陳祖擁+范菲菲+官小云

摘要：通過營養(yǎng)液培養(yǎng)法，研究Cd2+對海菜花種子萌發(fā)及幼苗初期葉綠素含量、抗氧化酶活性及可溶性蛋白質(zhì)含量的影響。結(jié)果表明，各濃度（0.1～2.0 mg/L）Cd2+處理抑制海菜花種子的萌發(fā)，但與對照無顯著差異（P>0.05）；海菜花種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)整體隨Cd2+處理濃度的增大而下降，當Cd2+處理濃度較高時，與對照差異顯著（P<0.05）。Cd2+脅迫明顯降低海菜花葉片中葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量，且與對照差異顯著（P<0.05）。隨著Cd2+濃度增大，超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化物酶（POD）活性、可溶性蛋白質(zhì)含量先升高后降低；過氧化氫酶（CAT）活性呈持續(xù)降低趨勢，且與對照差異顯著（P<0.05）。隨Cd2+脅迫濃度增大，其對海菜花的毒害作用增強。

關鍵詞：鎘脅迫；海菜花；萌發(fā)；葉綠素；抗氧化酶系統(tǒng)；可溶性蛋白質(zhì)；毒害

中圖分類號： X522 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）11-0482-03

在云貴高原分布有我國特有的三級重點保護高原淡水植物海菜花（Ottelia acuminata var. acuminata），其對水質(zhì)要求很高，對水生生態(tài)系統(tǒng)具有重要的生態(tài)指示作用。由于人類活動的增強，工業(yè)“三廢”排放，農(nóng)業(yè)化肥、農(nóng)藥等的大量使用和城市垃圾的肆意堆放，使生態(tài)系統(tǒng)中的重金屬污染日益加劇[1]，導致海菜花數(shù)量急劇減少，而重金屬對海菜花種子發(fā)芽的毒害作用還鮮見報道。本研究選用毒性較強，且在貴州省具有較高土壤背景值[2]的Cd2+為代表，研究重金屬Cd2+對海菜花種子萌發(fā)和幼苗生長初期生理生化的影響，以期初步揭示Cd2+對海菜花的生態(tài)毒理效應。

1 材料與方法

1.1 材料

供試海菜花種子采自貴州省貴陽市花溪區(qū)花溪水庫下游花溪河段，挑選籽粒飽滿、大小均勻的種子用于試驗。CdCl2·2.5H2O 購自國藥集團上?；瘜W試劑公司，各分析純、生化純試劑都用超純水配制。

1.2 試驗設計

用CdCl2·2.5H2O（分析純）和1/10濃度Hoagland營養(yǎng)液，分別配制0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mg/L Cd2+處理液，分別將等體積的該處理液置于鋪有2層濾紙、直徑9 cm的培養(yǎng)皿中，分別挑選飽滿的海菜花種子各20粒平鋪于濾紙上，蓋好玻璃培養(yǎng)皿，置于溫度（25±1） ℃、光照度2 000 lx、14 h/d、濕度80%的人工氣候培養(yǎng)箱中進行萌發(fā)試驗，每個處理3次重復。每天添加適量的超純水補償蒸發(fā)的水分，保持濾紙濕潤但不淹水。以胚根露出種皮時記錄為發(fā)芽種子[3]，培養(yǎng)14 d后測定葉綠素、類胡蘿卜素、可溶性蛋白質(zhì)含量，同時測定超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性。

1.3 分析方法

1.3.1 發(fā)芽指標計算方法 發(fā)芽指標計算方法如下：

發(fā)芽率（GR）=14 d內(nèi)正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%；

發(fā)芽勢（GP）=萌發(fā)前7 d發(fā)芽數(shù)之和/供試種子數(shù)×100%；

發(fā)芽指數(shù)（GI）=∑（Gt/Dt）。

式中：Gt為第t天的發(fā)芽數(shù)；Dt為相應發(fā)芽時間。

活力指數(shù)=GI×S。

式中：S為幼苗平均總長度[4]。

1.3.2 葉綠素、類胡蘿卜素含量測定 取各處理幼苗，用80%丙酮溶液提取，用分光光度計測定提取液在665、649、470 nm處的吸光度[5]。

1.3.3 SOD、POD、CAT活性和可溶性蛋白質(zhì)含量的測定 取各處理幼苗，加入少量0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH值7.8），置冰浴研磨勻漿，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，上清液用于酶活性和可溶性蛋白含量的測定。SOD活性的測定采用NBT光化還原法[5]，POD活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法[5]，CAT活性的測定采用南京建成科技有限公司CAT試劑盒測定，可溶性蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍G-250法[6]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

用SPSS 13.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，顯著性水平設置為0.05水平；用Origin 2015軟件繪制變化趨勢圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘脅迫對海菜花種子發(fā)芽的影響

如表1所示，在試驗濃度范圍內(nèi)，Cd2+脅迫對海菜花種子發(fā)芽率具有一定抑制作用，但與對照無顯著差異（P>0.05）；不同Cd2+脅迫下海菜花種子發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)的變化趨勢類似，整體表現(xiàn)出隨Cd2+處理濃度的增大呈下降趨勢，當Cd2+處理濃度較高時，其發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)與對照差異顯著（P<0.05）。

2.2 鎘脅迫對海菜花幼苗生長的影響

從表2可知，隨著Cd2+濃度增大，海菜花幼苗長度、根長逐漸減小，且與對照差異顯著（P<0.05）；當Cd2+濃度達到2.0 mg/L時，海菜花平均苗長僅為對照的7.4%，根的生長被完全抑制，沒有明顯的根系生成。Cd2+濃度≤0.5 mg/L時，Cd2+對幼苗葉片數(shù)無顯著影響；當Cd2+濃度≥1.0 mg/L時，海菜花幼苗葉片數(shù)隨Cd2+離子濃度增大而顯著減少（P<0.05）。海菜花平均根數(shù)隨Cd2+濃度增大呈減少趨勢，當Cd2+為0.1 mg/L時，海菜花平均根數(shù)與對照無顯著差異；當Cd2+≥0.2 mg/L時，海菜花平均根數(shù)均與對照差異顯著（P<0.05）。由此說明，隨著Cd2+脅迫濃度增大，Cd2+對海菜花幼苗生長的抑制作用增強。

2.3 鎘脅迫對海菜花光合色素含量的影響

葉綠素含量在很大程度上反映了植物的光合作用能力，葉綠素與光合速率、營養(yǎng)狀況關系密切，逆境條件下，葉綠素含量是表征植物受傷害程度的指標之一。類胡蘿卜素是植物細胞中重要的輔助色素，在光合作用過程中能夠激發(fā)活性氧的清除，保護細胞器免受傷害[4]。如表3所示，在Cd2+濃度為0.1～2.0 mg/L時，海菜花幼苗中葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量隨Cd2+處理濃度增大而降低；當Cd2+濃度為 2.0 mg/L 時，葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量分別僅為對照的1.7%、6.6%、2.7%，可見高濃度Cd2+顯著抑制了葉綠素、類胡蘿卜素的合成。

2.4 鎘脅迫對海菜花幼苗中抗氧化酶系統(tǒng)的影響

SOD、POD、CAT等3種抗氧化酶活性與植物抵御外界脅迫能力密切相關。由表4可知，隨著Cd2+濃度增大，海菜花幼苗中SOD活性整體表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，Cd2+脅迫下的海菜花幼苗SOD活性高于對照（P<0.05）。當Cd2+濃度為0.5 mg/L時，SOD活性最大，為對照的8.78倍；當Cd2+濃度為2.0 mg/L時，SOD活性仍為對照的2.46倍。海菜花幼苗中POD活性變化規(guī)律與SOD相似，隨著Cd2+濃度增大，POD活性也呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當Cd2+濃度為 0.5 mg/L 時，POD活性最大，為對照的2.29倍，與對照差異顯著（P<0.05）；隨著Cd2+濃度的繼續(xù)增大，POD活性開始下降，當Cd2+濃度為2.0 mg/L時，其活性與對照無顯著差異。由此可見，SOD的耐受性比POD強。海菜花幼苗中CAT活性的變化規(guī)律與SOD、POD活性不同，隨Cd2+濃度增大而逐漸降低，且均與對照差異顯著（P<0.05）。當Cd2+濃度為2.0 mg/L時，海菜花幼苗的CAT活性被抑制了85.9%，由此可見，CAT對Cd2+脅迫的耐受性較差。

2.5 鎘脅迫對海菜花幼苗中可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

植物體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)主要是參與各種代謝的酶類，其含量是植物的重要生理指標之一。由圖1可見，隨著Cd2+處理濃度增大，海菜花幼苗中可溶性蛋白質(zhì)含量表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，在Cd2+處理濃度為0.5 mg/L時，海菜花幼苗中可溶性蛋白質(zhì)含量最大，且與對照差異顯著（P<0.05）；隨著Cd2+處理濃度的繼續(xù)增大，可溶性蛋白質(zhì)含量開始下降，當Cd2+處理濃度為2.0 mg/L時，可溶性蛋白質(zhì)含量與對照無顯著差異。由此表明，海菜花在受Cd2+脅迫時，體內(nèi)能產(chǎn)生一些抗性蛋白抵御外界脅迫；但處于高濃度Cd2+脅迫時，這種抵御機制受到破壞，可溶性蛋白質(zhì)含量降低。隨著鎘脅迫濃度增大，SOD、POD活性先升高后降低的變化趨勢也證明了可溶性蛋白質(zhì)含量的這種變化規(guī)律。

3 結(jié)論與討論

本研究表明，各濃度Cd2+脅迫對海菜花種子的發(fā)芽率整體表現(xiàn)出抑制作用，這與Cd2+抑制紫羊茅[7]、白三葉[7]、亞麻[8]種子萌發(fā)的報道一致；而與低濃度Cd2+誘導、高濃度Cd2+抑制堿蓬[9]、黑麥草[10]等種子萌發(fā)的報道不同。種子萌發(fā)前期階段主要利用種子自身儲存的營養(yǎng)物質(zhì)，外部污染物質(zhì)須要通過種皮進入其內(nèi)部才能參與萌發(fā)的前期過程?？赡苡捎贑d2+在短期內(nèi)較難通過海菜花種皮，所以對其發(fā)芽率抑制作用不顯著，這說明海菜花種子種皮的自我防御能力較強。海菜花種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)隨著外源Cd2+濃度的增大呈逐漸降低趨勢，在高濃度Cd2+處理時與對照差異顯著，這與Cd2+對紫羊茅[7]、白三葉[7]、黑麥草[10]種子萌發(fā)試驗結(jié)果一致。這說明高濃度Cd2+對海菜花種子萌發(fā)具有抑制作用，可能是高濃度Cd2+能部分通過種皮進入種子內(nèi)部，抑制海菜花種子萌發(fā)。

植物幼苗生長和種子萌發(fā)過程中營養(yǎng)物質(zhì)利用途徑不同，因此幼苗生長過程的Cd2+脅迫與發(fā)芽階段的Cd2+脅迫影響不同。Cd2+脅迫對海菜花幼苗的芽長、根長、葉片數(shù)、根數(shù)均有不同程度的影響，高濃度Cd2+脅迫對海菜花幼苗的芽長、根長、葉片數(shù)、根數(shù)有顯著的抑制作用，這與Cd2+對早熟禾[7]、紫羊茅[7]、白三葉[7]、亞麻[8]、黑麥草[10]影響的相關研究結(jié)果一致。由于重金屬對植物的傷害首先表現(xiàn)在對幼苗根部的傷害[11]，所以Cd2+對根的抑制作用大于對芽的抑制作用。同時，由于胚根受到毒害，導致其對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力降低甚至消失，最終又影響芽的生長。另一方面，Cd2+可能使海菜花幼苗體內(nèi)加速產(chǎn)生大量的活性氧，抑制各種酶活性，從而也影響到海菜花幼苗和根系的生長[12]。

重金屬破壞葉綠體結(jié)構(gòu)，使植物葉片葉綠素含量降低，降低光合強度，這是重金屬對植物毒害的普遍現(xiàn)象[13]。本研究中，海菜花種子在受到Cd2+脅迫時，葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量均下降，這與Cd2+脅迫對黑麥草[10]、烤煙[14]綠葉素的影響規(guī)律一致。其主要原因是鎘抑制了葉綠素合成，降低海菜花幼苗中的葉綠素含量，減弱其光合作用，抑制其生長[10，13-14]。

SOD、POD、CAT是植物體內(nèi)酶促防御系統(tǒng)的3個重要保護酶，它們發(fā)揮協(xié)同作用，消除活性氧，保護植物膜系統(tǒng)。本研究表明，隨著Cd2+處理濃度的增大，SOD、POD活性都是先升后降，這與Cd2+對黑麥草[10]，Cu2+對海菜花幼苗[15]葉片中SOD、POD酶活性的影響規(guī)律一致。由此表明，低濃度Cd2+對POD、SOD活性具有激活作用，隨著Cd2+濃度逐漸增大，又轉(zhuǎn)為抑制作用。CAT活性則隨著Cd2+濃度增大而逐漸降低。由此可見，海菜花幼苗受Cd2+脅迫后抗氧化酶系統(tǒng)反饋機制不同，CAT、POD、SOD活性呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律。陳國祥等認為，低濃度的重金屬逆境脅迫會抑制植物根系對養(yǎng)分、水分的吸收，同時引發(fā)活性氧（ROS）積累，增強脂質(zhì)過氧化作用，使得SOD、POD活性增強[16]。本研究中，在低濃度Cd2+脅迫下，海菜花為有效緩解Cd2+脅迫引起的氧化脅迫，及時清除ROS的積累，SOD、POD活性增強也充分證實了此觀點。但隨著Cd2+濃度的進一步增大，高濃度的Cd2+導致海菜花幼苗中活性氧等自由基的積累超過植物本身的耐受極限，轉(zhuǎn)而開始抑制SOD、POD的活性。隨著Cd2+濃度增大，CAT活性逐漸降低，這可能是海菜花種子CAT對Cd2+敏感，不能抵御外來污染物脅迫，這也可能是其耐受性較差的原因之一。

海菜花幼苗中的可溶性蛋白是植物細胞內(nèi)未與膜系統(tǒng)特異結(jié)合的酶，其含量越高，說明其體內(nèi)生理生化反應與代謝活性越旺盛，有利于植物抵御逆境脅迫[12]。本研究中，隨著Cd2+濃度增大，可溶性蛋白質(zhì)含量先升高后降低的變化趨勢，與Cd2+對谷子幼苗[12]、Cu2+對海菜花幼苗[15]葉片中可溶性蛋白質(zhì)的影響結(jié)果一致。究其原因，一方面可能是適量的Cd2+可以誘導合成一些新蛋白質(zhì)，參與抗逆性生理活動，促進可溶性蛋白質(zhì)含量的增加；另一方面，高濃度Cd2+也誘導了蛋白水解酶活性增強，加速了蛋白質(zhì)水解[12]，同時高濃度Cd2+脅迫導致海菜花抗氧化酶系統(tǒng)受損，抗性酶減少，從而導致可溶性蛋白質(zhì)含量減少。

參考文獻：

[1]王 磊，張 菲，王從彥，等. Cu、Cd污染背景下加拿大一枝黃花葉水提液對萵苣種子萌發(fā)和生長的生態(tài)毒理效應[J]. 生態(tài)毒理學報，2015，10（4）：203-209.

[2]趙志鵬，邢 丹，劉鴻雁，等. 典型黃壤和石灰土對Cd的吸附解吸特性[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學，2015，43（6）：83-86.

[3]馬海鴿，蔣 齊，王占軍，等. 溫度和光照對不同預處理野生甘草種子萌發(fā)和幼苗生長的影響[J]. 水土保持研究，2014，21（5）：225-229，235.

[4]王秀英. 模擬酸雨對小麥種子萌發(fā)和幼苗生長的影響[J]. 水土保持研究，2014，21（6）：265-270.

[5]李合生. 植物生理生化試驗原理和技術[M]. 北京：高等教育出版社，2000.

[6]張志良，瞿偉菁. 植物生理學實驗指導[M]. 3版.臺北：藝軒圖書出版社，2009.

[7]韓寶賀，朱 宏，張藝馨. 鎘對三種草坪草種子萌發(fā)與生長的影響[J]. 中國草地學報，2014，36（3）：98-103.

[8]郭 媛，邱財生，龍松華，等. 鎘脅迫對不同地區(qū)亞麻主栽品種種子萌發(fā)的影響[J]. 作物雜志，2015（4）：146-151.

[9]王新新，吳 亮，朱生鳳，等. 鎘脅迫對堿蓬種子萌發(fā)及幼苗生長的影響[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2013，32（2）：238-243.

[10]孫園園，張光蘭，楊文杰，等. 鎘脅迫對1年生黑麥草種子萌發(fā)及幼苗初期生理生化特性的影響[J]. 種子，2014，33（8）：25-29.

[11]楊居榮，黃 翌. 植物對重金屬的耐性機理[J]. 生態(tài)學雜志，1994，13（6）：20-26.

[12]肖志華，張義賢，張喜文，等. 外源鉛、銅脅迫對不同基因型谷子幼苗生理生態(tài)特性的影響[J]. 生態(tài)學報，2012，32（3）：889-897.

[13]宇克莉，孟慶敏，鄒金華. 鎘對玉米幼苗生長、葉綠素含量及細胞超微結(jié)構(gòu)的影響[J]. 華北農(nóng)學報，2010，25（3）：118-123.

[14]賀 遠，王樹聲，劉海偉，等. 鎘濃度對烤煙幼苗鎘含量及生長和生理指標的影響[J]. 中國煙草科學，2014，35（2）：37-42.

[15]朱 健，張志紅，范菲菲，等. 銅脅迫對海菜花幼苗生理特征的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報，2015，31（4）：883-886.

[16]陳國祥，施國新，何 兵，等. Hg、Cd對莼菜越冬芽光合膜光化學活性及多肽組分的影響[J]. 環(huán)境科學學報，1999，19（5）：521-525.