張 昆， 李明娜， 曹世豪， 孫 彥

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院草業(yè)科學(xué)系 草業(yè)科學(xué)北京重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100193)

據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全球有約10億hm2土地不同程度的受到了鹽漬化的危害，且這一數(shù)字仍在逐年增加。我國鹽漬土面積約3 600萬hm2，鹽堿化耕地760萬hm2，占全國可利用土地面積4.88%[1-2]。同時(shí)，隨著人類活動對自然的影響，不合理的施肥與灌溉等使得土壤鹽漬化面積正在逐年增加。鹽脅迫對植物生長主要影響表現(xiàn)在破壞了細(xì)胞內(nèi)外的離子和水分的平衡，引起植物代謝失調(diào)，同時(shí)積累了大量活性氧，產(chǎn)生了毒害作用，造成膜的損傷，最終抑制了植物生長，甚至導(dǎo)致死亡[3-4]。在長期自然選擇過程中,植物通過自身的調(diào)節(jié)來適應(yīng)環(huán)境。研究表明，植物有許多種機(jī)制來適應(yīng)鹽脅迫下的環(huán)境，包括生長，代謝、滲透和細(xì)胞信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)等途徑[5-7]。因此，通過研究植物耐鹽的分子機(jī)制，進(jìn)而通過基因工程等手段開發(fā)和利用優(yōu)良種質(zhì)資源，培育耐鹽新品種，對提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力和鹽漬土壤的改良都有十分重要的意義。

近年來隨著功能基因組學(xué)研究不斷深入及其相關(guān)技術(shù)不斷完善，植物的耐鹽分子機(jī)制研究有了許多新的進(jìn)展，特別是鹽脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和耐鹽基因的鑒定、克隆及其功能分析等方面有了新的認(rèn)識[8-9]。鹽脅迫信號傳遞的早期過程主要是：植物中位于細(xì)胞表面的信號受體感受到外界環(huán)境中的逆境信號，激起(或抑制)一個級聯(lián)反應(yīng)，在這過程中與受體偶聯(lián)的蛋白質(zhì)的磷酸化被認(rèn)為是主要的信號起始過程，從而誘導(dǎo)一系列的基因表達(dá)調(diào)控的改變。到目前為止，從植物中已分離克隆出大量有關(guān)的鹽脅迫誘導(dǎo)基因，這些基因主要參與了植物滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成、光合與代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等進(jìn)程。通過正、反向遺傳學(xué)以及蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)，部分鹽誘導(dǎo)基因的產(chǎn)物功能已被確定[6-7,10-11]。本文對近些年以上研究結(jié)果進(jìn)行了綜述。

1 滲透脅迫信號途徑及相關(guān)基因

1.1 滲透脅迫信號途徑

高滲透性甘油促分裂原活化蛋白激酶(High osmolarity glycerol mitogen activated protein kinase, HOG-MAPK)通路是目前研究最為徹底的滲透感知信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可以激活一系列脅迫相關(guān)的應(yīng)答反應(yīng)，該信號途徑首先在酵母中被發(fā)現(xiàn)。其中起重要作用的是一個跨膜組氨酸激酶SLN1，是該機(jī)制中重要的滲透脅迫信號受體。當(dāng)處于脅迫引起的高滲環(huán)境中時(shí)，SLN1失去激酶活性，導(dǎo)致下游基團(tuán)發(fā)生去磷酸化，并且這種磷酸化基團(tuán)隨后被轉(zhuǎn)移到響應(yīng)調(diào)控子，激活下游HOG-MAPK信號通路[12]。在植物中，現(xiàn)已證實(shí)組氨酸激酶也作為一種重要的信號受體參與植物的多種信號起始，如植物的脅迫響應(yīng)和生長因子的調(diào)控路徑[13]。Urao等[14]最先在擬南芥中克隆出一組氨酸激酶基因AtHK1，對該序列比對發(fā)現(xiàn)AtHK1編碼的蛋白在結(jié)構(gòu)上與酵母的SLN1是有較高的相似性。研究基因功能發(fā)現(xiàn)AtHK1可以恢復(fù)SLN1缺失突變體對鹽的耐受性，說明AtHK1可能具有感知滲透脅迫功能，但其具體功能還需進(jìn)一步研究。此外發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下在HK1型突變體中僅有部分的滲透響應(yīng)發(fā)生了改變，仍有一些滲透調(diào)節(jié)響應(yīng)未受到影響，所以估計(jì)在HK1突變體中可能還存在其他感知滲透脅迫的感應(yīng)器[15]。

滲透脅迫信號的傳導(dǎo)是由植物體內(nèi)具有調(diào)控作用的蛋白激酶來完成的。這一類蛋白激酶中現(xiàn)研究較多的是促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)和Ca2+依賴性蛋白激酶CDPK(calcium-dependent protein kinases)。MAPK是目前鹽脅迫下分離出的最多也是最重要的蛋白激酶，參與了最經(jīng)典鹽脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，接受外界信號并傳入胞內(nèi)，影響了胞內(nèi)特定鹽響應(yīng)蛋白基因的表達(dá)，從而提高植物耐鹽性[16]。石靜等[17]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將GhMAPK基因轉(zhuǎn)入本氏煙草(NicotianatabacumL.)中，獲得的煙草進(jìn)行耐鹽性分析顯示，在高鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因植株種子萌發(fā)率高于野生型，苗期轉(zhuǎn)基因株系能夠正常生長且轉(zhuǎn)基因植株中的抗氧化酶活性明顯提高。伯錫等[18]利用同樣的技術(shù)將OsMAPK4基因整合到水稻基因組上，對轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行耐鹽性分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻種子在含200 mM NaCl的培養(yǎng)基上能正常萌發(fā)，其幼苗在400 mM NaCl處理時(shí)莖部仍為綠色，種子和幼苗耐鹽性均高于對照處理。CDPK(calcium-dependent protein kinases)作為鈣信號傳導(dǎo)通路中關(guān)鍵的傳感器，能解碼和翻譯鈣濃度升高信號從而提高蛋白激酶活性及調(diào)控隨后的下游信號元件[19]。在植物生長發(fā)育以及應(yīng)對各種逆境脅迫刺激過程中均具有重要作用。在擬南芥CDPK基因家族中，AtCPK6受鹽和滲透脅迫誘導(dǎo)，Xu等[20]將過表達(dá)的AtCPK6植株與對照植株相比，過表達(dá)植株對鹽和干旱脅迫的耐受力都有所增強(qiáng)。在鹽脅迫條件下，OsCDPK12通過誘導(dǎo)ROS清除基因OsAPX2/OsAPX8的表達(dá)和抑制NADPH氧化酶基因OsRBOHI的表達(dá)，來調(diào)節(jié)ROS的平衡，提高植物的耐鹽性[21]。

1.2 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)基因

脯氨酸、甜菜堿、多元醇等是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞水勢、保護(hù)大分子結(jié)構(gòu)、維持細(xì)胞膜的完整性等功能。參與這些滲透調(diào)節(jié)物代謝的關(guān)鍵合成酶基因普遍具有鹽誘導(dǎo)性。如吡咯啉-5-羧酸合成酶P5CS是脯氨酸合成和降解的關(guān)鍵酶，王桂花等[22]將轉(zhuǎn)P5CS基因的蒙農(nóng)雜種冰草(Agropyroncristatum(L.) Gaertn)植株用1.5%NaCl鹽脅迫處理，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株的游離脯氨酸含量的增加程度明顯高于對照處理，其丙二醛含量和SOD活性均有不同程度升高，植株耐鹽性提高。膽堿單氧化酶CMO基因和甜菜堿醛脫氫酶基因BADH是甜菜堿生物合成過程中關(guān)鍵酶，徐冰等[23]比較了轉(zhuǎn)CMO-BADH雙基因、轉(zhuǎn)CMO基因和非轉(zhuǎn)基因草地早熟禾(PoaPratensisL.)不同鹽脅迫下耐鹽性分析，結(jié)果表明3個株系耐鹽性強(qiáng)弱為轉(zhuǎn)CMO-BADH雙基因株系>轉(zhuǎn)CMO基因株系>非轉(zhuǎn)基因株系。1-磷酸-甘露脫氫酶基因mt1D也是一類重要的與耐鹽性相關(guān)的滲透調(diào)節(jié)基因，其表達(dá)水平受鹽壓調(diào)控。李自超等[24]利用基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)將大腸桿菌mtlD基因?qū)氲胶档?OryzasativeL.)中，轉(zhuǎn)基因植株及其后代檢測表明，mtlD基因能穩(wěn)定表達(dá)同時(shí)在含0.75%NaCl處理MS培養(yǎng)基中能正常生長，鹽分對轉(zhuǎn)基因植株質(zhì)膜的傷害減輕。

1.3 滲透保護(hù)性蛋白基因

植物體內(nèi)參與滲透保護(hù)性蛋白的基因主要分為兩類，第一類是編碼親水性蛋白基因。這類基因編碼的蛋白具有高度的親水性，起維持胞內(nèi)水相、分子伴侶、穩(wěn)定質(zhì)膜等功能。水通道蛋白(Aquaporins, AQPs)是一類高效特異轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的整合膜蛋白，在植物水分轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用，特別是在逆境脅迫環(huán)境中AQPs參與了液泡的融合、活性氧信號傳導(dǎo)等應(yīng)答途徑[25]。研究發(fā)現(xiàn)在100 mM NaCl脅迫下，大麥(HordeumvulgareL.)根部的導(dǎo)水率和AQPs基因表達(dá)量沒有明顯變化，而在200 mM NaCl下大麥根部導(dǎo)水率及6個HvPIPs mRNA積累顯著降低，表明植物調(diào)控AQPs改變根部導(dǎo)水率應(yīng)對高鹽引起的滲透脅迫[26]。晚期胚胎發(fā)生富集蛋白(Later embryogenesis abundant, LEA)的編碼基因在植物種子胚胎發(fā)育晚期表達(dá)量豐富，而且在干旱、鹽分等脅迫下mRNA大量積累。LEA蛋白具有很高的親水性和熱穩(wěn)定性，在細(xì)胞中起穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，分子伴侶，結(jié)合金屬離子和防止氧化等功能，被認(rèn)為是在脅迫過程中對植物起保護(hù)作用的重要物質(zhì)[27-28]。Park等[29]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法從甘藍(lán)型油菜(BrassicacampestrisL.)中克隆出LEA基因Me-leaN4導(dǎo)入到生菜(Lactucasativa)中，轉(zhuǎn)基因植株在水分和鹽脅迫下都表現(xiàn)出比野生型生菜更強(qiáng)的抗逆性，在100 mM NaCl處理下，轉(zhuǎn)基因植株平均根長和鮮重較野生型均明顯提高。

第二類是編碼熱激蛋白(Heat shock protein, HSP)基因。熱激蛋白期初最早被認(rèn)為主要是受熱脅迫誘導(dǎo)，后來經(jīng)過人們對他結(jié)構(gòu)和功能的深入了解，發(fā)現(xiàn)HSP普遍具有分子伴侶的功能，受多種生物脅迫誘導(dǎo)，是細(xì)胞在逆境環(huán)境中生存的重要因素[30]。近些年來，在植物耐鹽性研究中HSP家族中研究較多的有HSP60,HSP70,HSP90和小熱激蛋白(small Heat shock protein, sHSP)。Xu等[31]在大豆中篩選出12個HSP90基因，從中挑選了5個HSP90基因在擬南芥中過表達(dá)發(fā)現(xiàn)這些基因均能提高擬南芥的耐鹽性，同時(shí)轉(zhuǎn)基因植株中脯氨酸的含量均顯著高于野生型，證明HSP90基因可能參與了植物脯氨酸合成途徑。Zhai等[32]克隆了核桃(Juglansregia)中sHSP17.3基因，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在核桃中過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)鹽處理后轉(zhuǎn)基因植株在CAT,SOD和POD等指標(biāo)上均高于對照組，耐鹽性明顯升高，證明sHSP17.3提高了植物對鹽脅迫的耐受能力，可以作為今后植物耐鹽性研究中的候選基因。

2 依賴ABA的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑及相關(guān)基因

2.1 依賴ABA的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑

脫落酸(ABA)作為植物的一種“應(yīng)急激素”，具有調(diào)節(jié)水分平衡以及抗?jié)B透脅迫的功能。用外源ABA處理擬南芥幼苗，其抗?jié)B透脅迫的能力大大加強(qiáng)，而ABA合成缺陷的突變株對滲透脅迫比野生型敏感得多[33]。目前對ABA調(diào)控鹽脅迫誘導(dǎo)基因表達(dá)路徑的認(rèn)識主要有兩條支路，一條不需要蛋白質(zhì)合成而另一條需要蛋白質(zhì)合成[34]。不需要蛋白質(zhì)合成的支路中，鹽脅迫下ABA誘導(dǎo)的起主要調(diào)控作用的基因其啟動區(qū)域有一個ABA響應(yīng)元件(ABA responsive element, ABRE)，其核心序列為高度保守的“PyACGTGGC”，對一些受ABA誘導(dǎo)的響應(yīng)元件(如擬南芥脫水誘導(dǎo)基因RD29B)表達(dá)起順式調(diào)節(jié)作用。與ABRE結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子都含有保守的亮氨酸拉鏈(bZIP)結(jié)構(gòu)域，ABRE中的核心序列“ACGT”周圍的核苷酸決定了與其結(jié)合的bZIP蛋白的機(jī)構(gòu)和結(jié)合特異性[35]。在擬南芥中，Uno等[36]分離出3個ABRE結(jié)合蛋白，ABRE1，ABRE2和ABRE3。其中ABRE1和ABRE2受干旱、鹽以及外源ABA誘導(dǎo)，其轉(zhuǎn)錄后水平的激活是受ABA依賴磷酸化調(diào)節(jié)的。另外，利用酵母單雜交技術(shù)，Choi等[37]也發(fā)現(xiàn)一類含bZIP結(jié)構(gòu)的ABRE結(jié)合蛋白ABFs，作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)一些鹽誘導(dǎo)基因的表達(dá)。但目前就ABA怎樣激活bZIP蛋白并使其結(jié)合到ABRE上調(diào)控耐鹽相關(guān)基因表達(dá)的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。需要蛋白質(zhì)合成的支路中，鹽脅迫信號通過ABA識別后傳遞給下游轉(zhuǎn)錄因子(如MYC，MYB，NAC)。這些中間蛋白通過與滲透脅迫誘導(dǎo)基因啟動子上的順式作用元件(MYCRS，MYBRS，NACRS)相互識別從而調(diào)節(jié)鹽脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)[38-40]。在擬南芥中，MYC和MYB相關(guān)蛋白AtMYC2和AtMYB2基因已被克隆，并且兩者在植物體內(nèi)過表達(dá)將上調(diào)脫水響應(yīng)基因RD22，AtADH1的表達(dá)[41]。NAC識別ABA位點(diǎn)NACRS結(jié)構(gòu)包括CATGTG，NAC蛋白以多聚體、異二聚體形式結(jié)合到NACRS上，從而在鹽脅迫下增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，最后引起生理生化的變化，但其參與鹽脅迫響應(yīng)的信號通路尚未明確[42]。

2.2 依賴ABA信號途徑的轉(zhuǎn)錄因子

2.2.1MYB類轉(zhuǎn)錄因子 MYB類轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其結(jié)構(gòu)通常包含1～4個甚至更多的不完全重復(fù)序列，每個重復(fù)序列由大約52個氨基酸組成，序列的三級結(jié)構(gòu)上具有螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋的空間結(jié)構(gòu)。根據(jù)這些重復(fù)序列的數(shù)目不同，MYB家族蛋白分為4個類型1R-MYB,2R-MYB,3R-MYB,4R-MYB[43]。研究表明許多MYB家族轉(zhuǎn)錄因子與植物鹽脅迫調(diào)控密切相關(guān)。利用表達(dá)分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下擬南芥、水稻中分別有14個和69個相關(guān)的MYB基因上調(diào)[44]。研究MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能表明其表達(dá)能提高轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性。Dai等[45]從水稻中克隆OsMYB3R-2基因使轉(zhuǎn)基因擬南芥種子能在高鹽環(huán)境下發(fā)芽，并能繼續(xù)生長，而對照處理不能發(fā)芽，說明OsMYB3R-2基因在擬南芥中可以增加植株的鹽脅迫耐受力。小麥的TaMYB32，TaMYB33，TaMYB73在小麥中均受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，超表達(dá)這些基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株耐鹽能力均有所增強(qiáng)[46-48]。Tohge等[49]研究了鹽處理下擬南芥種子萌發(fā)過程中鑒定了鹽響應(yīng)MYB1轉(zhuǎn)錄因子SRM1，發(fā)現(xiàn)許多ABA合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因都能直接負(fù)調(diào)控SRM1，說明其是通過調(diào)節(jié)應(yīng)答ABA激素的水平來提高鹽處理下的耐受力。

2.2.2WRKY類轉(zhuǎn)錄因子 WRKY類轉(zhuǎn)錄因子主要含有高度保守的約60個氨基酸殘基組成結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白。利用核磁共振的方法發(fā)現(xiàn)擬南芥WRKY4結(jié)構(gòu)域是由4個β鏈組成的反向平行β折疊結(jié)構(gòu)，其N端含有一個WRKYGQK氨基酸序列，是結(jié)構(gòu)域的核心序列。根據(jù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和鋅指結(jié)構(gòu)特征，將其分為3個亞家族：I型是含有兩個WRKY結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2型；II型是只有一個WRKY結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)與I型相同；III型也只有一個WRKY結(jié)構(gòu)域，但鋅指結(jié)構(gòu)為C2HC型，該型WRKY轉(zhuǎn)錄因子主要參與多種植物脅迫應(yīng)答反應(yīng)[50]。目前發(fā)現(xiàn)WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物耐鹽方面的作用的主要表現(xiàn)在與植物激素ABA，ROS以及病原體防御等通路存在交叉作用。轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿過表達(dá)GsWRKY20能減少NaCl處理下苜蓿細(xì)胞中Na+和K+的含量，保護(hù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和離子的平衡，從而提高植物的耐鹽性[51]。Tao等[52]報(bào)道了水稻W(wǎng)RKY轉(zhuǎn)錄因子OsWRKY45-2在鹽脅迫應(yīng)答和ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的位置和作用。結(jié)果表明OsWRKY45-2過表達(dá)株系的鹽脅迫抗性降低，ABA敏感性增加，而OsWRKY45-2抑制株系的ABA敏感性降低而鹽脅迫抗性增加，證明其作為轉(zhuǎn)錄中介可能參與了鹽脅迫下ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。Li等[53]將野生型土豆病菌介導(dǎo)的spWRKY1基因?qū)氲絑aofen2號土豆中，提高了Zaofen2號抵抗疫霉菌的能力，同時(shí)轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出了對鹽脅迫的抵抗力，提高了抗氧化酶含量，并誘導(dǎo)促進(jìn)了鹽脅迫相關(guān)基因PR家族等基因的表達(dá)。

2.2.3NAC類轉(zhuǎn)錄因子 NAC類轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域最早在矮牽牛(Petuniahybrida(J. D. Hooker) Vilmorin)NAM、擬南芥ATAF和CUC基因編碼蛋白N端發(fā)現(xiàn)的一段高度保守的序列，由大約150個氨基酸組成，可分為A～E 5個亞結(jié)構(gòu)域，其中C和D高度保守，主要是與DNA結(jié)合，A可能與NAC蛋白形成二聚體的結(jié)構(gòu)有關(guān)，B和E保守性不強(qiáng)，可能賦予NAC基因不同的生物功能。NAC結(jié)構(gòu)域不含有經(jīng)典的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋的結(jié)構(gòu)，而是一種新的由幾個螺旋環(huán)繞一個反向平行的β折疊結(jié)構(gòu)[54]。NAC基因家族的許多成員在植物對鹽脅迫反應(yīng)中存在差別表達(dá)。利用表達(dá)譜數(shù)據(jù)，分析水稻OsNAC家族基因在高鹽脅迫后的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)33個OsNAC基因上調(diào)表達(dá)[55]。Jiang等[56]分析了擬南芥NAC家族基因鹽脅迫下的表達(dá)情況，在擬南芥根部組織中能夠發(fā)現(xiàn)30個AtNAC基因發(fā)生改變，其中26個上調(diào)表達(dá)。已有研究表明NAC轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)受鹽脅迫誘導(dǎo)，如白羊草(Bothriochloaischaemum(L.) Keng)、紫花苜蓿、草地早熟禾等[57-59]。這些轉(zhuǎn)錄因子與耐鹽相關(guān)基因的啟動子區(qū)域中特異結(jié)合，啟動耐鹽基因的表達(dá)，提高植株耐鹽性。Huang等[60]從小麥中分離鑒定了一個新的NAC家族轉(zhuǎn)錄因子TaNAC29，研究該轉(zhuǎn)錄因子的功能發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥鹽處理下過表達(dá)TaNAC29促進(jìn)了種子的萌發(fā)和植株根系的伸長，MDA和H2O2含量低于對照處理并表現(xiàn)出對響應(yīng)ABA調(diào)節(jié)的敏感性，耐鹽性明顯提高。Han等[61]從檸條(CaraganaintermediaKuang & H.C.Fu)中分離了一個NAC家族脅迫響應(yīng)基因CiNAC4，擬南芥中過表達(dá)CiNAC4基因降低了轉(zhuǎn)基因種子萌發(fā)階段對ABA的敏感性。200 mM NaCl鹽處理轉(zhuǎn)基因幼苗，刺激了側(cè)根的形成，耐鹽性明顯高于對照處理。

2.2.4bZIP類轉(zhuǎn)錄因子 bZIP類轉(zhuǎn)錄因子是真核生物轉(zhuǎn)錄因子中分布最廣泛、最保守的一類蛋白。參與了多種生物學(xué)進(jìn)程，對植物生長和脅迫的應(yīng)答具有重要的調(diào)控作用。bZIP在結(jié)構(gòu)上具有以下特點(diǎn)：含有一個約20個氨基酸殘基組成的堿性結(jié)構(gòu)域，能與專一的DNA序列進(jìn)行相互作用。轉(zhuǎn)錄因子的N末端含有酸性激活區(qū)，能以二聚體形式結(jié)合DNA。參與寡聚化作用的亮氨酸拉鏈區(qū)與堿性區(qū)緊密相連，亮氨酸拉鏈形成兩親的α螺旋結(jié)構(gòu)，在bZIP蛋白與DNA結(jié)合之前參與二聚體的形成。還有一些脯氨酸、谷氨酰胺和酸性氨基酸豐富的結(jié)構(gòu)域，這些特殊結(jié)構(gòu)域可能參與調(diào)控下游基因的表達(dá)[62-63]。bZIP轉(zhuǎn)錄因子的耐鹽功能方面的研究在擬南芥中較為深入。AtbZIP17是編碼擬南芥B家族中的一個bZIP轉(zhuǎn)錄因子，該基因C端與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相連，在鹽脅迫下該基因N端從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上釋放下來，進(jìn)入核內(nèi)轉(zhuǎn)錄表達(dá)量明顯升高，提高耐鹽性，并誘導(dǎo)下游逆境相關(guān)基因AtRD29A和AtRD20的表達(dá)[64]。此外，還有AtbZIP1，AtbZIP11，AtbZIP53等在鹽誘導(dǎo)下表達(dá)量均有提高，并且過表達(dá)這些基因可明顯緩解鹽害對植株的影響[65-66]。Ying等[67]從玉米(ZeamaysL.)中克隆了ZmbZIP72基因，發(fā)現(xiàn)該基因受ABA、高鹽和干旱處理誘導(dǎo)，將ZmbZIP72導(dǎo)入到擬南芥中異源過表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株在鹽脅迫下葉片含水量，電導(dǎo)率和存活率均高于對照，提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性。

3 離子脅迫信號路徑及相關(guān)基因

3.1 離子脅迫信號路徑

Ca2+通道蛋白作為信號受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是植物響應(yīng)離子脅迫的重要機(jī)制。Ca2+作為重要的第二信使，當(dāng)植物受到鹽脅迫后細(xì)胞內(nèi)濃度會急劇上升[68]。負(fù)責(zé)Ca2+流的離子通道蛋白是一類鹽壓受體。這些離子通道的打開可能是由于細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致這些跨膜蛋白結(jié)構(gòu)改變所引起的[69]，引起細(xì)胞內(nèi)外離子運(yùn)輸?shù)淖兓?/p>

3.1.1CBL-CIPK途徑 鈣依賴的磷酸酶B類蛋白(calcineurinB-like proteins, CBLs)和CBL相互作用蛋白激酶(CBL-interacting protein kinase, CIPKs)共同參與離子脅迫信號的傳導(dǎo)過程。低的K+含量和高的Mg2+含量產(chǎn)生的離子脅迫信號通過Ca2+流引起了跨膜蛋白與各自的靶蛋白相互作用，起始級聯(lián)磷酸化(CBLs和CIPKs)[70-71]，使下游相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生相應(yīng)改變，或者直接與Ca2+作用的轉(zhuǎn)錄激活因子(鈣調(diào)素的轉(zhuǎn)錄激活因子(calmodulin-binding transcription activators, CAMTAs)、結(jié)合GT元件的轉(zhuǎn)錄因子(GT element-binding-like proteins, GTLs)等)[72-73]相互作用，調(diào)節(jié)鹽脅迫離子平衡基因和與抗逆相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。Li等[74]發(fā)現(xiàn)在野大麥中鹽脅迫下HbCIPK2對植株鹽耐受性起正向調(diào)節(jié)作用，有助于阻止根系中K+的丟失和Na+的積累，維持K+/Na+的動態(tài)平衡，維持細(xì)胞活力。在植物鹽脅迫下CBLs和CIPKs組成了一個復(fù)雜的信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，共同參與逆境響應(yīng)。Pandey等[75]研究和分析了擬南芥中一種CIPKs-CIPK21，鹽脅迫下缺失CIPK21突變體表現(xiàn)對脅迫高度敏感，表達(dá)受Ca2+感受器CBL2和CBL3影響，對其亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)主要位于液泡膜上，并與CBL2和CBL3共表達(dá)。證明CIPK21與CBL共同參與了擬南芥鹽響應(yīng)機(jī)制，主要的功能是調(diào)節(jié)液泡膜內(nèi)外離子和水分的平衡。

3.1.2SOS途徑 通過遺傳篩選SOS突變體，克隆SOS基因以及對其產(chǎn)物功能的生化分析及鑒定，一條調(diào)控植物離子穩(wěn)態(tài)平衡和植物耐鹽性的信號傳遞路徑，即SOS信號路徑逐漸被認(rèn)識。SOS信號路徑含有3個關(guān)鍵的基因，SOS3，SOS2和SOS1。SOS3基因編碼一個EF手型Ca2+結(jié)合蛋白，可以特異性感受由鹽脅迫引起的胞質(zhì)Ca2+變化并向下游傳遞信號[76]。SOS2基因編碼一個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其C末端的調(diào)控區(qū)域有一個21氨基酸的結(jié)構(gòu)域(FISL motif)，可以與N末端催化區(qū)域相互作用，從而引起SOS2激酶活性的內(nèi)部自動抑制[77]。SOS1基因編碼位于質(zhì)膜上的Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其N末端具有高度的疏水性，包含有12個跨膜區(qū)域。SOS1的結(jié)構(gòu)和功能與細(xì)菌、動物的質(zhì)膜Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有非常高的相似性，在平衡胞質(zhì)內(nèi)Na+方面起到重要的作用[78]。目前3個組分之間的關(guān)系已明確：鹽脅迫下，質(zhì)膜上的感受器感受到脅迫后誘導(dǎo)胞內(nèi)Ca2+急劇上升，被特異鈣信號激活的SOS3將信號向下游傳遞同時(shí)結(jié)合到SOS2的FISL結(jié)構(gòu)域，形成SOS3-SOS2激酶復(fù)合體，不僅可以在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)SOS1的表達(dá)，而且增強(qiáng)了SOS1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性，使Na+外排，細(xì)胞內(nèi)建立新的離子平衡，增強(qiáng)了植物的耐鹽性。

除了調(diào)節(jié)SOS1的活性外，SOS路徑還調(diào)節(jié)其他的效應(yīng)子，比如鹽脅迫下影響其他亞細(xì)胞組分膜蛋白Na+的區(qū)隔化的作用。研究表明擬南芥中敲除AtHKT1基因的可以緩解SOS3突變體的鹽敏感性，并且使SOS3突變體內(nèi)積累較低濃度的Na+和較高濃度的K+，說明SOS路徑可能通過抑制AtHKT1的活性從而對Na+的內(nèi)流起負(fù)調(diào)控作用[79]。另外，SOS路徑還可能負(fù)調(diào)控液泡膜Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtNHX家族成員的基因表達(dá)。目前，包括SOS3和SOS2在內(nèi)，在擬南芥中現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)21個SOS2樣的蛋白激酶與8個SOS3樣Ca2+結(jié)合蛋白，這些蛋白可能具有相似的信號調(diào)節(jié)功能，在植物的不同細(xì)胞或者特定發(fā)育階段起作用[80]，但其具體功能以及與植物耐鹽性關(guān)系還有待研究。

3.2 離子平衡蛋白基因

鹽脅迫通過調(diào)節(jié)ATPase活性來提高離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)水平，調(diào)節(jié)細(xì)胞體內(nèi)外的離子平衡，維持胞質(zhì)內(nèi)的正常離子成分和濃度，對于植物抵抗鹽脅迫具有重要作用[81]。這類蛋白主要有：

3.2.1HKT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 HKT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是與植物耐鹽脅迫密切相關(guān)的一類Na+、K+或Na+-K+共轉(zhuǎn)運(yùn)體。目前已經(jīng)在玉米[82]、高粱[83]、小麥[84]、小花堿茅(Puccinelliatenuiflora(Griseb.) Scribn. et)[85]、長穗偃麥草(Elytrigiaelongata(Host) Nevski)[86]等植物中發(fā)現(xiàn)了HKT基因，這些基因的表達(dá)受鹽脅迫的誘導(dǎo)升高。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能，HKT蛋白分為兩個亞型，I型主要是特異轉(zhuǎn)移的Na+運(yùn)輸載體，II型主要是介導(dǎo)Na+/K+協(xié)同運(yùn)輸轉(zhuǎn)運(yùn)載體。在鹽脅迫下，HKT類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要的功能集中在兩個方面：一是參與介導(dǎo)根部Na+的吸收。當(dāng)小麥(TriticumaestivumL.)根系中Na+濃度較低時(shí)，TaHKT2;1同時(shí)參與介導(dǎo)K+和Na+的吸收，當(dāng)Na+濃度較高時(shí)，則參與介導(dǎo)低親和性Na+的吸收[87]。鹽脅迫下擬南芥中敲除AtHKT1;1基因會引起植株根系中Na+含量的降低，葉片中Na+過度積累[88]。二是參與Na+在地上部的長距離運(yùn)輸。研究表明擬南芥AtHKT1;1和水稻OsHKT1;5主要負(fù)責(zé)將木質(zhì)部中的Na+卸載到木質(zhì)部薄壁細(xì)胞中，并通過韌皮部回收到根中再循環(huán)，以此來避免地上部Na+的過量積累，保護(hù)了光合器官不受損傷[89-90]。

3.2.2SOS1反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 SOS途徑主要功能是將胞內(nèi)的過量Na+排出到細(xì)胞外，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的Na+濃度升高，質(zhì)膜上的H+-ATPase水解ATP產(chǎn)生能量把H+從胞質(zhì)中泵入細(xì)胞內(nèi)，產(chǎn)生電化學(xué)梯度和質(zhì)子驅(qū)動力，使得質(zhì)膜上SOS1將Na+逆化學(xué)勢排出細(xì)胞，降低了Na+對細(xì)胞質(zhì)造成的傷害。互花米草(SpartinaalternifloraL.)[91]、小花堿茅[92]、霸王(Sarcozygiumxanthoxylon)[93]等大量研究表明，將SOS1基因在植物體內(nèi)過表達(dá)，植株的耐鹽性增強(qiáng)。此外，SOS1還與Na+長距離運(yùn)輸有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)鹽芥中沉默ThSOS1會導(dǎo)致Na+通過質(zhì)外體途徑大量進(jìn)入中柱，地上部大量積累Na+，葉片失水凋萎[94]。鹽脅迫下擬南芥中過表達(dá)SOS1基因，轉(zhuǎn)基因陽性植株中木質(zhì)部和莖稈中Na+含量低于野生型，轉(zhuǎn)基因植株耐鹽性明顯提高[95]。SOS1還對調(diào)節(jié)胞質(zhì)內(nèi)K+的平衡有一定的作用。Oh等[96]研究發(fā)現(xiàn)，鹽處理下擬南芥中沉默AtSOS1基因會抑制與K+運(yùn)輸和吸收相關(guān)的蛋白的活性，同時(shí)這些相關(guān)蛋白的基因表達(dá)豐度也會顯著降低，說明鹽脅迫下SOS1影響了植物K+的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)。

3.2.3NHX反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 細(xì)胞間隙過高的Na+濃度依然會影響周圍細(xì)胞的生長，所以植物內(nèi)存在另外一條減少胞質(zhì)內(nèi)Na+濃度的重要途徑，即在鹽脅迫下植物會把高濃度的鹽離子從胞質(zhì)中排入液泡內(nèi)，稱為離子的區(qū)域化。這一途徑是依賴于液泡膜上的NHX轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白完成的，由液泡膜上的H+-ATPase和H+-APPase 2個質(zhì)子泵形成的電化學(xué)勢梯度驅(qū)動[97]。大量研究表明鹽脅迫下植物離子區(qū)域化對耐鹽性的提高有重要的意義。Ehab等[98]從鹽土植物濱藜葉中克隆了液泡Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)酶AgNHX1，并且通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)入無花果中(FicuscaricaL.)，結(jié)果表明超表達(dá)的AgNHX1轉(zhuǎn)基因無花果植株耐鹽性明顯提高，鹽處理后葉片脯氨酸含量，K+含量均高于對照處理，300 mM鹽處理后生長依然良好。周愛民等[99]研究了生長在鹽堿地上的野生星星草(Puccinelliatenuiflora(Griseb.) Scribn.)液泡H+-ATPase c亞基基因PutVHA-c的功能，發(fā)現(xiàn)在鹽處理下轉(zhuǎn)基因酵母過表達(dá)PutVHA-c較對照處理表現(xiàn)出了更好的耐鹽性，說明PutVHA-c基因參與了鹽脅迫的應(yīng)答。該發(fā)現(xiàn)在其他植物上也得到證實(shí)，如匍匐剪股穎(Agrostisstolonifera)[100]、紫花苜蓿(MedicagosativaL.)[101]、鹽地堿蓬[102]等。此外，NHX還對植物體內(nèi)K+的區(qū)域化有重要的作用。Rodríguez等[103]發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下番茄(LycopersiconesculentumMill)中過表達(dá)AtNHX1基因促進(jìn)了K+從地下向地上部的運(yùn)輸，液泡中K+濃度升高，提高了細(xì)胞間隙中K+/Na+的比值，降低了Na+毒害效應(yīng)。

4 問題與展望

過去大量的研究已經(jīng)從形態(tài)、生理、代謝等多個角度分析了鹽脅迫下植物離子吸收、運(yùn)輸和平衡，抗氧化代謝和鹽脅迫下信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等重要進(jìn)程。但植物的耐鹽性是由多基因控制的數(shù)量性狀，其分子機(jī)制非常復(fù)雜。目前有關(guān)鹽誘導(dǎo)基因的鑒定、克隆及其產(chǎn)物的功能分析，以及通過高效轉(zhuǎn)化途徑獲得耐鹽轉(zhuǎn)基因植株等方面的研究取得了一定的成果。然而這些距離清晰認(rèn)識植物耐鹽的分子機(jī)制還相距甚遠(yuǎn)，如對脅迫信號的“感受器”的確認(rèn)，鹽脅迫信號傳遞的具體機(jī)制，多個鹽響應(yīng)基因的整合效應(yīng)等方面還缺乏足夠的認(rèn)識。同時(shí)，關(guān)于耐鹽機(jī)制的研究多數(shù)還是在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中進(jìn)行而非自然環(huán)境，可靠性和真實(shí)性有待考究。較深入的研究也只是集中在擬南芥、水稻、大豆等模式植物上面，對特定作物耐鹽機(jī)制的研究還沒有廣泛開展。

隨著后基因時(shí)代的到來，分子標(biāo)記技術(shù)和先進(jìn)的轉(zhuǎn)錄組、蛋白組學(xué)等技術(shù)手段的出現(xiàn)能讓我們更準(zhǔn)確的找到與脅迫相關(guān)的靶點(diǎn)基因、蛋白，加速我們對信號和代謝通路的認(rèn)識。先進(jìn)高效的生物技術(shù)手段(如CRISPR/CAS基因編輯技術(shù))和化學(xué)遺傳手段的應(yīng)用能幫助我們克服基因冗余等問題，幫助我們對植物抗逆性狀進(jìn)行定向改造。今后，我們應(yīng)該加大對自然條件下植物耐鹽機(jī)制研究的投入，重點(diǎn)關(guān)注一些耐鹽新植物，挖掘擬南芥等模式植物未確定的一些特殊基因和耐鹽途徑，豐富我們對植物耐鹽性的認(rèn)識。此外，植物與環(huán)境，植物與植物，植物與微生物之間的互作效應(yīng)對其抵抗脅迫能力的影響也是近些年研究的熱點(diǎn)。相信不久植物的耐鹽的分子機(jī)制研究將會有更大的突破，這必將對抗逆育種的發(fā)展起到重要的推動作用。