇供試品溶液和對照品溶液的色譜圖（圖1、圖2），根據(jù)峰面積計算供試品溶液中白藜蘆醇的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 LED光質(zhì)對虎杖愈傷組織增殖及其白藜蘆醇積累的影響

2.1.1 LED光質(zhì)對虎杖愈傷組織增殖的影響

LED光質(zhì)對虎杖愈傷組織增殖有明顯影響。各條件下愈傷組織的增殖速率均是先變快后減慢，總體上增殖效果為綠光、黃光>藍(lán)光>紅光、白光>黑暗，綠光略大于黃光，紅光略大于白光（圖3）。由此可見，光照有利于愈傷組織的增殖，且單色光效果強(qiáng)于白光。

2.1.2 LED光質(zhì)對虎杖愈傷組織中白藜蘆醇含量的影響

除在黑暗條件下虎杖愈傷組織中白藜蘆醇的含量一直變化不大外，光照條件下白藜蘆醇的含量均是在培養(yǎng)6 d后最高，之后逐漸下降趨于穩(wěn)定。但藍(lán)光下白藜蘆醇的含量一直明顯高于其他條件，光質(zhì)條件下白藜蘆醇的含量總體上是藍(lán)光>黃光>白光>紅光>綠光>黑暗（圖4）。由此可見，光照有利于白藜蘆醇的積累，其中藍(lán)光有利于虎杖愈傷組織中白藜蘆醇的合成，而綠光不利于白藜蘆醇的合成。

2.1.3 LED光質(zhì)對虎杖愈傷組織中白藜蘆醇總量的影響

不同光質(zhì)條件下愈傷組織中白藜蘆醇的總量都是在培養(yǎng)24 d時達(dá)到最大，且藍(lán)光下白藜蘆醇的總量明顯高于其他光質(zhì)條件，而紅光下白藜蘆醇的總量最低（圖5）。由此可見，藍(lán)光利于虎杖愈傷組織中白藜蘆醇的積累， 而紅光不利于虎杖愈傷組織中白藜蘆醇的積累。

2.2 光照強(qiáng)度對虎杖愈傷組織增殖及其白藜蘆醇積累的影響

2.2.1 光照強(qiáng)度對虎杖愈傷組織增殖的影響

光照強(qiáng)度對虎杖愈傷組織增殖有影響，不同光照強(qiáng)度對虎杖愈傷組織增殖的效果依次為弱>中>強(qiáng)（圖6）。由此可見，弱光有利于虎杖愈傷組織的增殖，強(qiáng)光不利于虎杖愈傷組織的增殖。

2.2.2 光照強(qiáng)度對虎杖愈傷組織中白藜蘆醇含量的影響

光照強(qiáng)度對虎杖愈傷組織中白藜蘆醇含量有影響，培養(yǎng)12 d以前強(qiáng)光下愈傷組織中白藜蘆醇的含量最高，而18 d以后中等強(qiáng)度條件下的白藜蘆醇含量最高（圖7）。由此可見，強(qiáng)光適合于短期處理，而中強(qiáng)光適合于長期培養(yǎng)用。

2.2.3 光照強(qiáng)度對虎杖愈傷組織中白藜蘆醇總量的影響

弱光和中強(qiáng)光下白藜蘆醇的總量差別不大，在培養(yǎng)的前12 d強(qiáng)光下白藜蘆醇的總量略高，而18 d以后則明顯低于弱光和中強(qiáng)光（圖8）。由此可見，弱光和中強(qiáng)光適于長期培養(yǎng)下虎杖愈傷組織中白藜蘆醇的積累。

2.3 外植體來源對虎杖愈傷組織增殖及其白藜蘆醇積累的影響

2.3.1 外植體來源對虎杖愈傷組織增殖的影響

外植體來源對虎杖愈傷組織增殖有影響，由莖段作為外植體誘導(dǎo)的愈傷組織增殖效果最好，而由葉片和葉柄作為外植體誘導(dǎo)的愈傷組織增殖效果相近，葉柄略優(yōu)于葉片（圖9）。由此可見，以莖段作為外植體利于虎杖愈傷組織的增殖。

2.3.2 外植體來源對虎杖愈傷組織中白藜蘆醇含量的影響

外植體來源對虎杖愈傷組織中白藜蘆醇含量有影響，以葉片、莖段、葉柄作為外植體來源的虎杖愈傷組織中白藜蘆醇的含量依次為莖段>葉片>葉柄，且以莖段作外植體誘導(dǎo)的愈傷組織中白藜蘆醇含量明顯高于葉片和葉柄（圖10）。因而，以莖段作為外植體有利于虎杖愈傷組織中白藜蘆醇的合成。

2.3.3 外植體來源對虎杖愈傷組織中白藜蘆醇總量的影響

外植體來源對虎杖愈傷組織中白藜蘆醇總量有影響，以莖段作為外植體的愈傷組織中白藜蘆醇的總量明顯高于葉片和葉柄（圖11）。由此可見，以莖段作為外植體利于虎杖愈傷組織中白藜蘆醇的積累。

3 討論

在組織培養(yǎng)中，光是影響植物愈傷組織生長和內(nèi)部生理生化反應(yīng)進(jìn)程的重要環(huán)境因子[5-6]。光對不同植物愈傷組織生長及其次生代謝產(chǎn)物的積累有不同的效應(yīng)。外植體來源也是影響植物愈傷組織增殖和次生代謝產(chǎn)物積累的一個重要因素。本試驗結(jié)果表明，光質(zhì)和光照強(qiáng)度對虎杖愈傷組織生長及其白藜蘆醇的積累有明顯影響。不同光質(zhì)條件下虎杖愈傷組織的增殖效果為綠光、黃光>藍(lán)光>紅光、白光>黑暗，說明光照有利于虎杖愈傷組織的增殖，黃光和綠光有利于虎杖愈傷組織的生長。但綠光不利于白藜蘆醇的積累，而藍(lán)光下白藜蘆醇的積累量明顯高于其他光質(zhì)，是最適于虎杖愈傷組織白藜蘆醇積累的光質(zhì)條件。弱光有利于虎杖愈傷組織的增殖，強(qiáng)光短期處理能明顯提高白藜蘆醇的含量，但長期培養(yǎng)條件下，弱光和中強(qiáng)光比強(qiáng)光更利于白藜蘆醇的積累。以莖段作為外植體，無論是愈傷組織增殖速度還是白藜蘆醇的積累量都要明顯高于葉片和葉柄。羅麗媛等研究了LED不同光質(zhì)對葡萄愈傷組織及白藜蘆醇合成的影響，發(fā)現(xiàn)綠光最有利于葡萄愈傷組織的生長，但抑制白藜蘆醇的合成；藍(lán)光對愈傷組織生長無明顯影響，但能明顯促進(jìn)白藜蘆醇含量和產(chǎn)量的提高；紅光不利于自藜蘆醇的積累[7]，本試驗研究結(jié)果與其一致。周華等研究了不同波長LED光源對生菜生長和品質(zhì)的影響，也發(fā)現(xiàn)藍(lán)光能提高生菜的維生素C 和粗蛋白質(zhì)含量[8]。趙德修等對水母雪蓮愈傷組織的培養(yǎng)中也發(fā)現(xiàn)藍(lán)光能顯著提高黃酮的合成[9]。文濤等以虎杖莖段、葉片為外植體，研究了不同光照強(qiáng)度對虎杖愈傷組織的影響，也發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)墓庹諒?qiáng)度能促進(jìn)虎杖愈傷組織中白藜蘆醇的合成；且以莖段作為外植體，虎杖愈傷組織的生物量和白藜蘆醇含量也是明顯高于葉片作為外植體[10]。尹明華也發(fā)現(xiàn)藍(lán)光有利于江西鉛山紅芽芋試管苗可溶性總糖含量和可溶性蛋白質(zhì)含量的增加[11]。但也有一些研究者在對不同植物組織培養(yǎng)的試驗中，得出了不同的結(jié)論，如張真等認(rèn)為黃光最有利于葡萄愈傷組織的增殖，而白光最有利于白藜蘆醇的積累[12]；劉浩等發(fā)現(xiàn)LED 紅光下愈傷組織的增殖倍數(shù)和蘿卜硫素含量均為最高[13]；申海進(jìn)等研究了濾光膜處理對花期野菊光合特性和葉綠素?zé)晒獾挠绊?，發(fā)現(xiàn)紅膜下類胡蘿卜素含量最高[14]；吳祝華等發(fā)現(xiàn)紅光下非洲菊產(chǎn)花狀況最好[15]。導(dǎo)致研究結(jié)果不一致的原因可能有：不同的植物生長、發(fā)育受光的調(diào)節(jié)作用不同；培養(yǎng)基的成分和光照的波長及輻照等不同也會影響光照對植物組織培養(yǎng)物生長和發(fā)育的效應(yīng)[16]。由此可見，光形態(tài)建成的復(fù)雜性，需要進(jìn)行更深入的研究。

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