不同濃度Cd2+對(duì)草魚組織器官及抗氧化酶SOD活性的影響

任洪濤+林霖

摘要：以草魚為試驗(yàn)對(duì)象，采用靜水測(cè)試法，研究養(yǎng)殖水體中不同濃度Cd2+對(duì)草魚組織器官及肝臟中超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響，試圖探討重金屬的毒性積累和毒性機(jī)制。采用不同濃度（1.98、2.96、4.44、6.67、10.00 mg/L）的Cd2+溶液浸浴法處理草魚魚種，檢測(cè)組織抗氧化酶SOD的活性變化及對(duì)組織器官的影響。結(jié)果表明，鎘對(duì)草魚種24、48、96 h的半致死濃度分別為1.959、1.830、1.245、1.011 mg/L；安全濃度為0.479 0、0.101 1 mg/L。Cd2+對(duì)草魚的毒性效應(yīng)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。Cd2+對(duì)草魚魚種肝臟的SOD活性有明顯的影響（P<0.5）。與對(duì)照組相比，經(jīng)高濃度和低濃度處理后24、96 h顯著下降（P<0.5）；每組24、96 h的SOD活性無(wú)顯著差異。得出結(jié)論，Cd2+對(duì)草魚SOD活性的影響隨時(shí)間延長(zhǎng)而呈下降的趨勢(shì)?？寡趸窼OD、組織器官的變化這2項(xiàng)指標(biāo)都能夠敏感地指示Cd2+的毒性水平，是較理想的生態(tài)毒理學(xué)指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：草魚；Cd2+；半致死濃度；安全濃度；組織器官；抗氧化物歧化酶（SOD）

中圖分類號(hào)： S943.112.91 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）11-0261-03

鎘是一種灰色而有光澤的重金屬，微量且廣泛地存在于環(huán)境中[1]。金屬鎘毒性很低，但其化合物毒性很大。鎘在體內(nèi)積蓄，潛伏期可達(dá)10～30年之久，為已知最易在體內(nèi)積聚的毒物之一[2]。隨著工業(yè)生產(chǎn)業(yè)的發(fā)展、海上石油和運(yùn)輸業(yè)的發(fā)展以及廢水的排出，鎘污染在水中的污染越來越嚴(yán)重，已轉(zhuǎn)變?yōu)闈撛谛缘纳鐣?huì)危害。由于現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，大量的重金屬污染物通過多種途徑釋放并進(jìn)入水體，水質(zhì)污染日益嚴(yán)重。一些重金屬離子濃度超標(biāo)對(duì)魚類有毒害作用，常常會(huì)擾亂魚類的生命活動(dòng)，引起魚類的中毒和死亡，且已證實(shí)水中的重金屬污染物可通過食物鏈傳遞進(jìn)入人體并對(duì)人體造成嚴(yán)重的危害。

國(guó)內(nèi)外水產(chǎn)科研者對(duì)重金屬鎘對(duì)魚類的研究取得了一些成果。然而，由于重金屬在水生生態(tài)系統(tǒng)中呈現(xiàn)較為復(fù)雜的形態(tài)、相對(duì)較高的活性、對(duì)魚類較強(qiáng)的毒性和魚類承受重金屬毒害的機(jī)理復(fù)雜性，并且有關(guān)重金屬在水生生態(tài)系統(tǒng)中的形態(tài)、分布、轉(zhuǎn)化和對(duì)魚類的毒害機(jī)理尚未弄清楚，因此為進(jìn)一步推動(dòng)重金屬污染對(duì)魚類毒性的研究與防治，有必要對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

本研究通過養(yǎng)殖水體中不同濃度Cd2+對(duì)草魚腦和肝臟組織及抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響試驗(yàn)，為重金屬的毒性積累和毒性機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

采用草魚魚種為試驗(yàn)對(duì)象，采自河南省洛陽(yáng)市郊魚苗場(chǎng)。試驗(yàn)魚健壯，體長(zhǎng)范圍為（10.0±2.0） cm，體質(zhì)量范圍為（10.0±3.0） g。魚種自養(yǎng)殖場(chǎng)運(yùn)回來后馴養(yǎng)1周后再進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

試驗(yàn)用水為自來水，水溫17～18 ℃，pH值為7.9，溶解空氣13.6272 cm3/L，溶解氧4.6089 cm3/L，水硬度33.14。試驗(yàn)在40 cm×25 cm×25 cm水族箱中進(jìn)行。水族箱中加入15 L/箱毒液，將配制好的毒液于空氣中暴露48 h，后放入受試魚10尾。

1.2.1 急性毒性試驗(yàn) 采用靜水法生物測(cè)試[3]。試驗(yàn)周期為96 h，為防止糞便對(duì)水質(zhì)造成污染，試驗(yàn)期間不進(jìn)行喂食。每天24 h連續(xù)充氣。每組10尾魚，共6組；按等比級(jí)數(shù)設(shè)5個(gè)濃度梯度，并設(shè)1個(gè)對(duì)照組，同時(shí)設(shè)有3個(gè)重復(fù)組，共160尾魚。用尼龍小孔抄網(wǎng)從預(yù)先篩選出來的試驗(yàn)對(duì)象中隨機(jī)選取10尾魚放入每個(gè)試驗(yàn)容器中，所有魚在20 min內(nèi)轉(zhuǎn)移完畢。觀察記錄，隨時(shí)撈出死亡個(gè)體，并記錄各組魚苗的24、48、72、96 h的死亡數(shù)。死亡的標(biāo)準(zhǔn)是魚腹部向上，鰓蓋停止運(yùn)動(dòng)。采用直線內(nèi)插法，以濃度的常用對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，死亡率的概率單位為縱坐標(biāo)，求出各自的半數(shù)致死濃度（LC50），并根據(jù)公式SCⅠ=（48h LC50×0.3）/（24 h LC50/48 h LC50）2和SCⅡ=96 h LC50×0.1求安全濃度（SC）。

1.2.2 樣品采集 及時(shí)撈出各濃度下死亡的草魚以及對(duì)照組的草魚，取出肝臟和腦組織，將一部分組織放入10%甲醛溶液中固定，用來制作組織切片；另一部分肝臟裝入1.5 mL EP管中并做好標(biāo)記，置于-20 ℃冰箱中保存，最后采用試劑盒（南京建成生物工程研究所生產(chǎn)）的方法測(cè)定肝臟組織中超氧化物歧化酶（SOD）的活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)測(cè)得的所有數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行整理；運(yùn)用SPSS軟件中的one-way ANOVA檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd2+對(duì)草魚的急性毒性試驗(yàn)

草魚中毒后的癥狀為魚失去平衡、左右擺動(dòng)、失去游動(dòng)能力。死后魚體的體表黏膜部分缺失，并出現(xiàn)大量的絮狀黏膜。由表1、表2可知，Cd2+對(duì)草魚魚種在24、48、96 h的半致死濃度分別為1.959、1.830、1.245、1.011 mg/L。

2.2 Cd2+對(duì)草魚的組織學(xué)影響

重金屬對(duì)肝臟細(xì)胞有較大的毒性。肝臟是重金屬中毒的主要靶器官，染毒后出現(xiàn)嚴(yán)重的細(xì)胞壞死現(xiàn)象。空白組肝臟細(xì)胞完整，可以清晰地分辨細(xì)胞輪廓。染毒組織肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)多變?yōu)椴煌暾?，殘留的核物質(zhì)散亂分布，肝細(xì)胞凝固性壞死，正常的壁狀結(jié)構(gòu)消失。

由圖1可知，與對(duì)照組A相比，A-1肝臟細(xì)胞膜的界限已經(jīng)不是很清晰，細(xì)胞核顏色加深；A-2與A-1相比，細(xì)胞膜幾乎消失，界限很不明顯且細(xì)胞核顏色進(jìn)一步加深。A-3與對(duì)照組相比，細(xì)胞間間隙大，脫水嚴(yán)重，核物質(zhì)散亂分布；A-4與A-3對(duì)比，已經(jīng)分辨不出清晰地輪廓，界限消失，細(xì)胞核顏色加深。

由圖2可知，與對(duì)照組B相比，B-1的變化不是特別明顯，只是細(xì)胞的輪廓變得模糊；B-2與B-1相比，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，核物質(zhì)散亂分布。B-3與對(duì)照組相比，細(xì)胞界限不明顯，輪廓模糊；B-4與B-3相比，細(xì)胞核顏色加深，核物質(zhì)散亂排布，腦細(xì)胞結(jié)構(gòu)已不完整。

2.3 Cd2+對(duì)超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

由圖3可以看出，草魚在低濃度溶液（1.98 mg/L）處理下肝臟組織中SOD的活性要比在高濃度溶液（6.67 mg/L）的要高（P<0.05）。且與對(duì)照組相比，經(jīng)高濃度和低濃度處理后的24、96 h分別呈明顯的下降趨勢(shì)（P<0.05）；每組的24、96 h的SOD活性無(wú)顯著差異。由此得出，Cd2+對(duì)草魚的SOD活性的影響隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈下降趨勢(shì)。

3 討論

3.1 Cd2+急性毒性

本研究結(jié)果表明，草魚在不同質(zhì)量濃度、不同暴露時(shí)間的死亡率和死亡概率是不同的，Cd2+濃度與草魚的死亡率之間呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，隨著Cd2+ 濃度升高，草魚的死亡率也升高。且隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng)，草魚對(duì)Cd2+的敏感性逐漸增強(qiáng)，即24 h LC50 > 48 h LC50> 72 h LC50> 96 h LC50。鎘對(duì)生物的有害影響首先是使一定的活性傳遞機(jī)制受阻，腎臟受損傷，酶受危害以及內(nèi)分泌系統(tǒng)受影響，使生物機(jī)能失調(diào)[4]。在本試驗(yàn)中，進(jìn)行亞急性試驗(yàn)后，草魚的增質(zhì)量率、特定生長(zhǎng)率和成活率隨著鎘濃度的升高而逐漸降低，也就是說，水體中鎘含量越多，草魚的生長(zhǎng)性能越差。原因可能與體內(nèi)的金屬硫蛋白（MT）有關(guān)，因?yàn)轸~類體內(nèi)富含半胱氨酸，易于和重金屬結(jié)合[5]，當(dāng)魚體內(nèi)積累的鎘達(dá)到一定程度之后，體內(nèi)合成的金屬硫蛋白不能滿足與進(jìn)入細(xì)胞的鎘結(jié)合的需要，多余的鎘就會(huì)與體內(nèi)的其他生物分子結(jié)合[6]，造成鎘中毒。由此看出，當(dāng)水體中的鎘濃度超過一定限度時(shí)，水體中的鎘濃度越高，對(duì)魚類的生長(zhǎng)越不利，為了養(yǎng)殖魚的正常生長(zhǎng)，水體中的鎘濃度要控制在安全濃度以內(nèi)，根據(jù)本研究結(jié)果，養(yǎng)殖草魚的水體中鎘濃度應(yīng)在安全濃度0.479 mg/L以下，才能保證草魚的健康生長(zhǎng)。

3.2 Cd2+對(duì)草魚組織的影響

重金屬會(huì)引起魚類的肝臟、鰓、脾臟等組織病理變化，包括肝臟壞死、鰓上皮增生、融合、毛細(xì)血管擴(kuò)張、水腫等[7-8]。重金屬中毒后，肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯的脂滴，肝細(xì)胞團(tuán)狀或生長(zhǎng)過度，肝竇質(zhì)變性，肝糖原缺乏，竇狀隙和血管阻塞，膽管上皮變性或壞死。重金屬對(duì)腸的損傷則表現(xiàn)為充血、絨毛變性、黏液性杯狀細(xì)胞增多、黏液下層液泡狀或壞死、微管結(jié)構(gòu)變性或壞死等。重金屬對(duì)腎上腺、甲狀腺、胃、心臟、腦、脊髓、皮膚、側(cè)線器官、嗅覺器官、眼等產(chǎn)生傷害。重金屬還可以誘導(dǎo)魚類組織器官（如肝臟、脾、腸等）細(xì)胞凋亡[9]。

3.3 Cd2+對(duì)草魚SOD活性的影響

本試驗(yàn)結(jié)果表明，低濃度Cd2+短時(shí)問內(nèi)處理草魚，可使草魚SOD活力上升，高濃度長(zhǎng)時(shí)間處理草魚，可使草魚SOD活力下降，這與國(guó)內(nèi)外的許多研究結(jié)果[10]一致。李大輝等研究發(fā)現(xiàn)Cd2+處理引起SOD、過氧化氫酶（POD）活性變化，反映了重金屬脅迫使活性氧自由基增多，膜脂過氧化加劇；在低濃度Cd2+處理時(shí)，植物體內(nèi)SOD、POD受到活性氧自由基的誘導(dǎo)，活性上升，參與清除自由基；在長(zhǎng)時(shí)間高濃度作用后，酶系統(tǒng)就會(huì)被重金屬離子破壞而使SOD和POD活性下降，植株對(duì)自由基和過氧化物的防御能力減弱[11]。楊居榮等認(rèn)為當(dāng)SOD活性下降時(shí)，多烯不飽和脂肪酸就可能過多地被過氧化，致使一部分類囊體膜被破壞；重金屬脅迫作用使SOD、POD活性下降，植物對(duì)自由基和過氧化物的防御能力降低，從而受到毒害，這也是重金屬的毒性機(jī)制[12]。在哺乳動(dòng)物方面的研究也表明，Cd2+可抑制SOD的活性。覃信國(guó)等研究發(fā)現(xiàn)，染Cd2+的大鼠可造成組織SOD活力下降和過氧化脂質(zhì)代謝產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量增加[13]。常青等同樣也發(fā)現(xiàn)，染Cd2+的大鼠心肌SOD活性下降，導(dǎo)致了氧自由基在體內(nèi)的積累，從而損傷了生物膜，引起了過氧化脂質(zhì)（LPO）水平的升高[10]。

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