吳文鑄+郭敏+孔德洋

摘要：采用高效液相色譜法，建立了環(huán)境樣品中稻瘟酰胺殘留分析方法。用乙酸乙酯萃取環(huán)境水樣品；土壤樣品用丙酮提取，乙酸乙酯萃?。霍~(yú)體樣品用乙腈直接萃?。挥酶咝б合嗌V法測(cè)定環(huán)境樣品中稻瘟酰胺殘留。結(jié)果表明，該方法在0.5～10.0 mg/L范圍內(nèi)線性良好，土壤、水、魚(yú)體中稻瘟酰胺的最小檢測(cè)濃度分別為0.05、0.01、0.05 mg/kg?？瞻淄寥馈⑺汪~(yú)體樣品中的加標(biāo)回收率為76.5%～101.7%，RSD為0.4%～10.5%。該方法分析速度快、靈敏度高、重現(xiàn)性好，適用于稻瘟酰胺在環(huán)境樣品中的快速檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：稻瘟酰胺；高效液相色譜分析；殘留檢測(cè)；環(huán)境樣品

中圖分類(lèi)號(hào)： X592；TQ450.2+63 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）11-0326-03

稻瘟酰胺（fenoxanil），是由Shell公司研制，經(jīng)巴斯夫和日本農(nóng)藥公司共同開(kāi)發(fā)的酰胺類(lèi)殺菌劑[1-2]，化學(xué)名稱(chēng)為 N-（1-氰基-1，2-二甲基丙基）-2-（2，4-二氯苯氧基）丙酰胺，分子式C15H18Cl2N2O2，相對(duì)分子質(zhì)量為329.22，結(jié)構(gòu)式如下：

原藥為白色粉末，熔點(diǎn)為69.5～71.5 ℃，在pH值=5、7、9時(shí)，對(duì)酸、堿、熱穩(wěn)定，易溶于乙酸乙酯、乙腈和丙酮等有機(jī)溶劑。稻瘟酰胺具有良好的內(nèi)吸性，持效期較長(zhǎng)，具有治療和抑制孢子形成等作用，可單獨(dú)使用也可與保護(hù)性殺菌劑混用，是目前防治稻瘟病的最佳藥劑之一[3-5]。

目前針對(duì)稻瘟酰胺的檢測(cè)方法國(guó)內(nèi)主要集中在氣相色譜法的測(cè)定[6-10]，運(yùn)用液相色譜法[11-12]測(cè)定環(huán)境樣品中稻瘟酰胺的分析方法鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)優(yōu)化樣品前處理方法和液相色譜相關(guān)條件，測(cè)定土壤、水和魚(yú)體等環(huán)境樣品中稻瘟酰胺殘留，為深入評(píng)價(jià)稻瘟酰胺的安全合理使用及環(huán)境監(jiān)測(cè)提供相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：WATERS 2695/2998液相色譜儀，PDA檢測(cè)器（WATERS，美國(guó)）；Excella E24R全溫度振蕩器（New Brunsuick Scientific，美國(guó)）；CR 22GⅡ離心機(jī)（HITACHI，日本）；Rotavapor R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BUCHI，瑞士）；MG-2200 氮吹儀（EYELA，日本）。

試劑與材料：乙酸乙酯、丙酮、乙腈、氯化鈉、無(wú)水硫酸鈉、磷酸等，均為分析純（南京化學(xué)試劑有限公司）；乙腈，色譜/光譜純（MERCK，德國(guó)）。

稻瘟酰胺標(biāo)準(zhǔn)品純度為98.2%，江蘇豐登農(nóng)藥有限公司提供。

1.2 溶液配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.050 9 g稻瘟酰胺標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，得到1 000 mg/L的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液備用。農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)工作溶液由上述標(biāo)準(zhǔn)溶液用乙腈稀釋制得。

1.3 空白樣品采集與保存

空白土壤樣品：選擇未施用稻瘟酰胺的稻田土樣，采集 0～10 cm 深土壤，過(guò)篩后混勻，用四分法分取200 g樣品，貼好標(biāo)簽，-20 ℃低溫中貯存。

空白水樣：選擇未檢測(cè)出稻瘟酰胺的環(huán)境水樣，采集 500 mL 水樣，充分混勻，裝入樣品瓶中，貼好標(biāo)簽，-20 ℃低溫中貯存。

空白魚(yú)體樣品：選擇空白未含有稻瘟酰胺的斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)入樣品袋中，貼好標(biāo)簽，-20 ℃低溫中貯存。

1.4 樣品前處理

土壤樣品提?。合虼郎y(cè)土壤樣品中加入30 mL丙酮，混勻后25 ℃振蕩處理0.5 h，6 000 r/min離心5 min留取上清液。土樣重復(fù)提取1次，合并上清液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)除去丙酮后轉(zhuǎn)入250 mL分液漏斗中，再加入30 mL乙酸乙酯，振蕩提取，靜置分層后，收集上層有機(jī)相；下層溶液再用30 mL乙酸乙酯萃取1次。合并有機(jī)相，旋蒸至近干，N2吹干后用乙腈定容，過(guò)0.45 μm濾膜，待液相色譜測(cè)定。

水樣提?。喝?0 mL水樣，加入適量氯化鈉搖勻，倒入250 mL分液漏斗中，分別用20 mL 乙酸乙酯提取2次，合并乙酸乙酯相，蒸干，用乙腈定容后，過(guò)0.45 μm濾膜，待液相色譜儀測(cè)定。

魚(yú)體提?。喝? g左右魚(yú)樣置于瑪瑙研缽中，加入10 g無(wú)水硫酸鈉，充分研磨后，將樣品轉(zhuǎn)入150 mL三角瓶中，并加入50 mL乙腈，置于恒溫振蕩器以200 r/min 的速率振搖1 h，過(guò)濾后，魚(yú)樣再用乙腈振蕩提取1次，合并提取液。提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用乙腈溶解后，于-20 ℃冰凍10 min去脂，過(guò)0.45 μm濾膜待高效液相色譜測(cè)定。

1.5 HPLC測(cè)定條件

色譜柱250 mm×4.6 mm，5 μm ODS-2 HYPERSIL柱，柱溫30 ℃；流動(dòng)相 ∶V乙腈 ∶V水=80 ∶20，流速1 mL/min；進(jìn)樣量 20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)228 nm。上述條件下，稻瘟酰胺的保留時(shí)間為4.2 min。采用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法優(yōu)化

對(duì)空白稻田土壤做加標(biāo)回收試驗(yàn)（ 稻瘟酰胺加標(biāo)量為1.0 mg/kg），分別考察乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷對(duì)目標(biāo)物的萃取效果。試驗(yàn)表明：乙酸乙酯作萃取劑時(shí)，稻瘟酰胺的加標(biāo)回收率可達(dá)85%，樣品雜質(zhì)峰干擾較小；以正己烷作萃取劑時(shí)，回收率不到70%；二氯甲烷作萃取劑時(shí)，稻瘟酰胺的加標(biāo)回收率可達(dá)85%，但是樣品雜質(zhì)峰干擾較多，且萃取液容易存在乳化現(xiàn)象，對(duì)穩(wěn)定性具有較大影響。故選擇乙酸乙酯為土壤樣品的萃取劑。

對(duì)空白環(huán)境水樣做加標(biāo)回收試驗(yàn)（ 稻瘟酰胺的加標(biāo)量為0.5 mg/L），分別考察乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷對(duì)目標(biāo)物的萃取效果。結(jié)果表明，與土壤加標(biāo)回收結(jié)果類(lèi)似，乙酸乙酯的綜合效果比正己烷和二氯甲烷要好，故選用乙酸乙酯萃取稻田水樣品中的目標(biāo)物。

對(duì)空白魚(yú)體樣品做加標(biāo)回收試驗(yàn)（ 稻瘟酰胺的加標(biāo)量為1.0 mg/kg），分別考察丙酮、乙腈、乙腈 （冷凍去脂） 混合溶液作萃取劑時(shí)的萃取效率。試驗(yàn)表明：用丙酮作萃取劑時(shí)，稻瘟酰胺的加標(biāo)回收率能達(dá)到90%，但雜質(zhì)干擾較多；乙腈作萃取劑（不冷凍）時(shí)，樣品中的脂肪雜質(zhì)較多，干擾較大，影響出峰效果；乙腈作萃取劑時(shí)，且經(jīng)過(guò)冷凍去脂后，回收率均達(dá)到75%，且雜質(zhì)干擾較少。故選用乙腈-冷凍去脂法萃取魚(yú)體樣品。

2.2 色譜方法選擇

色譜柱選擇常規(guī)的250 mm×4.6 mm，5 μm ODS-2 HYPERSIL反相柱。依據(jù)稻瘟酰胺物化性質(zhì)，用乙腈作為溶劑溶解樣品，并選擇乙腈和水作為流動(dòng)相。將流動(dòng)相按不同比例在色譜柱上進(jìn)行試驗(yàn)，最終確定流動(dòng)相為V乙腈 ∶V水=80 ∶20，在流速1.0 mL/min時(shí)，有效成分與雜質(zhì)能很好地分離，峰形對(duì)稱(chēng)，基線平穩(wěn)，能在短時(shí)間得到滿(mǎn)意的分析結(jié)果，提高了工作效率。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用乙腈依次稀釋稻瘟酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L的工作溶液，在“1.5”節(jié)條件下進(jìn)行測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見(jiàn)圖2。

以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，在0.5～10.0 mg/L范圍內(nèi)，不同組分的色譜峰面積（y）與稻瘟酰胺質(zhì)量濃度（x，mg/L）呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系?；貧w方程為y=39 325x+69.905（r2=1.000）。

2.3 方法回收率與最低檢測(cè)濃度

在上述色譜條件下，稻瘟酰胺儀器最小檢出量為1.0×10-11 g，土壤最小檢測(cè)濃度為0.05 mg/kg，水中最小檢測(cè)濃度為0.01 mg/L，魚(yú)體中最小檢測(cè)濃度為0.05 mg/kg。

按上述方法對(duì)空白土壤、水樣和魚(yú)體中進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，土壤回收率結(jié)果見(jiàn)表1，水中回收率結(jié)果見(jiàn)表2，魚(yú)體中回收率結(jié)果見(jiàn)表3。從表1、表2、表3可以看出，當(dāng)土壤中添加水平為1.0～10.0 mg/kg時(shí)，稻瘟酰胺在紅壤、黑土和水稻土中的平均回收率在83.9%～91.7%范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.4%～4.8%，該方法對(duì)不同土壤均具有較高的回收率；當(dāng)水中添加水平為0.5～5.0 mg/L時(shí)，平均回收率在89.4%～91.9%范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.5%～2.8%；當(dāng)魚(yú)體中添加水平為0.10～10.0 mg/kg時(shí)，平均回收率在76.5%～101.7%范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.7%～10.5%。上述結(jié)果表明，該方法具有較好的準(zhǔn)確度和精確度，其準(zhǔn)確度及精確度均滿(mǎn)足農(nóng)藥殘留分析試驗(yàn)的要求[13-14]。

3 結(jié)論

采用液相色譜法同時(shí)測(cè)定環(huán)境樣品土壤、水和魚(yú)體中的稻瘟酰胺殘留量，優(yōu)化后的前處理方法簡(jiǎn)便、高效，且不受樣品中的雜質(zhì)干擾。在所確定的提取、凈化及檢測(cè)條件下得到的結(jié)果表明，土壤中稻瘟酰胺的平均回收率為83.9%～91.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.4%～4.8%；水中稻瘟酰胺的平均回收率為89.4%～91.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.5%～2.8%；魚(yú)體中稻瘟酰胺的平均回收率為76.5%～101.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.7%～10.5%。該方法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確度、靈敏度較高，能夠滿(mǎn)足稻瘟酰胺在環(huán)境中殘留分析的要求。

參考文獻(xiàn)：

[1]Sasson Y. New trends in chemical structure and mechanisms of action of fungicides[J]. Phytoparasitica，2002，30（ 2）：199-217.

[2]李 林，關(guān)愛(ài)瑩，劉長(zhǎng)令.防治稻瘟病的新型內(nèi)吸性殺菌劑氰菌胺[J]. 農(nóng)藥，2003，42（7）：36-38.

[3]Kawasaki S. Rice blast：interaction with rice and control[M]. 3rd. Ed，IRBC：Kluwer Academic Publishers，2004：1-13.

[4]喬 依.防治稻瘟病的新穎內(nèi)吸殺菌劑——氰菌胺[J]. 世界農(nóng)藥，2004，26（2）：46-48.

[5]Singh R，Sunder S，Dodan D S，et al. Sources of resistance to blast and its management through chemicals[J]. Journal of Mycology and Plant Pathology，2011，41（3）：422-425.

[6]彭小悅，龔道新，張 歡，等. 稻瘟酰胺在水稻中的殘留及消解動(dòng)態(tài)[J]. 農(nóng)藥，2010，49（11）：822-824.

[7]秦 麗，吳慧明，劉福光，等. 稻瘟酰胺在水稻植株及稻田水、土壤中的消解動(dòng)態(tài)研究[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010，12 （4）：494-498.

[8]張昌朋，趙 華，吳 珉，等. 稻瘟酰胺在水稻中的殘留分析方法及消解動(dòng)態(tài)研究[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，24（5）：860-864.

[9]譚 紅，郭正元，周驗(yàn)旭，等. 氣相色譜法同時(shí)測(cè)定稻田中稻瘟酰胺和咪酰胺殘留[J]. 環(huán)境監(jiān)測(cè)管理與技術(shù)，2015，27（1）：42-45.

[10]許 磊，龔道新，劉 博，等. 運(yùn)用氣相色譜法同時(shí)測(cè)定稻田稻瘟酰胺和醚菌酯殘留量[J]. 作物研究，2013，27（2）：151-154.

[11]吳琴燕，馬圣洲，張文文，等. 柱前衍生高效液相色譜法檢測(cè)紅茶中γ-氨基丁酸含量[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，30（6）：1534-1536.

[12]嚴(yán) 娟，蔡志翔，馬瑞娟，等. 高效液相色譜搭載可變波長(zhǎng)檢測(cè)器測(cè)定桃果肉中糖組分[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，31（4）：887-892.

[13]農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所.農(nóng)藥殘留量實(shí)用檢測(cè)方法手冊(cè)[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科技出版社，1995：28-31.

[14]中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.NY/T 788—2004 農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則[S]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2004.