高溫對(duì)體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞的影響及細(xì)胞凋亡機(jī)制研究

徐明++張明++張興國++李俠++白金++尚磊

[摘 要] 目的：研究不同溫度對(duì)體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞的影響及其機(jī)制。方法：取出生1～3天的SD幼鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞體外培養(yǎng)，分為37℃和42℃2組，分別孵育12h和24h。利用CCK8、TUNEL分析、Western blot等技術(shù)，觀察12h和24h時(shí)海馬神經(jīng)細(xì)胞存活率及凋亡細(xì)胞數(shù)，以及Bcl-2、Bax和cleaved-caspase3蛋白表達(dá)。結(jié)果：與37℃組相比、42℃組海馬神經(jīng)元細(xì)胞存活率下降，凋亡陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，并隨著時(shí)間延長凋亡陽性細(xì)胞數(shù)增多。42℃組中，神經(jīng)元細(xì)胞Bcl-2表達(dá)減弱，Bax、cleaved-caspase3表達(dá)增強(qiáng)，上述指標(biāo)與37℃組同時(shí)點(diǎn)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：高溫可以誘導(dǎo)體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡， 可能通過PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

[關(guān)鍵詞] 高溫；細(xì)胞凋亡；Bcl-2；Bax；caspase3

中圖分類號(hào)：R741.02 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2095-5200（2017）01-082-03

DOI：10.11876/mimt201701033

高溫是一種常見職業(yè)病危害因素。文獻(xiàn)報(bào)道長期處于高溫環(huán)境可引起人記憶力及認(rèn)知能力下降[1]。海馬作為大腦邊緣葉的重要組成部分，與認(rèn)知功能有密切關(guān)系，是影響學(xué)習(xí)和記憶功能的重要腦區(qū)[2]。本實(shí)驗(yàn)建立高溫致體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡模型，用免疫印跡法對(duì)海馬神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡相關(guān)基因 Bcl-2、Bax和活化的caspase3蛋白表達(dá)進(jìn)行半定量觀察，探討高溫對(duì)海馬神經(jīng)元細(xì)胞影響及細(xì)胞凋亡發(fā)生機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

10只SPF級(jí)健康SD乳鼠，出生1～3天，雌雄不限（山東大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）。

1.2 儀器和試劑

二氧化碳培養(yǎng)箱、恒溫水浴加熱器、mini-PROTEAN電泳裝置、DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清（購自杭州四季青公司），CCK8試劑盒（碧云天），TUNEL試劑盒（羅氏），DAB顯色試劑盒（碧云天），兔Bcl-2一抗、兔Bax一抗、兔cleaved-caspase3一抗（武漢三鷹）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞分組和處理 海馬神經(jīng)細(xì)胞的原代培養(yǎng)采用文獻(xiàn)[3]方法。分為2組，每組3個(gè)樣本，于接種后 6d將盛有細(xì)胞懸液的離心管分別置于37℃、42℃恒溫水浴箱，2組分別在處理 12h、24h兩個(gè)時(shí)點(diǎn)測定各項(xiàng)指標(biāo)，測定重復(fù)3次，取平均值。

1.3.2 CCK8檢測細(xì)胞存活率 在96孔板中接種細(xì)胞懸液，按上述方法分組培養(yǎng)后，向每孔加入10μL CCK8溶液，用酶標(biāo)儀測定在450nm處的吸光度。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.3.3 TUNEL檢測細(xì)胞凋亡 將細(xì)胞接種于含有蓋玻片的6孔板內(nèi)，使細(xì)胞爬片。按照上述方法分組培養(yǎng)后，進(jìn)行固定、洗滌、加反應(yīng)液、孵育等處理，加入DAB顯色液，室溫孵育3min鏡下觀察。單盲法手工計(jì)數(shù)20個(gè)不同視野（200倍顯微鏡）下TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值，計(jì)算凋亡細(xì)胞百分率。

1.3.4 Western blot檢測Bcl-2、Bax、cleaved-caspase3蛋白表達(dá) 分組處理后，將50μg變性蛋白進(jìn)行10%SDS -PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜上。室溫封閉1h，分別加相應(yīng)一抗及GAPDH內(nèi)參，4℃搖床孵育過夜。第2天二抗室溫孵育1h， ECL反應(yīng)，經(jīng)LAS-4000mini型發(fā)光成像分析儀曝光顯影。用 quantity one 分析軟件對(duì)各組條帶進(jìn)行分析，將各組的整合灰度比例與內(nèi)參（ GAPDH） 比較，并以 GAPDH的 ID 為 100% ，得到相對(duì)百分?jǐn)?shù)（ 即 ID/內(nèi)參 ID ×100%） 。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)均以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差（ mean ± SD） 表示，所得數(shù)據(jù)均采用 SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。2組之間均數(shù)的比較采用單因素方差分析及 Bonferroni 法，以P< 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同溫度對(duì)海馬神經(jīng)細(xì)胞存活率的影響

37℃組12h/24h海馬神經(jīng)細(xì)胞平均存活率為99.43%、71.33%，42℃組12h/24h海馬神經(jīng)細(xì)胞平均存活率為93.28%、60.88%，42℃組低于同時(shí)點(diǎn)37℃組細(xì)胞存活率，12h2組間比較P=0.002，24h2組間比較P=0.005，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 不同溫度對(duì)海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率影響及細(xì)胞形態(tài)改變

37℃組12h/24h海馬神經(jīng)細(xì)胞平均凋亡率為1.23%、5.67%，42℃組12h/24h海馬神經(jīng)細(xì)胞平均凋亡率為51.67%、68.36%，42℃組高于同時(shí)點(diǎn)37℃組細(xì)胞凋亡率，12h2組間比較P=0.0022，24h2組間比較P=0.034，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。凋亡細(xì)胞鏡下可見染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)凝聚、分塊，胞質(zhì)皺縮，核呈圓形或新月形，有的核外周深染而中央淡染（如圖1）。

2.3 不同溫度對(duì)海馬神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2、Bax、cleaved-caspase 3蛋白表達(dá)影響

42℃組12h/24h海馬神經(jīng)細(xì)胞Bax表達(dá)較37℃同時(shí)間點(diǎn)明顯增加，12h2組間比較分別是P=0.0395<0.05，24h2組間比較分別是P=0.021<0.05（見圖2A）。42℃組Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，12h2組間比較P=0.0086<0.01，24h2組間比較P=0.003<0.01，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖2B）。42℃組12h/24h海馬神經(jīng)細(xì)胞cleaved-caspase3蛋白表達(dá)較37℃同時(shí)間點(diǎn)明顯增加，12h2組間比較分別是P=0.0239<0.05，24h2組間比較分別是P=0.0088<0.01（見圖2C）。

3 討論

在一定條件下，高溫對(duì)人體的損害是不可逆轉(zhuǎn)的，而這些不可逆的損害有可能是通過細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的[4]。細(xì)胞凋亡又稱為程序化細(xì)胞死亡，是細(xì)胞生物有機(jī)體為調(diào)控機(jī)體發(fā)育，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞主動(dòng)性死亡過程[5]。高溫誘發(fā)細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制，一方面是直接影響細(xì)胞結(jié)構(gòu)，另一方面與某些基因異常表達(dá)有關(guān)。

高溫誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞損傷程度與熱的程度相關(guān)，極度高溫（49℃～50℃以上）可導(dǎo)致細(xì)胞在5min內(nèi)以壞死方式死亡，而當(dāng)環(huán)境溫度在 41.6℃～42℃時(shí)，細(xì)胞死亡方式以凋亡為主[6]。本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞形態(tài)和相關(guān)蛋白變化，觀察溫度對(duì)海馬神經(jīng)細(xì)胞的影響。光鏡下可見高溫改變了神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，其中細(xì)胞核的改變最具特征性。CCK8、TUNEL結(jié)果表明，高溫可降低神經(jīng)細(xì)胞存活率，加快凋亡，且溫度越高細(xì)胞存活率越低，凋亡率越高。隨著時(shí)間延長，細(xì)胞存活率明顯下降，細(xì)胞凋亡數(shù)增多。陳光忠等[7]研究顯示，高溫處理的大鼠海馬錐體細(xì)胞，凋亡率增加，且溫度越高、時(shí)間越長凋亡率越高，結(jié)論與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。近年研究顯示PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在細(xì)胞的存活、增殖、凋亡以及細(xì)胞骨架變化等[8]活動(dòng)中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能，其機(jī)制可能包括：①調(diào)節(jié)Bcl-2家族成員的活性；②抑制caspase家族導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡；③活化的Akt抑制GSK-3活性，加速凋亡；④活化的Akt抑制線粒體釋放如細(xì)胞色素C、AIF等凋亡相關(guān)因子，抑制凋亡；⑤活化轉(zhuǎn)錄因子NF-κB促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡等。

Bcl-2蛋白家族有抑制細(xì)胞凋亡基因（Bcl-2，Bcl-xl等），有促進(jìn)細(xì)胞凋亡基因（Bax，Bad等）[9-10]。凋亡的各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有一個(gè)共同的通路或交匯點(diǎn)，而該通路或交匯點(diǎn)受Bcl-2調(diào)節(jié)。Bcl-2通過干擾細(xì)胞色素C自線粒體的釋放，阻斷caspase蛋白酶連鎖反應(yīng)的激活，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡[11]。

Caspase家族是細(xì)胞凋亡下游關(guān)鍵酶，caspase3是該家族中細(xì)胞凋亡的主要效應(yīng)因子， 與其他的caspases以級(jí)聯(lián)反應(yīng)方式， 主要作用在細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段，是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶[12-13]。本研究采用Western blot檢測蛋白Bax、Bcl-2及cleaved-caspase3的表達(dá)情況，結(jié)果顯示高溫能干擾這些蛋白的表達(dá)，隨著溫度升高，Bax、cleaved-caspase3表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)降低，隨著時(shí)間延長變化更為明顯。表明Bcl-2有保護(hù)細(xì)胞免受凋亡的作用。Strasser等[14]報(bào)道，Bc1-2基因表達(dá)可以使熱誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡下降，并促使細(xì)胞繼續(xù)增殖，形成熱耐受。崔寶林[15]等報(bào)道，熱療可顯著抑制 Bcl-2通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。隨著加熱時(shí)間延長cleaved-caspase3活性變化與細(xì)胞凋亡趨勢一致，說明caspase3參與了高溫誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡；Lecchi C等[16]發(fā)現(xiàn)，隨著溫度升高，活化后的caspase3表達(dá)逐漸增強(qiáng)，其表達(dá)趨勢與神經(jīng)元細(xì)胞凋亡一致。朱曄晶等[17]報(bào)道，熱處理人ECV304 后，caspase3隨著時(shí)間的增加其活性變化與細(xì)胞凋亡趨勢一致，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論相符。

綜上所述，高溫可誘導(dǎo)海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡，隨著溫度的升高及時(shí)間的延長，細(xì)胞凋亡數(shù)增加。Bcl-2、Bax、caspase 3蛋白是PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中調(diào)節(jié)蛋白，可能是通過PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，Akt是該傳導(dǎo)通路的下游靶激酶，可進(jìn)一步觀察Akt等相關(guān)蛋白明確其在海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷中的作用。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] TANG Y M， WANG D G， LI J， et al. Relationships between micronutrient losses in sweat and blood pressure among heat-exposed steelworkers[J]. Industrial Health， 2016， 54（3）： 215-223.

[2] RANGANATH C， HSIEH LT. The hippocampus： a special place for time[J]. Ann N Y Acad Sci， 2016， 1369（1）： 93-110.

[3] WU JB， SONG NN， WEI XB， et al. Protective effects of paeonol on cultured rat hippocampal neurons against oxygen-glucose deprivation-induced injury[J]. J Neurol Sci， 2008， 264（1-2）： 50-55.

[4] MAHANTY A， PUROHIT GK， BANERJEE S， et al. Proteomic changes in the liver of Channa striatus in response to high temperature stress[J]. Electrophoresis， 2016， 37（12）： 1704-1717.

[5] RAZAVI S， SADEGHI A， HAMI J， et al. The effect of diabetes mellitus on apoptosis in hippocampus： Cellular and molecular aspects[J].Int J Prev Med. 2016， 7（1）： 57.

[6] 張水文.熱射病時(shí)中樞神經(jīng)系統(tǒng)變化研究進(jìn)展[J].解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2000，18（4）：307-309.

[7] 陳光忠，羅炳德，王紅芹，等.高溫對(duì)體外培養(yǎng)大鼠海馬錐體細(xì)胞凋亡的影響[J].第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，23（3）：233-235.

[8] CHOI JS， PARK HJ， KIM HY， et al. Phosphorylation of PTEN and Akt in astrocytes of the rat hippocampus following transient forebrain ischemia[J]. Cell Tissue Res， 2005， 319（3）： 359-366.

[9] KIRAZ Y， ADAN A， KARTAL YANDIM M， et al. Major apoptotic mechanisms and genes involved in apoptosis[J]. Tumour Biol， 2016， 37（7）： 8471-8486.

[10] HATOK J， RACAY P. Bcl-2 family proteins： master regulators of cell survival[J]. Biomol Concepts， 2016， 7（4）： 259-270.

[11] 田霞， 方向明， 韓崢. 大腸癌中Survivin表達(dá)及其與bcl-2和P53基因表達(dá)的關(guān)系[J]. 武漢大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）， 2005， 26（4）： 443-445.

[12] JURAVER-GESLIN HA， DURAND BC. Early development of the neural plate： new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3[J]. Genesis， 2015， 53（2）： 203-224.

[13] SAVITSKAYA MA， ONISHCHENKO GE. Mechanisms of Apoptosis[J]. Biochemistry Mosc， 2015， 80（11）： 1393-1405.

[14] STRASSER A， ANDERSON RL. Bcl-2 and thermotolerance cooperate in cell survival[J]. Cell Growth Differ， 1995， 6（7）： 799-805.

[15] 崔寶林，寧曉娥.不同溫度熱療聯(lián)合多西紫杉醇對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株增殖的影響[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2015，12（23）：3522-3524

[16] LECCHI C， ROTA N， VITALI A， et al. In vitro assessment of the effects of temperature on phagocytosis， reactive oxygen species production and apoptosis in bovine polymorphonuclear cells[J]. Vet Immunol Immunopathol， 2016， 182： 89-94.

[17] 朱曄晶， 彭寧，凌杰，等.高溫誘導(dǎo)人ECV304的凋亡及其信號(hào)傳導(dǎo)通路[J].現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué)，2016，28（1）：26-28.