鐘偉，戴連枝，周松

（中國人民解放軍第一七五醫(yī)院/廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院 1. 普通外科 2. 醫(yī)務(wù)處，福建 漳州 363000）

胰腺癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，病死率位于惡性腫瘤的第4位，5年存活率僅為7%[1]。外科手術(shù)是提高5年生存率的有效手段之一，但是由于胰腺癌缺乏早期臨床癥狀、缺乏早期診斷方法等，只有20%的患者具有手術(shù)切除的機會，大多數(shù)患者在被診斷出胰腺癌時已經(jīng)處于進展期[2]。早期診斷治療是延長胰腺癌患者生存時間、改善患者預(yù)后的關(guān)鍵[3]。

miRNA是一類長約22個核苷酸的小分子單鏈非編碼RNA分子，它能與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)結(jié)合，通過使mRNA降解或者抑制mRNA的翻譯來調(diào)節(jié)蛋白的表達水平[4]。miRNA在細胞凋亡、代謝、增殖、分化等過程中具有重要的作用；在腫瘤中，miRNA可能作為癌基因或者抑癌基因調(diào)控癌癥的發(fā)生發(fā)展[5]。近年來，在人體血漿、血清、尿液、唾液等體液中的miRNA被用于包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的診斷研究[6]。由于其在細胞外生物流體中的穩(wěn)定性、疾病特異性、分析可及性以及測量時的高敏感性和可靠性使得循環(huán)miRNA成為重要的疾病診斷指標[7]。目前的研究[8]表明，miR-21在胰腺癌中是高表達的，血漿中高表達miR-21的胰腺癌患者生存期更短，肝臟和局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率更高。Sicard等[9]的研究報道敲低miR-21可以抑制胰腺癌的增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡；阻斷miR-21聯(lián)合化療藥物處理可以抑制胰腺癌的發(fā)生發(fā)展。因此，miR-21可能作為胰腺癌的診斷指標及治療靶點。

然而，國內(nèi)外關(guān)于miR-21診斷胰腺癌的研究結(jié)果并不一致，可能是因為樣本量較小、樣本的來源不同、疾病的狀態(tài)差異及檢測方法不同。本研究旨在通過Meta分析，綜合評價miR-21診斷胰腺癌的價值，以期為miR-21的進一步研究和臨床應(yīng)用提供詢證醫(yī)學(xué)證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 文獻檢索

檢索Pubmed、OVID、Embase、CNKI、萬方數(shù)據(jù)庫，收集2017年5月之前公開發(fā)表的關(guān)于miR-21在胰腺癌血液中的濃度及其診斷意義的文獻。使用的檢索詞包括：miR-21、miRNA-21、microRNA-21、Pancreatic Cancer、Pancreatic tumor、Pancreatic carcinoma、Pancreatic Neoplasms、Diagnosis、Sensitivity、Specificity、ROC curve。檢索的語言包括英語和漢語。

1.2 文獻的納入與排除標準

文獻納入標準為：⑴ 研究類型為含有miR-21胰腺癌診斷價值的前瞻性或回顧性研究；⑵ 研究對象涵蓋胰腺癌及胰腺良性疾患，采用病理診斷為金標準，文獻需明確說明受試者為胰腺癌或其它病理類型；⑶ 檢測樣本為患者的血液標本；⑷ 文章提供了miR-21檢測在各病例組的真陽性（true positive，TP）、真陰性（true negative，TN）、假陽性（false positive，F(xiàn)P）、假陰性（false negative，F(xiàn)N）例數(shù)或可以通過文章提供的數(shù)據(jù)計算得到。文獻排除標準：⑴ miR-21的檢測方法不是定量檢測；⑵ 研究標本對象為病理組織或胰液、糞便等材料；⑶ 重復(fù)性實驗中發(fā)表較早或樣本量較小的文獻；⑷ 每組病例數(shù)＜10。

1.3 資料提取與質(zhì)量評價

由2名評價者獨立按照預(yù)先制定的納入排除標準篩選文獻、提取數(shù)據(jù)，根據(jù)QUADAS-2（quality assessment of diagnostic accuracy studies 2）評價標準[10]對納入文獻進行質(zhì)量評價，如意見不統(tǒng)一則討論解決或參考第三方意見。提取的資料包括文獻基本信息（包括第一作者、發(fā)表時間、國家、檢測方法等）、實驗設(shè)計及實驗原始數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

對于診斷性Meta分析，所有納入研究的TP、FP、FN、TN的例數(shù)通過直接獲取或計算得到。計算真陽性率和假陽性率的Spearman相關(guān)系數(shù)r，分析是否存在閾值效應(yīng)。采用Cochran's Q檢驗分析納入研究之間是否存在異質(zhì)性，以I2估算分析異質(zhì)性的大小，根據(jù)異質(zhì)性分析的結(jié)果選擇用隨機效應(yīng)模型計算miR-21的合并敏感度（sensitivity）、特異度（specificity）、似然比（likelihood ratio，LR）及各自的95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）。以Mose's constant線性模型擬合綜合受試者工作特征曲線（summary receiver operating characteristic curve，SROC curve），以診斷比值比（diagnostic odd ratio，DOR）、曲線下面積（area under curve，AUC）評價診斷試驗循環(huán)miR-21對胰腺癌診斷的準確性。以每次減少1篇文獻的方法進行敏感性分析，評價本次分析的穩(wěn)定性。以Deek漏斗圖評價納入的研究是否存在發(fā)表偏倚。本文統(tǒng)計分析采用軟件STATA MP 14和Meta-Disc 1.4，以P＜0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 檢索結(jié)果及納入文獻

通過設(shè)定的檢索詞進行檢索，共找到301篇文獻。剔除重復(fù)后獲得文獻189篇，閱讀文題和摘要排除157篇，初步納入文獻32篇。進一步閱讀全文，按照納入和排除標準，排除24篇，最終共納入8篇文獻進行Meta分析。文獻的篩選流程詳見圖1。

圖1 文獻篩選流程Figure 1 Literature screening process

2.2 納入研究的基本特征和質(zhì)量評價

本文共納入8項研究，累計病例261例，對照242例。各研究的基本信息、樣本來源、TP、FP、FN和TN的例數(shù)參見表1。文獻質(zhì)量評價用QUADAS-2評價系統(tǒng)，結(jié)果如表2。

2.3 異質(zhì)性檢驗

通過Meta-Disc計算靈敏度對數(shù)與（1-特異度）對數(shù)的Spearman相關(guān)系數(shù)，結(jié)果顯示不存在閾值效應(yīng)引起的異質(zhì)性（r=-0.024，P=0.955）。以D O R作為效應(yīng)量分析m i R-2 1的異質(zhì)性，結(jié)果顯示研究間存在非閾值效應(yīng)引起的異質(zhì)性（Cochran-Q=12.89，P＜0.1，I2=45.7%），故以下分析選用隨機效應(yīng)模型。

表1 納入研究的基本特征Table 1 General feature of the included studies

表2 文獻質(zhì)量評價Table 2 Quality assessment of the included studies

2.4 miR-21診斷胰腺癌的合并統(tǒng)計量分析

圖2 敏感度和特異度的森林圖Figure 2 Forest plot of sensitivity and speci fi city

圖2 所示為miR-21對胰腺癌診斷敏感度和特異度的森林圖。miR-21診斷胰腺癌的合并敏感度為0.76（95% CI=0.71～0.81），合并特異度為0.76（95% CI=0.70～0.81）。圖3所示為miR-21對胰腺癌診斷陽性似然比（positive likelihood ratio，PLR）和陰性似然比（negative likelihood ratio，NLR）的森林圖。miR-21診斷胰腺癌的PLR為3.17（95% CI=2.24～4.47）；NLR為0.26（95% CI=0.15～0.45），DOR為13.17（95% CI=6.78～25.58）。圖4所示為miR-21診斷胰腺癌的SROC曲線，AUC=0.8518。

圖3 PLR和NLR的森林圖Figure 3 Forest plot of PLR and NLR

圖4 循環(huán)miR-21診斷胰腺癌的SROC曲線Figure 4 SROC curve of circulating miR-21for diagnosing pancreatic cancer

2.5 亞組分析

表3顯示按照檢測樣本來源和病例對照的來源不同分組進行亞組分析的結(jié)果。結(jié)果顯示，血清組合并敏感度比血漿組稍高（0.87 vs. 0.73），而兩組的AUC值均為0.8513。按照對照來源不同分為健康人群組和健康人群+良性疾患組（慢性胰腺炎/胰腺導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀黏液瘤+健康人群），健康人群組的一致性較好（Cochran-Q=4.61，P=0.33，I2=13.2%），診斷的準確性優(yōu)于健康人群+良性疾患組（AUC：0.876 vs. 0.72，P＜0.05）。

表3 miR-21診斷胰腺癌的亞組分析Table 3 Subgroup analysis of circulating miR-21 in diagnosing pancreatic cancer

2.6 發(fā)表偏倚

D e e k對稱性檢驗結(jié)果顯示漏斗圖基本對稱（圖5），提示納入研究無明顯發(fā)表偏倚（Bias=17.38，P=0.241）。

圖5 納入研究的發(fā)表偏倚分析Figure 5 The publication bias analysis of included studies

2.7 敏感性分析

以每次減少1篇文獻的方法進行敏感性分析，評估單個研究對本次Meta分析的影響。表4顯示的是刪除其中1篇文獻后計算的合并DOR及其95% CI的結(jié)果。由表可見，剔除之后的合并DOR均未發(fā)生明顯變化，提示本次分析結(jié)果并未過分依賴于某個研究，結(jié)論穩(wěn)定。

表4 各研究對Meta分析結(jié)果的敏感性分析Table 4 The in fl uence of each study for the outcome of the Meta-analysis

3 討 論

胰腺癌在癌癥相關(guān)性死亡中占第4位，超過80%的患者在診斷為胰腺癌后由于腫瘤的進展無法進行手術(shù)切除[19]；加上化療效果不佳等原因，胰腺癌的5年存活率非常低。目前，用于胰腺癌診斷的常用腫瘤標志物有CA-199、CEA等，但正常人多種組織發(fā)生病變時CA-199及CEA分泌亦會增加，且易出現(xiàn)假陽性及假陰性，用于早期診斷的效果不佳[3, 16, 20]。

自1993年發(fā)現(xiàn)小分子干擾RNA以來[21]，大量的研究關(guān)注于miRNA對疾病基因的調(diào)控。miRNA可以通過靶向mRNA負調(diào)控基因表達，為研究疾病的機制、靶向治療提供了新的方向[22]。目前胰腺癌的診斷主要是通過傳統(tǒng)的方法，比如組織活檢，超聲引導(dǎo)下的細針穿刺等。血漿或血清miRNA的檢測可以作為一種非侵入性的檢測方法，相比傳統(tǒng)方法具有較大的優(yōu)勢。同時，循環(huán)miRNA可以通過與Argonaute蛋白結(jié)合避免被RNA酶降解[23]，使其穩(wěn)定存在于循環(huán)血中。miR-21在胰腺癌中是高表達的，血漿中高表達miR-21的胰腺癌患者生存期更短[24]。這些研究結(jié)果提示，血液miR-21可能作為胰腺癌的重要診斷指標。但是由于不同研究結(jié)果的差異，循環(huán)miR-21對胰腺癌的診斷效能仍未明確。

本文一共納入8項研究進行Meta分析，包括261例胰腺癌，242例對照。研究顯示miR-21診斷胰腺癌文獻的合并敏感度為0.76，合并特異度為0.76，說明miR-21對胰腺癌的診斷具有潛在的價值。SROC和DOR是用來評價診斷表現(xiàn)的指標。DOR值越高，說明診斷試驗的辨別力越好[25]。而SROC曲線越接近左上角，AUC越大，說明診斷的準確性越高[26]。Meta分析結(jié)果顯示DOR=13.17，AUC=0.8518，說明miR-21用于胰腺癌的診斷具有較高的準確性。通常，PLR＞10 或NLR＜0.1，可以確定或排除診斷。本研究結(jié)果顯示PLR=3.17，NLR=0.26，提示有臨床癥狀miR-21陽性還不能確診胰腺癌，陰性時不能排除胰腺癌的可能，此結(jié)果與張英英等[27]研究miRNA診斷胰腺癌的結(jié)果比較相似。

由SROC曲線平面圖可見，各研究對應(yīng)的點散在分布，不呈“肩臂”狀外觀，Spearman相關(guān)系數(shù)檢驗顯示異質(zhì)性與閾值效應(yīng)無關(guān)。以DOR作為效應(yīng)量，納入的研究間存在中等程度的異質(zhì)性。按照樣本來源不同分為血漿組和血清組進行亞組分析，血漿miR-21和血清miR-21檢測具有相同的準確性。按照對照來源不同分為健康人群組和健康人群+良性疾患組，健康人群組的同質(zhì)性和準確性高于健康人群+良性疾患組。以健康者為對照存在一定的局限性，可能降低了診斷效能。鄭雷教授介紹在約翰霍普金斯醫(yī)院，一種提高早期診斷的方法是研究胰腺癌的癌前病變，也稱之為胰腺囊性疾病[28]。健康人群+良性疾患組的敏感度較健康人群組高特異度較健康人群組低，可能是因為miR-21的檢測將一部分可能發(fā)展為胰腺癌的胰腺囊性疾病診斷為胰腺癌。這降低了整體的診斷準確性，但是可能提高早期診斷的效果，讓一部分胰腺囊性疾病患者盡早的得到手術(shù)治療。然而，該假設(shè)的證實和應(yīng)用需要更多的臨床和基礎(chǔ)的研究的支持。另外，本文納入的8項研究均采用qRTPCR的方法，但是TaqMan探針法和SYBR Green熒光染料法可能存在差異[29]。

綜上所述，miR-21對胰腺癌具有一定的診斷價值，應(yīng)用miR-21診斷胰腺癌在臨床上具有可行性。但目前miR-21的臨床相關(guān)研究尚缺乏大樣本、多中心的數(shù)據(jù)論證，缺乏統(tǒng)一的檢測方法及嚴格的質(zhì)控標準，上述結(jié)論仍需要開展高質(zhì)量的研究予以驗證。此外，由于miRNA作用的多重性，其特異性作用機制等尚需進一步探討。隨著研究內(nèi)容的不斷深入，循環(huán)miR-21檢測將在胰腺癌的早期診斷、預(yù)后判斷等方面可能展現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用價值。

[1]Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2016[J]. CA Cancer J Clin, 2016, 66(1):7–30. doi: 10.3322/caac.21332.

[2]Chari ST, Kelly K, Hollingsworth MA, et al. Early detection of sporadic pancreatic cancer: summative review[J]. Pancreas, 2015,44(5):693–712. doi: 10.1097/MPA.0000000000000368.

[3]曾復(fù), 葛春林. 胰腺癌185例診治回顧分析[J]. 中國普通外科雜志,2015, 24(3):336–342. doi:10.3978/j.issn.1005–6947.2015.03.006.Zeng F, Ge CL. Diagnosis and treatment of pancreatic cancer:a retrospective analysis of 185 cases[J]. Chinese Journal of General Surgery,2015, 24(3):336–342. doi:10.3978/j.issn.1005–6947.2015. 03.006.

[4]Takahashi RU, Miyazaki H, Ochiya T. The role of microRNAs in the regulation of cancer stem cells [J]. Front Genet, 2014, 4:295.doi: 10.3389/fgene.2013.00295.

[5]Abreu FB, Liu X, Tsongalis GJ. miRNA analysis in pancreatic cancer: the Dartmouth experience[J]. Clin Chem Lab Med, 2017,55(5):755–762. doi: 10.1515/cclm–2017–0046.

[6]Tricoli JV, Jacobson JW. MicroRNA: Potential for Cancer Detection, Diagnosis, and Prognosis[J]. Cancer Res, 2007,67(10):4553–4555.

[7]Turchinovich A, Weiz L, Burwinkel B. Extracellular miRNAs: the mystery of their origin and function [J]. Trends Biochem Sci, 2012,37(11):460–465. doi: 10.1016/j.tibs.2012.08.003.

[8]Abue M, Yokoyama M, Shibuya R, et al. Circulating miR-483-3p and miR-21 is highly expressed in plasma of pancreatic cancer[J].Int J Oncol, 2015, 46(2):539–547. doi: 10.3892/ijo.2014.2743.

[9]Sicard F, Gayral M, Lulka H, et al. Targeting miR-21 for the therapy of pancreatic cancer[J]. Mol Ther, 2013, 21(5): 986–994. doi:10.1038/mt.2013.35.

[10]Whiting PF, Rutjes AW, Westwood ME, et al. QUADAS-2: a revised tool for the quality assessment of diagnostic accuracy studies[J].Ann Intern Med, 2011, 155(8):529–536. doi: 10.7326/0003–4819–155–8-201110180–00009.

[11]Wang J, Chen J, Chang P, et al. MicroRNAs in plasma of pancreatic ductal adenocarcinoma patients as novel blood-based biomarkers of disease[J]. Cancer Prev Res (Phila), 2009, 2(9):807–813. doi:10.1158/1940–6207.CAPR–09–0094.

[12]劉建強, 高軍, 任艷, 等. 血漿miR-21對胰腺癌的診斷價值[J]. 世界華人消化雜志, 2011, 19(8):860–863.Liu JQ, Gao J, Ren Y, et al. Diagnostic value of plasma miR-21 in pancreatic cancer[J]. World Chinese Journal of Digestology, 2011,19(8):860–863.

[13]汪善兵, 劉佳培, 雷開鍵, 等. 胰腺癌患者血漿中miRNAs異常高表達與臨床特征相關(guān)性的研究[J]. 腫瘤, 2015, 35(8):905–910.doi:10.3781/j.issn.1000–7431.2015.33.123.Wang SB, Liu JP, Lei KJ, et al. Aberrant overexpressions of microRHAs in plasma and their correlations with the clinical features of patients with pancreatic cancer[J]. Tumor, 2015,35(8):905–910. doi:10.3781/j.issn.1000–7431.2015.33.123.

[14]吳陽, 王佐正, 黃李雅. 血清miRNAs作為胰腺癌診斷腫瘤標志物的初步研究[J]. 寧夏醫(yī)學(xué)雜志, 2015, 37(8):675–677.doi:10.13621/j.1001–5949.2015.08.0675.Wu Y, Wang ZZ, Huang LY. A preliminary study on plasma microRNAs as a tumor marker in the diagnosis of pancreatic cancer[J]. Ningxia Medical Journal, 2015, 37(8):675–677.doi:10.13621/j.1001–5949.2015.08.0675.

[15]Alemar B, Izetti P, Gregório C, et al. miRNA-21 and miRNA-34a Are Potential Minimally Invasive Biomarkers for the Diagnosis of Pancreatic Ductal Adenocarcinoma[J]. Pancreas, 2016, 45(1):84–92.doi: 10.1097/MPA.0000000000000383.

[16]Que R, Ding G, Chen J, et al. Analysis of serum exosomal microRNAs and clinicopathologic features of patients with pancreatic adenocarcinoma[J]. World J Surg Oncol, 2013, 11:219.doi: 10.1186/1477–7819–11–219.

[17]左利平, 尚亞飛, 韓坤, 等. 胰腺癌患者血漿中MicroRNA的表達及臨床意義[J]. 基層醫(yī)學(xué)論壇, 2017, 21(7):777–779.doi:10.19435/j.1672–1721.2017.07.005.Zuo LP, Shang YF, Han K, et al. Expression and clinical significance of MicroRNA in peripheral blood of patients with pancreatic cancer[J]. The Medical Forum, 2017, 21(7):777–779.doi:10.19435/j.1672–1721.2017.07.005.

[18]潘文征, 唐萬燕, 袁偉, 等. 微小 RNA 在胰腺癌患者血漿中的表達情況及臨床意義[J]. 中華腫瘤雜志, 2014, 36(5):351–354.doi:10.3760/cma.j.issn.0253–3766.2014.05.007.Pan WZ, Tang WY, Yuan W, et al. Expression and clinical significance of plasma small RNA in patients with pancreatic cancer[J]. Chinese Journal of Oncology, 2014, 36(5):351–354.doi:10.3760/cma.j.issn.0253–3766.2014.05.007.

[19]Miller KD, Siegel RL, Lin CC, et al. Cancer treatment and survivorship statistics, 2016[J]. CA Cancer J Clin, 2016, 66(4):271–289. doi: 10.3322/caac.21349.

[20]劉書中, 李子全, 李政垚, 等. 外周血 miR-21檢測在胰腺癌中的意義研究進展[J]. 中國實驗診斷學(xué), 2016, 20(6):1038–1042.Liu SZ, Li ZQ, Li ZY, et al. Research progress of detection of peripheral blood in pancreatic cancer[J]. Chinese Journal of Laboratory Diagnosis, 2016, 20(6):1038–1042.

[21]Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14[J]. Cell, 1993, 75(5):843–854.

[22]Vorvis C, Koutsioumpa M, Iliopoulos D. Developments in miRNA gene signaling pathways in pancreatic cancer[J]. Future Oncol,2016, 12(9):1135–1150. doi: 10.2217/fon–2015–0050.

[23]Arroyo JD, Chevillet JR, Kroh EM, et al. Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011,108(12):5003–5008. doi: 10.1073/pnas.1019055108.

[24]Khan K, Cunningham D, Peckitt C, et al. miR-21 expression and clinical outcome in locally advanced pancreatic cancer: exploratory analysis of the pancreatic cancer Erbitux, radiotherapy and UFT(PERU) trial[J]. Oncotarget, 2016, 7(11):12672–12681. doi:10.18632/oncotarget.7208.

[25]Glas AS, Lijmer JG, Prins MH, et al. The diagnostic odds ratio:a single indicator of test performance[J]. J Clin Epidemiol, 2003,56(11):1129–1135.

[26]Walter SD. Properties of the summary receiver operating characteristic (SROC) curve for diagnostic test data[J]. Stat Med,2002, 21(9):1237–1256.

[27]張英英, 周曉彬, 朱小艷, 等. miRNAs 對胰腺癌診斷價值的 Meta分析 [J]. 中國循證醫(yī)學(xué)雜志, 2017, 17(1):78–86.Zhang YY, Zhou XB, Zhu XY, et al. Diagnostic value of miRNAs for pancreatic cancer: a meta-analysis[J]. Chinese Journal of Evidence-based Medicine, 2017, 17(1):78–86.

[28]黃曉曼. 鄭雷教授:胰腺癌的多學(xué)科綜合診療[J]. 中國普通外科雜志, 2016, 25(3):318–320. doi:10.3978/j.issn.1005–6947.2016.03.002.Huang XM. Professor Lei Zheng: Multidisciplinary management for pancreatic cancer[J]. Chinese Journal of General Surgery, 2016,25(3):318–320. doi:10.3978/j.issn.1005–6947.2016.03.002.

[29]Wang Y, Gao X, Wei F, et al. Diagnostic and prognostic value of circulating miR-21 for cancer: a systematic review and metaanalysis[J]. Gene, 2014, 533(1):389–397. doi: 10.1016/j.gene.2013.09.038.