方斑東風螺腫吻病致病菌分離及中草藥對其的預防效果

梁健+高山+李永仁

摘要：以患腫吻病的方斑東風螺為研究對象，進行致病菌的分離、純化、DNA測序、人工感染等基礎試驗，在此基礎上，應用1種中草藥混合劑對健康東風螺進行腫吻病預防研究。結果表明，方斑東風螺腫吻病病原菌為弗尼斯弧菌（Vibrio furnissii），其96 h半致死濃度為2×108～4×108 CFU/mL；病原菌對于頭孢菌素藥物高度敏感；連續(xù)使用 20 mg/L 中草藥對弗氏弧菌具有一定的效果，但效果不顯著。

關鍵詞：方斑東風螺；藥敏試驗；中草藥

中圖分類號： S944.4+9 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2016）11-0267-03

方斑東風螺[Babylonia areolata（Link）]，俗稱花螺，屬腹足綱、新腹足目、蛾螺科。該螺生長速度快、喜高溫，食用價值較大，另外其觀賞價值很高，很適合制作各種水族景觀，混合搭配其他景物可以美化造景。由于人工育苗及養(yǎng)殖技術的突破，海南、廣東、福建等地工廠化觀賞養(yǎng)殖規(guī)模日益擴大，尤其在海南省形成了較大的觀賞養(yǎng)殖規(guī)模，現(xiàn)有觀賞養(yǎng)殖水池面積約30萬m2，產(chǎn)值超過2億元人民幣[1-2]。隨著方斑東風螺養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，養(yǎng)殖密度越來越大，養(yǎng)殖過程中各種病害也逐漸增多，且日趨嚴重。已有聚縮蟲、纖毛蟲、橈足類和單孢子蟲等寄生蟲病報道[3-7]，近年來出現(xiàn)比較嚴重的病害——吻管水腫病，經(jīng)常導致方斑東風螺大規(guī)模死亡[8]，引起學者們深入研究。目前，已報道引發(fā)該病的致病菌有哈維弧菌（Vibrio harveyi）[9-10]、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）[11]、鰻弧菌生物變種Ⅰ（Vibrio anguillarum biovar Ⅰ）[12]等。這些研究主要集中在海南、廣東等南方地區(qū)，對于北方養(yǎng)殖的方斑東風螺患腫吻病尚無研究報道，更無防治方法的研究。本研究以天津地區(qū)養(yǎng)殖場中患腫吻病的方斑東風螺為研究對象，進行了病原菌鑒定及防治方法的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

2014年，天津市海升水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司的方斑東風螺養(yǎng)殖車間暴發(fā)腫吻病，主要表現(xiàn)為吻管水腫、顏色發(fā)紅，吻管伸出后無法收縮回殼內，無法攝食，病螺停留在沙層表面無法下潛，不久后死亡。本試驗選取患病癥狀明顯且基本一致的個體進行致病菌分離試驗，平均殼長為（16.4±0.8） mm。取其他正常的養(yǎng)殖池中健康個體作為受感染個體，在試驗室內暫養(yǎng)3 d，暫養(yǎng)期間無死亡，養(yǎng)殖海水經(jīng)沙濾并用二氧化氯（1 mg/L）消毒，鹽度2.4%～2.6%，溫度25～28 ℃。

1.2 致病菌的分離

取病螺外套膜、鰓和內臟團，冰水中進行勻漿，用滅菌海水稀釋一定倍數(shù)后涂于Zobell 2216E培養(yǎng)基、胰胨大豆胨肉湯培養(yǎng)基（TSA）、海洋弧菌選擇性培養(yǎng)基（TCBS）上。28 ℃培養(yǎng)24 h，選取菌落形態(tài)特征較一致的優(yōu)勢菌群劃線純化，直到培養(yǎng)基上出現(xiàn)單菌落后，接種于斜面培養(yǎng)基待用。

1.3 人工感染試驗

分離出A、B 2株細菌，進行人工感染試驗。設置A、B菌液濃度為3×108、3×107、3×106 CFU/mL，采用肌肉注射方式，注射到健康螺腹足基部，注射量為50 μL/個，建立A、B 2個試驗組，每個試驗組注射10個螺，每組設3個平行，并設對照組（注射生理鹽水）。注射后不投餌養(yǎng)殖，觀察96 h內累計死亡量并做記錄。

1.4 致病菌的基因測序和分析

對A、B這2個菌株16S rDNA進行測序，測序結果在NCBI上進行Blast比對分析。

1.5 藥敏試驗

采用紙片擴散法（K-B法）進行藥物敏感性試驗，每種藥物設置2個重復，根據(jù)NCCL標準相關步驟和規(guī)定[13]進行試驗。

1.6 不同濃度中草藥混合制劑對東風螺抗病能力的影響

中草藥混合制劑為當歸、白芍、柴胡、澤瀉、黨參、黃芪等按一定比例混合，研磨制成粉末，用開水沏泡，將浸泡液投入20 L塑料箱中（箱底鋪沙，放健康螺50個/箱），設置成中草藥濃度為5、10、15、20 mg/L的4個試驗組，每組設3個重復，并設對照組。每3 d施藥1次，施藥24 h后換水，連續(xù)飼養(yǎng)30 d，期間正常投喂餌料。30 d后每組取10個個體，根據(jù)人工感染試驗確定的A、B這2個菌株的半致死濃度進行致病菌感染試驗，注射劑量為50 μL/個，記錄各試驗組96 h后死亡個數(shù)。

2 結果與分析

2.1 患病個體臨床表現(xiàn)

患病的方斑東風螺首先表現(xiàn)出活動緩慢，攝食量減少或停止攝食，螺停留在沙層表面而無法潛入沙中，吻管伸出體外，顏色發(fā)紅、腫脹，無法收縮回殼內，嚴重時腹足也出現(xiàn)腫脹并無法縮回殼中，吻管內會有白色液體出現(xiàn)，對外界刺激沒有反應（圖1）。不久后死亡腐爛、氣味惡臭、破壞水質，并且傳染速度較快，若不進行治療和預防，很快全池都會發(fā)病。本病且有發(fā)病時間短、傳染力強、致死率高等特點，嚴重危害方斑東風螺的養(yǎng)殖發(fā)展。

2.2 致病菌的分離純化

病螺組織勻漿液于Zobell 2216E培養(yǎng)基中分離得到2株優(yōu)勢細菌，分別命名為A、B菌株，優(yōu)勢強度A>B。在TSB培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)24 h后，菌落淡黃色、圓形，邊緣規(guī)則且整齊，表面光滑、濕潤并微微凸起，整個菌落不透明，直徑 1.2～2.5 mm。在TCBS培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)24 h后，菌落呈現(xiàn)黃色、圓形，邊緣規(guī)則整齊，表面光滑、濕潤、中央微微凸起，菌落不透明，直徑2.0～3.2 mm。

2.3 致病菌的基因測序和分析結果

經(jīng)NCBI上進行Blast比對，A、B菌株均與弗尼斯弧菌NCTC 11218菌株（GenBank序列號為CP 002377.1）的同源性為99%。

2.4 人工感染試驗

由人工感染試驗結果（圖1）可見，A、B菌株注射濃度為3×108 CFU/mL時，累計死亡率分別為40%、50%，并隨著菌液濃度的降低，死亡率也降低，注射生理鹽水對照組的累計死亡率為0。通過SPSS 17.0線性回歸方程分析得出A菌株的96 h半致死濃度為3.93×108 CFU/mL，B菌株為 2.19×108 CFU/mL（表1）。

對感染后死亡的病螺進行致病菌的再分離，得到單一的優(yōu)勢菌，菌落形態(tài)與之前分離的一致，菌株重新鑒定，結果與受試菌株為同一菌株。

2.5 藥敏試驗結果

由表2可知，病螺提取的A、B病原菌對于頭孢菌素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、氯霉素、新霉素、呋喃唑酮等藥物敏感，特別是頭孢菌素對其具有較高的抑制作用。而對氨芐西林、林可霉素、萘啶酸、磺胺嘧啶等藥物具有耐藥性。

2.6 中草藥對東風螺抗病能力的影響

由表3可知，人工感染A菌株的試驗中，施用中草藥 20 mg/L 的試驗組96 h后死亡率為36.67%，較其他濃度組略微偏低，但各組之間并無明顯差異。

3 討論

3.1 方斑東風螺腫吻病的病原

對東風螺腫吻病病原的研究已有報道，黃郁蔥等研究發(fā)現(xiàn)湛江南山島某東風螺養(yǎng)殖場出現(xiàn)的腫吻病致病菌為哈維氏弧菌[10]；王江勇等從海南省萬寧市山根鎮(zhèn)某工廠化東風螺養(yǎng)殖場暴發(fā)的腫吻病病螺體內，分離出的致病菌也為哈維氏弧菌[9]；本試驗所分離出的致病菌為弗氏弧菌，與哈維氏弧菌同為弧菌類細菌。這可能是由南北方地理位置和環(huán)境氣候差異導致的。地理隔離和環(huán)境差異會導致致病菌的種類發(fā)生一定變化，即使同一地區(qū)致病菌也會出現(xiàn)不同，例如張新中等從海南某養(yǎng)殖場患腫吻病的螺體中分離的致病菌鑒定為鰻弧菌生物變種（V. anguillarum biovar Ⅰ）[12]。

3.2 東風螺腫吻病的治療措施

弧菌類細菌是海水養(yǎng)殖的主要病原菌[14]，可感染雜色鮑（Haliotis diversicolor）[15]、斜帶石斑魚（Epinephelus coilides）[16]、凡納濱對蝦（Penaeus vannamei）[4]、大黃魚（Pseudosciaena crocea）[18]等?；【秩舅a(chǎn)動物的主要方式是通過皮膚、消化道等器官的傷口或直接進行感染[19-20]。養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)腫吻病沒有任何前兆，若白天有部分螺體停留在沙層表面不潛入沙中，則2～3 d后沙層表面會有大量螺體出現(xiàn)，且行動緩慢、吻管伸出、對外界刺激不作反應，3～5 d后開始死亡。由此可見，該病可以通過接觸途徑直接傳播，且傳播迅速。本試驗對致病菌的藥敏試驗結果顯示，頭孢菌素對弗氏弧菌具有較強的抑制作用，而其對磺胺類藥物具有一定的耐藥性。這說明弗氏弧菌只對部分抗生素敏感，因此在以后的生產(chǎn)過程中，應選用頭孢菌素這類對弧菌具有良好抑制作用的藥物，防止濫用藥物而導致致病菌出現(xiàn)抗藥性，以及破壞養(yǎng)殖水體中的微生態(tài)環(huán)境。

3.3 東風螺腫吻病的預防措施

以當歸、白芍、柴胡、澤瀉、黨參、黃芪等中草藥按一定比例混合并研磨制成粉末，試驗其對東風螺腫吻病預防效果。與對照組相比，不同施藥濃度對人工感染后的死亡率影響不大，但在20 mg/L施用濃度下，感染A、B這2個菌株的東風螺的累計死亡率均為最低，對弗氏弧菌引起的腫吻病具有一定的效果，但不顯著。通過調整中草藥種類、配伍比例，有望開發(fā)出有效提高方斑東風螺對腫吻病抵抗力的藥物，為東風螺在北方的養(yǎng)殖推廣提供一定幫助。

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