趙忠濤+張麗+李超

摘要：采用盆栽方法研究了不同濃度Cu2+、Zn2+脅迫對早熟禾（Poa pratensis L.）品種潤草1號（P. pratensis cv. Runcao No.1）生理特性的影響。通過檢測潤草1號葉片的葉綠素、脯氨酸含量和細胞膜透性，以及根系活力的變化，發(fā)現(xiàn)低濃度的Cu2+、Zn2+刺激了潤草1號的生長，提高了葉片的葉綠素含量以及根系活力；但高濃度的Cu2+、Zn2+能夠導致潤草1號葉片的葉綠素含量、根系活力不同程度地下降。

關鍵詞：早熟禾（Poa pratensis L.）；重金屬；脅迫；生理特性

中圖分類號：S688.4+78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）02-0295-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.02.023

在自然界里，重金屬元素很難被生物體降解，并且重金屬元素還可以在食物鏈的傳遞下，在生物體內層層富集，造成嚴重的生態(tài)危害。土壤中重金屬元素的污染可能會導致土壤肥力的降低與流失、作物產量降低和品質劣化、水環(huán)境污染加重等嚴重后果。因此，如何修復土壤的重金屬元素污染，是環(huán)境和生態(tài)保護所亟待破解的重大課題之一。而在重金屬元素污染較重的區(qū)域種植耐受性較高的植物，特別是非食用性的耐受性較高的植物，是非常有效的恢復生態(tài)環(huán)境的途徑之一[1，2]。銅（Cu2+）和鋅（Zn2+）是植物生長所必需的元素之一。在正常的生理狀態(tài)下，植物體對于Cu2+和Zn2+的吸收主要是通過主動吸收過程來實現(xiàn)。但植物對于Cu2+和Zn2+的主動吸收過程是受到代謝調控的。當Cu2+和Zn2+的濃度超過一定限度時，會對植物體產生不良影響。輕的會使植物體正常的代謝功能發(fā)生紊亂，妨礙植物體的正常生長發(fā)育；嚴重情況下甚至導致植物體的死亡。某些植物在長期的自然選擇或人工篩選下，獲得了某些特異的代謝功能，使得植物能夠在重金屬含量較高的環(huán)境中正常生長，這就是植物的重金屬耐受性[3]。早熟禾（Poa pratensis L.）主要適宜于南方地區(qū)露地栽培，是草坪綠化常用的地被植物之一。其主要用于觀賞草坪的建植，對于降低環(huán)境污染、完善城市綠化及美化起著非常重要的作用[4]。潤草1號（P. pratensis cv. Runcao No.1）是一個新選育的早熟禾品種，于2012年由江蘇農林職業(yè)技術學院培育而成。潤草1號屬于低矮型草坪草，坪用性狀優(yōu)良，具有較強的耐蔭、耐熱性能，抗倒伏和抗病能力強。試驗以潤草1號為材料，研究了其在不同濃度的重金屬元素Cu2+和Zn2+脅迫下生理生化指標的變化規(guī)律，以期為今后開發(fā)利用潤草1號用于Cu2+和Zn2+污染的土壤修復提供理論依據(jù)，并為潤草1號在城市園林的廣泛應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試草地早熟禾品種潤草1號由江蘇農林職業(yè)技術學院提供，供試土壤取自學院花房土質較好的表層土壤，Cu2+添加形式為CuSO4，Zn2+添加形式為ZnCl2，均為分析純。

1.2 處理設置

室外盆栽試驗于2014年9月至2014年11月在江蘇農林職業(yè)技術學院實施。供試土壤風干后過0.5 cm篩，按照1∶3將草炭土和土壤混合配制，并稱重5.0 kg裝入花盆中，然后定植潤草1號。15 d后，分別澆灌Cu2+和Zn2+溶液。以不使用Zn2+、Cu2+處理作為對照，Zn2+、Cu2+濃度梯度均設置為5、10、20、50、100 mg/kg，每個處理重復3次。

1.3 測定方法

1.3.1 葉綠素含量的測定 稱取新鮮葉片0.2 g于研缽中，加入少量碳酸鈣粉和石英砂，再加入2～3 mL的95%乙醇，研磨成勻漿。濾紙過濾到25 mL棕色容量瓶中，并用少量乙醇處理研缽、研棒、殘渣和濾紙上的葉綠體色素，直至濾紙和殘渣中無綠色為止。乙醇定容，搖勻。將提取液倒入比色杯內，以95%乙醇為空白，分別在665、649、470 nm處測定吸光度。平行重復3組[5]。

1.3.2 脯氨酸含量的測定 取剪碎混勻的新鮮葉片0.2 g置于大試管中，加入5 mL 3%磺基水楊酸溶液；管口加蓋玻璃球，于沸水浴中浸提15 min。待冷卻至室溫后，吸取上清液2 mL，加2 mL冰乙酸和3 mL茚三酮顯色液，于沸水浴中加熱15 min。冷卻后加入5 mL甲苯，搖勻萃取，避光靜置待完全分層。用移液槍吸取甲苯層液體于石英比色皿中，于520 nm處測定吸光度，再根據(jù)標準曲線求出脯氨酸含量。平行重復3組[5]。

1.3.3 細胞膜透性的測定 選取新鮮葉片若干，吸干水分后剪下，拭凈，用電子天平稱取2份，各重2 g。1份放入40 ℃恒溫箱內萎蔫1 h，另1份放在燒杯中在室溫下做對照。處理后分別用去離子水沖洗，準確加人20 mL去離子水浸沒葉片。用真空抽氣泵抽氣7～8 min，使細胞中的空氣被抽出，將葉片全部浸人去離子水中。在室溫下靜置20 min，然后用DDS-11D型電導率儀測定溶液的電導率R1；再將其置于沸水浴中煮沸15 min，冷卻后測定其電導率R2，計算出相對電導率，以此表示細胞膜透性。平行重復3組[5]。

1.3.4 根系活力的測定 取新鮮根樣品0.5 g放入燒杯中，加入0.4%TTC溶液和磷酸緩沖液的等量混合液10 mL，把根充分浸沒，在37 ℃下暗處保溫1 h。然后加入1 mol/L硫酸2 mL，以停止反應。把根取出，吸干后與乙酸乙酯3～4 mL和少量石英砂一起研磨。將紅色提取液以乙酸乙酯洗滌2～3次，最后加乙酸乙酯定容至10 mL。在485 nm處比色，以空白處理作為參比讀出吸光度，根據(jù)標準曲線求出四氮唑還原量，以此表示根系活力。平行重復3組[5]。

2 結果與分析

2.1 Cu2+和Zn2+脅迫下潤草1號葉片中葉綠素含量的變化

葉綠素是植物進行光合作用的關鍵因素之一，葉綠素含量水平在一定程度上可以反映植物光合作用能力的強弱；4種不同濃度的Cu2+和Zn2+溶液脅迫對葉綠素含量的作用效果見圖1。從圖1可見，在Cu2+和Zn2+溶液處理之后，潤草1號葉片中葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量隨著Cu2+和Zn2+溶液濃度的升高均呈現(xiàn)先升高再降低的變化趨勢。低濃度的Cu2+和Zn2+處理后，葉綠素含量上升；但當Cu2+濃度≥20 mg/kg或者Zn2+濃度≥50 mg/kg后，葉片中葉綠素含量呈下降趨勢。這說明銅和鋅是潤草1號必需的營養(yǎng)元素，在低濃度下，Cu2+和Zn2+對于潤草1號生長具有一定的促進作用。但高濃度的Cu2+和Zn2+卻會影響到潤草1號葉片中葉綠素的合成，產生了脅迫作用，葉片色素對Cu2+和Zn2+污染的敏感程度高低排序為葉綠素b、葉綠素a、類胡蘿卜素。

在高濃度的Cu2+和Zn2+脅迫下，潤草1號體內的葉綠素含量呈下降趨勢。Cu2+和Zn2+導致潤草1號葉片中葉綠素含量下降的原因可能有多種，推測是Cu2+和Zn2+被植物吸收后，細胞內的Cu2+和Zn2+離子作用于葉綠素生成途徑的酶；Cu2+和Zn2+離子通過改變葉綠素合成相關酶的正常構型，抑制了相關酶的活性，進而阻礙了葉綠素的合成。有研究表明，早熟禾葉片對光的吸收能力源于其中的葉綠體，而葉綠體的變化過程與葉綠素含量、光合速率降低及其結構的破壞密切相關[6]。因此，在重金屬脅迫處理后，會造成葉綠素含量下降及結構被破壞，進而影響光合反應效率，甚至可能影響植物的光合系統(tǒng)、保護酶系統(tǒng)以及物質代謝系統(tǒng)，改變植物正常生理狀態(tài)，最終導致植物死亡。

2.2 Cu2+和Zn2+脅迫下潤草1號葉片中脯氨酸含量的變化

脯氨酸是植物體內調節(jié)滲透平衡的重要物質，在維持細胞滲透壓方面起著重要的作用，并且植物體內的脯氨酸含量可以用作植物對外界環(huán)境重金屬脅迫響應的重要指標之一[7]；4種不同濃度的Cu2+和Zn2+溶液脅迫對葉片脯氨酸含量的作用效果見圖2。從圖2可以看出，在Cu2+和Zn2+脅迫下，潤草1號葉片內脯氨酸的含量隨著Cu2+和Zn2+濃度的升高不斷上升，在Cu2+和Zn2+處理濃度為100 mg/kg時達到最大值，分別為對照的2倍和2.3倍，而且各處理與對照之間差異明顯。

2.3 Cu2+和Zn2+脅迫下潤草1號葉片細胞膜透性的變化

植物細胞膜系統(tǒng)是植物細胞和外界環(huán)境相隔離的屏障，也行使著細胞與外界環(huán)境傳遞信息和交換物質的功能，并且細胞膜的穩(wěn)定性是維持細胞內外平衡和正常生理功能的基礎[8]。重金屬脅迫可以破壞細胞膜的穩(wěn)定性，導致細胞膜透性增加。細胞膜透性的變化會導致細胞膜上結合酶和細胞內酶的失調，使細胞內外平衡性喪失，造成一系列生理生化過程紊亂，甚至出現(xiàn)植株死亡[9]。試驗里在Cu2+和Zn2+脅迫處理下，潤草1號葉片組織外滲液的相對電導率隨Cu2+和Zn2+濃度的增加而升高，呈現(xiàn)出明顯的相關性。其原因可能是Cu2+和Zn2+進入潤草1號葉片后，與細胞膜蛋白的巰基或磷脂分子層的磷脂類物質反應，造成膜蛋白的磷脂結構改變。而磷脂結構的改變會導致細胞膜結構改變，使得細胞膜透性增大，導致細胞內容物外滲，從而引起相對電導率的變化[3，10]。

2.4 Cu2+和Zn2+脅迫對潤草1號根系活力的影響

對于草坪植物來說，發(fā)達的根系對于植物抵御外力侵蝕和雨水沖刷、保持水土具有重要的作用。而土壤中的重金屬污染最主要的影響就是危害植物根系，可能導致根系活力降低和主動吸收能力下降[11]；4種不同濃度的Cu2+和Zn2+溶液脅迫對潤草1號根系活力的影響情況見圖4。從圖4可見，在低濃度的Cu2+和Zn2+處理下，潤草1號根系活力均有升高。在Cu2+和Zn2+處理濃度為5 mg/kg時，根系活力最高，分別比對照提高了70.3%和24.1%，與對照的差異明顯。當Zn2+濃度≥50 mg/kg、Cu2+濃度≥20 mg/kg時，潤草1號根系活力開始下降。在Zn2+、Cu2+處理濃度為100 mg/kg時，根系活力最低，分別為對照的52.7%和26.5%，與對照差異明顯。由圖4還可見，低濃度的Cu2+和Zn2+（<20 mg/kg）能夠提高潤草1號根系活力，這表明低濃度的Cu2+和Zn2+對潤草1號根系的生長及生理具有一定的促進效果；但當Cu2+和Zn2+的處理濃度為20 mg/kg后，潤草1號的根系活力則呈下降趨勢，濃度越高，根系活力越低。究其原因可能是高濃度的Cu2+和Zn2+脅迫后，產生的自由基超過潤草1號自身抗氧化系統(tǒng)酶的清除能力，多余的自由基會對潤草1號根系代謝中的琥珀酸脫氫酶等造成傷害，從而使根系活力下降[11]。

3 小結與討論

試驗結果表明，Cu2+和Zn2+脅迫處理對潤草1號初期生長的影響并不完全一致。高濃度的Cu2+對葉綠素含量、脯氨酸含量、細胞膜透性及根系活力抑制作用明顯，并且這種抑制作用均隨著Cu2+脅迫濃度的增加而增強，對根系生長的抑制尤其明顯。Zn2+脅迫處理對葉綠素含量、脯氨酸含量、細胞膜透性及根系活力的影響與Cu2+有相似之處。但是Zn2+脅迫的抑制程度要明顯小于Cu2+處理。

葉綠素含量的多少在一定程度上反映了植物光合作用的強弱，也直接影響著草坪植物的綠度。試驗中2種重金屬Cu2+和Zn2+對潤草1號葉片中葉綠素的影響表現(xiàn)出相類似的規(guī)律，當處理濃度低于20 mg/kg時，Cu2+和Zn2+對葉綠素合成具有促進作用，葉片中的葉綠素含量比對照有所增加；當處理濃度等于20 mg/kg時，Cu2+和Zn2+對葉綠素合成具有抑制作用，葉片中的葉綠素含量隨處理濃度的增加而減少。個中原因可能是高濃度的Cu2+和Zn2+會抑制潤草1號合成葉綠素途徑的關鍵酶活性，影響葉綠素的合成，導致了葉片中葉綠素含量的下降[12]。

草坪植物綠度與根系生長是衡量草坪植株是否具有實際應用價值的最為重要的指標之一，而高濃度的Cu2+和Zn2+對“根系生長的抑制作用尤為明顯。因此，在實際使用中，建議草坪土壤中的Cu2+含量應控制在10 mg/kg以下，Zn2+含量可以控制在20 mg/kg以下，以利于潤草1號植株的正常生長。

參考文獻：

[1] CHANDER K，DYCHMANS J，JOERGENSEN R G，et al. Different sources of heavy metals and their long-term effects on soil microbial properties[J].Biology and Fertility of Soils，2001，34（4）：241-247.

[2] CHEN S H，ZHOU Q X，SUN T H，et al. Rapid ecotoxicological assessment of heavy metal combined polluted soil using canonical analysis[J]. Journal of Environmental Sciences，2003，15（6）：854-858.

[3] 劉俊祥，孫振元，韓 蕾，等.草坪草對重金屬脅迫響應的研究現(xiàn)狀[J].中國農學通報，2009，25（13）：142-145

[4] 陳樹國，李瑞華，楊秋生.觀賞園藝學[M].北京：中國農業(yè)科技出版社，1991.206-224.

[5] 鄒 琦.植物生理學實驗指導[M].北京：中國農業(yè)大學出版社，2000.

[6] 楊居榮，賀建新，蔣婉茹.鎘污染對植物生理生化的影響[J].農業(yè)環(huán)境保護，1995，14（5）：193-197.

[7] 紀淑梅. 草坪草耐鹽性研究II. 鹽脅迫對草坪草脯氨酸含量的影響[J].草業(yè)科學.1999，16（12）：54-59.

[8] 楊世勇，王 方，謝建春.重金屬對植物的毒害及植物的耐性機制[J].安徽師范大學學報（自然科學版），2004，27（1）：71-74，90.

[9] 劉萬玲.重金屬污染及其對植物生長發(fā)育的影響[J].安徽農業(yè)科學，2006，34（16）：4026-4027.

[10] 王 新，周啟星，陳 濤.污泥土地利用對草坪草及土壤的影響[J].環(huán)境科學，2003，24（2）：50-53.

[11] 努扎艾提·艾比布，劉云國，宋華曉，等.重金屬Zn、Cu對香根草生理生化指標的影響及其積累特性研究[J].農業(yè)環(huán)境科學學報，2010，29（1）：54-59.

[12] 多立安，高玉葆，趙樹蘭.早熟禾對4種重金屬脅迫生長響應特征[J].西北植物學報，2006，26（1）：183-187.