清腸溫中方對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠干擾素γ誘導(dǎo)蛋白10的影響＊

毛堂友，史 瑞，謝添弘，郭 一，陳 晨，石 磊，賈博宜，劉佳麗，譚 祥，韓亞飛，丁龐華，李軍祥

（北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院脾胃肝膽科 北京 100078）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種病因尚不十分清楚的結(jié)腸和直腸的慢性非特異性炎癥性疾病[1,2]，好發(fā)于年輕人，其腹痛、腹瀉、黏液膿血便的臨床主癥嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病之一[3]。本課題組前期研究[4]發(fā)現(xiàn)，清腸溫中方能夠明顯改善潰瘍性結(jié)腸炎患者的臨床癥狀，抑制炎癥反應(yīng)，修復(fù)腸粘膜損傷，總有效率為93.48%。但具體的作用機制尚不清楚。研究[5]顯示，干擾素γ誘導(dǎo)蛋白10（Interferon gamma inducible protein 10，IP10）介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，是導(dǎo)致潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病的主要機制之一。因此，本研究將從IP10及IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、INF-γ等炎癥因子入手，探討清腸溫中方治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SD大鼠，雄性，SPF級，體重（200±20）g，購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司（許可證號：SCXK（京）2011-0004），常規(guī)飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所SPF級動物房，12小時光照/黑夜循環(huán)，溫度（20-24）℃，濕度50-60%；自由飲食飲水飼養(yǎng)。

1.2 藥物

清腸溫中方的方藥組成：黃連，炮姜，苦參，三七，青黛，煨木香，地榆炭，炙甘草，劑型為配方顆粒，由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院配方顆粒藥房統(tǒng)一購自于北京康仁堂藥業(yè)有限公司，保證所用藥品為同一批次，并進(jìn)行鑒定質(zhì)控。按實驗動物與人體體表面積比等效量核算比率，計算動物的等效劑量。實驗時以燒開的去離子水配制成所需濃度，放冰箱保存，每天配藥一次。美沙拉嗪腸溶片（mesalazine，商品名：莎爾福）購自德國Losan Pharma GmbH公司。

1.3 試劑與儀器

葡聚糖硫酸鈉（MW36-50KDa；MP Biomedical，Burlingame，CA，USA），便潛血試紙（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）；大鼠IL-1α酶聯(lián)免疫試劑盒（Multiscience，EK301A2/2），大鼠IL-1β酶聯(lián)免疫試劑盒（Multiscience，EK301B2/2），大鼠IL-6酶聯(lián)免疫試劑盒（Multiscience，EK3062/2），大鼠TNF-α酶聯(lián)免疫試劑盒（Multiscience，EK3821/2），大鼠INF-γ酶聯(lián)免疫試劑盒（Multiscience，EK3802/2），IP10抗體（abcam，Ab7206），Beta actin抗體（中杉金橋，TA-09）PV9000超敏二步法免疫組化檢測試劑購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。UCT型超薄切片機（德國萊卡公司），顯微鏡（尼康顯微鏡ECLIPSE LV100POL/50IPOL，日本），全自動多功能酶標(biāo)儀（MULTISKAN MK3，美國），電熱恒溫培養(yǎng)箱（DH4000A，天津）等。

1.4 分組、造模及標(biāo)本采集

本課題組的動物模型建立方法如前期研究[6]，繼續(xù)采用自由飲用4.5%DSS溶液制備潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型，將70只健康SPF級雄性SD大鼠（體重200±20 g）適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，以4.5%DSS(MW：36 000-50 000，MP Biomedical)溶液自由飲水7天，普通飼料喂養(yǎng)，晝/夜12/12 h交替，溫度25℃，濕度60%。同時運用隨機數(shù)字表法將大鼠隨機均等分為6組：正常組，模型組，清腸溫中方低劑量組（0.3 g/kg/day），清腸溫中方中劑量組（0.6 g/kg/day），清腸溫中方高劑量組（1.2 g/kg/day），美沙拉嗪組（0.03 g/kg/day）。造模的同時各組均以相應(yīng)藥物灌胃治療7天。每日稱取大鼠體重，檢測便潛血，確保造模7天中大鼠均維持便血狀態(tài)，造模結(jié)束后查看大鼠結(jié)腸病理，結(jié)腸黏膜病變不超過黏膜下層，炎癥細(xì)胞侵潤明顯，使得模型維持在炎癥階段，避免異型增生的干預(yù)。各組大鼠，末次給藥后，禁食不禁水，24 h后取材，分離遠(yuǎn)端結(jié)腸10 cm，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 ELSIA法檢測結(jié)腸組織炎癥因子（IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、INF-γ）的表達(dá)

將凍存的結(jié)腸解凍后，在研缽里用眼科剪切成小片，并轉(zhuǎn)入勻漿器中加入3倍生理鹽水充分勻漿，1000r，4℃離心10 min，取上清液用于檢測。

1.6 免疫組化檢測結(jié)腸IP10的表達(dá)

4 μm厚的石蠟切片經(jīng)過脫蠟、復(fù)水、高壓修復(fù)、封閉后，按照試劑盒說明進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色（IP10抗體濃度1：5 000，Beta actin抗體濃度1：1 000），以PBS為陰性對照，200倍鏡視野下采集圖片，應(yīng)用image pro plus 6.0軟件分析圖像，計算光密度(IOD)和染色區(qū)域總面積（area），其中以IOD表示目的蛋白表達(dá)量，以area表示目的蛋白分布及表達(dá)總面積，最后用平均光密度（IOD/area的比值）來進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

所有的數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件（IBM Corp，Armonk，NY，USA）分析，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (±s)表示。符合正態(tài)分布且方差齊進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），不符合正態(tài)分布或方差不齊進(jìn)行非參數(shù)檢驗，均為組間比較，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸IL-1α、IL-1β

與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸IL-1α、IL-1β的表達(dá)水平顯著增高（P＜0.01）；與模型組比較，清腸溫中方中劑量組、高劑量組和美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸的IL-1α、IL-1β表達(dá)水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），清腸溫中方低劑量組大鼠結(jié)腸IL-1β表達(dá)水平較模型組降低（P＜0.05），清腸溫中方低劑量組大鼠結(jié)腸IL-1α表達(dá)水平較模型組降低，但無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

2.2 結(jié)腸IL-6、TNF-α

與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸IL-6、TNF-α的表達(dá)水平顯著增高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，清腸溫中方中劑量組、高劑量組和美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸的IL-6表達(dá)水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），清腸溫中方低劑量組大鼠結(jié)腸IL-6表達(dá)水平較模型組降低（P＜0.01），清腸溫中方低劑量組大鼠結(jié)腸TNF-α表達(dá)水平較模型組降低，但無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

2.3 結(jié)腸INF-γ

與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸IFN-γ的表達(dá)水平顯著增高（P＜0.01）；與模型組比較，清腸溫中方中劑量組、高劑量組和美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸的IFN-γ表達(dá)水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），清腸溫中方低劑量組大鼠結(jié)腸IFN-γ表達(dá)水平較模型組降低，但無統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。

2.4 結(jié)腸IP10

正常組大鼠結(jié)腸組織中的IP10陽性表達(dá)很少，模型組中IP10陽性表達(dá)區(qū)域主要在腸黏膜層、黏膜肌層、肌層、漿膜層等，經(jīng)過治療后，各治療組較模型組的表達(dá)相對較少，其組織切片陽性表達(dá)染色主要為深棕黃色或褐色，見圖1。與正常組相比，模型組IP10的平均光密度明顯升高（P＜0.01）；而經(jīng)過干預(yù)后，清腸溫中方各劑量組和美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸的IP10平均光密度較模型組顯著降低（P＜0.01，P＜0.05），見表4。

表1 清腸溫中方對DSS誘導(dǎo)的UC大鼠結(jié)腸IL-1α、IL-1β的影響(±s)

表1 清腸溫中方對DSS誘導(dǎo)的UC大鼠結(jié)腸IL-1α、IL-1β的影響(±s)

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

表2 清腸溫中方對DSS誘導(dǎo)的UC大鼠結(jié)腸IL-6、TNF-α的影響 (±s)

表2 清腸溫中方對DSS誘導(dǎo)的UC大鼠結(jié)腸IL-6、TNF-α的影響 (±s)

注：與正常組比較,#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

表3 清腸溫中方對DSS誘導(dǎo)的UC大鼠結(jié)腸IFN-γ的影響 (±s)

表3 清腸溫中方對DSS誘導(dǎo)的UC大鼠結(jié)腸IFN-γ的影響 (±s)

注：與正常組比較,##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

表4 清腸溫中方對DSS誘導(dǎo)的UC大鼠結(jié)腸IP10的影響 (±s)

表4 清腸溫中方對DSS誘導(dǎo)的UC大鼠結(jié)腸IP10的影響 (±s)

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

圖1 清腸溫中方對UC大鼠結(jié)腸IP10蛋白的影響（IHC，×200）

3 討論

目前，UC的發(fā)病機制仍未完全闡明，目前大多學(xué)者認(rèn)為持續(xù)腸道感染、腸黏膜屏障缺損、腸黏膜免疫調(diào)節(jié)異常、遺傳和環(huán)境等因素共同參與了疾病發(fā)生過程[7]。其中，持續(xù)的腸道感染是導(dǎo)致UC發(fā)病的關(guān)鍵因素。

干擾素γ誘導(dǎo)蛋白10在UC的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。IP10屬于ELR陰性的CXC亞家族的內(nèi)生趨化因子，在IFN-γ誘導(dǎo)下由多種細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等分泌[8]，也可以在脂多糖、前炎癥因子如IFN-α/β及TNF-α等刺激下分泌[9]。CXCR3是IP10唯一的受體，IP10與CXCR3特異性結(jié)合后，能夠促進(jìn)CXCR3+細(xì)胞的趨化活性[10]，從而觸發(fā)多步驟的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使CXCR3陽性靶細(xì)胞T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、NK細(xì)胞等向局部炎癥病灶趨化。其中，被募集的T細(xì)胞在活化后主要分泌IL-2、TNF-β、IFN-γ；巨噬細(xì)胞主要分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18、IL-12、IL-23、IFN-γ等炎性因子[11]；而局部分泌增加的TN F-α、IFN-γ等炎癥因子一方面刺激產(chǎn)生更多IP10，進(jìn)一步募集更多的免疫細(xì)胞，形成惡性循環(huán)；另一方面可直接或間接損傷腸黏膜屏障，從而損傷腸黏膜[12]，促進(jìn)潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展。

本次實驗中，模型組大鼠結(jié)腸IP10的表達(dá)水平較正常組大鼠顯著增高，這與這與既往實驗結(jié)果相一致[13，14]，同時，結(jié)腸組織的炎癥因子（IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、INF-γ）也呈現(xiàn)高表達(dá)，表明DSS能夠誘結(jié)腸IP10的表達(dá)，促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生，從而加強炎癥反應(yīng)，加重腸黏膜的損傷；而經(jīng)過干預(yù)后，清腸溫中方各劑量組的IP10及炎癥因子（IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、INF-γ）的表達(dá)水平均下降，說明清腸溫中方能夠通過抑制IP10的表達(dá)，下調(diào)結(jié)腸炎癥因子（IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、INF-γ）的水平，從而抑制腸道抑制炎癥。

本次研究通過動物實驗探討了IP10對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的調(diào)控機制，對清腸溫中方治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機制做了初步研究，進(jìn)一步深化了潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機制的認(rèn)識，為臨床運用清腸溫中方治療潰瘍性結(jié)腸炎提供了良好的實驗依據(jù)，但深入的作用機制有待于進(jìn)一步研究。

1 Moon W.Golimumab Therapy in Ulcerative Colitis.Korean J Gastroenterol.2016.67(2):64-73.

2 Hao Y,Nagase K,Hori K,et al.Xilei San ameliorates experimental colitis in rats by selectively degrading pro-inflammatory mediators and promoting mucosal repair.Evid Based Complement Alternat Med.2014,2014(2014):569587.

3 Sclano G,Asthma.nasal polyposis and ulcerative colitis:a new perspective.Clin Exp Allergy.2002,32:1144-1149.

4 毛堂友,程佳偉,魏仕兵,等.清腸溫中方治療潰瘍性結(jié)腸炎84例.環(huán)球中醫(yī)藥,2016,9(4):479-481．

5 Lloyd M,William J S,Yuriy S,et al.Anti-IP-10 antibody(BMS-936557)for ulcerativecolitis:a phase II randomised study.Gut.2014,63(3):442-50.

6 Mao T Y,Shi R,Zhao W H,et al.Decoction Ameliorates Dextran Sulphate Sodium-Induced Ulcerative Colitis in Rats by Downregulating the IP10/CXCR3 Axis-Mediated Inflammatory Response.Evid Based Complement Alternat Med,2016,2016(3):1-10.

7 劉占舉.炎癥性腸病發(fā)病機制新進(jìn)展.內(nèi)科理論與實踐,2013,8(1):5-8.

8 Badige R,Mitchell J A,Gashaw H,et al.Effect of Different Interferonα 2 Preparations on IP10 and ET-1 Release from Human Lung Cells.PLoS One,2012,7(10):e46779.

9 Takano S,Ishikawa E,Matsuda M,et al.Interferon-β inhibits glioma angiogenesis through downregulation of vascular endothelial growth factor and upregulation of interferon inducible protein 10.Int J Oncol,2014,45(5):1837-1846.

10 Liu M L,Guo S C,Jacqueline M,et al.CXCL10/IP-10 in Infectious Diseases Pathogenesis and Potential Therapeutic Implications.Cytokine Growth Factor Rev.2011,22(3):121-130.

11 Xu J M,Shi G P.Emerging Role of Mast Cells and Macrophages in Cardiovascular and Metabolic Diseases.Endocr,2012,33(1):71-108.

12 Ostvik A E,Granlund A V,Bugge M,et al.Enhanced expression of CXCL10 in inflammatory bowel disease:potential role of mucosal Tolllike receptor 3 stimulation.Inflamm Bowel Dis,2013,19(2):265-74.

13 Lloyd M,William J S,Yuriy S,et al.Anti-IP-10 antibody(BMS-936557)for ulcerativecolitis:a phase II randomised study.Gut.2014,63(3):442-50.

14 Singh,U,P.Singh,S,Singh,R,et al.CXCL10-producing mucosal CD4+T cells,NK cells,and NKT cells are associated with chronic colitis in IL-10mice,which can be abrogated by anti-CXCL10 antibody inhibition.J Interferon Cytokine Res.2008,28(1):31-43.