改進(jìn)HPLC法同時(shí)測(cè)定注射用替卡西林鈉克拉維酸鉀中兩種主成分的含量

王茉莉，張 菁，張少萌，張?zhí)m桐（.河北省藥品檢驗(yàn)研究院，石家莊 0500；2.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，石家莊 05007）

改進(jìn)HPLC法同時(shí)測(cè)定注射用替卡西林鈉克拉維酸鉀中兩種主成分的含量

王茉莉1，2＊，張 菁1，張少萌1，張?zhí)m桐2#（1.河北省藥品檢驗(yàn)研究院，石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，石家莊 050017）

目的：改進(jìn)測(cè)定注射用替卡西林鈉克拉維酸鉀中兩種主成分含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Waters XBridgeTMC18，流動(dòng)相為0.01 mol/L磷酸氫二銨溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH至7.0）-甲醇（80∶20，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長為220 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20μL。結(jié)果：替卡西林和克拉維酸的檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為1.95～195.22、0.12～12.18 μg/mL（r＝0.999 9）；精密度、穩(wěn)定性（4℃下放置）、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜1.0%；替卡西林和克拉維酸的加樣回收率分別為99.3%～100.5%、99.2%～101.0%，RSD分別為0.4%、0.7%（n＝9）。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確可靠，可用于注射用替卡西林鈉克拉維酸鉀中兩種主成分含量的同時(shí)測(cè)定。

高效液相色譜法；替卡西林；克拉維酸；注射用替卡西林鈉克拉維酸鉀；含量測(cè)定

注射用替卡西林鈉克拉維酸鉀為復(fù)方制劑，替卡西林鈉與克拉維酸鉀之比為15∶1。該制劑是由葛蘭素史克公司最早研制成功（商品名：泰門汀），于1986年在美國首次上市。該制劑中的替卡西林是一種β-內(nèi)酰胺類抗生素，克拉維酸是一種不可逆性強(qiáng)力β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，后者能與β-內(nèi)酰胺酶結(jié)合，發(fā)揮競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，從而保護(hù)了前者不被酶水解滅活，得以充分發(fā)揮其抗菌活性。該制劑具有廣譜抗菌作用，適合于治療各種類型的細(xì)菌感染性疾病。為了有效控制注射用替卡西林鈉克拉維酸鉀的質(zhì)量，筆者前期參考相關(guān)國內(nèi)文獻(xiàn)[1-8]及2011年版《英國藥典》[9]、《歐洲藥典》（7.0版）[10]中替卡西林鈉的測(cè)定方法，優(yōu)化色譜系統(tǒng)，建立了以高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定該制劑中有關(guān)物質(zhì)的方法[11]；本研究中筆者進(jìn)一步改進(jìn)了以HPLC法同時(shí)測(cè)定該制劑中兩種主成分含量的方法。

1 材料

1.1 儀器

戴安UltiMate3000型HPLC儀，包括紫外檢測(cè)器和二極管陣列檢測(cè)器（美國Thermo公司）；XS205型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 藥品及試劑

替卡西林、克拉維酸對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：130569-200902、130429-201307，純度分別為84.0%、95.0%）；注射用替卡西林鈉克拉維酸鉀（A廠，批號(hào)：110401、110501，規(guī)格：含替卡西林1.5 g和克拉維酸0.1 g、含替卡西林3.0 g和克拉維酸0.2 g；B廠，批號(hào)：20090301、20090601、20110402，規(guī)格：含替卡西林3.0 g和克拉維酸0.2 g；C廠，批號(hào)：1104001、1104002、1006002，規(guī)格：含替卡西林3.0 g和克拉維酸0.2 g；D廠，批號(hào)：110401、110402，規(guī)格：含替卡西林1.5 g和克拉維酸0.1 g）；甲醇為色譜純，磷酸氫二銨、磷酸為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters XBridgeTMC18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：0.01 mol/L磷酸氫二銨溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH至7.0）-甲醇（80∶20，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長：220 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取替卡西林對(duì)照品和克拉維酸對(duì)照品各適量，加水溶解并稀釋制成每1 mL中含替卡西林1.95 mg、克拉維酸0.12 mg的混合溶液，作為混合對(duì)照品貯備液。精密吸取混合對(duì)照品貯備液5 mL，置于100 mL量瓶中，加水定容，制成每1 mL中含替卡西林0.097 5 mg、克拉維酸0.006 mg的混合溶液，作為混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取“裝量差異”項(xiàng)下的本品內(nèi)容物適量，混合均勻，精密稱定，加水溶解并稀釋制成每1 mL中含替卡西林0.097 5 mg、克拉維酸0.006 mg的溶液，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 以溶劑水作為陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下3種溶液各適量，分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可見，在該色譜條件下，替卡西林兩異構(gòu)體峰之間的分離度符合要求，替卡西林、克拉維酸與相鄰雜質(zhì)峰之間的分離度均符合要求（均＞1.5），理論板數(shù)以替卡西林和克拉維酸峰計(jì)均不低于3 000，陰性對(duì)照對(duì)主成分測(cè)定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備液0.1、0.5、1、5、10 mL，分別置于100 mL量瓶中，加水稀釋并定容，制成替卡西林質(zhì)量濃度分別為1.95、9.76、19.52、97.61、195.22 μg/mL和克拉維酸質(zhì)量濃度分別為0.12、0.61、1.21、6.09、12.18 μg/mL的系列對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得替卡西林回歸方程為y＝15 139x+0.696（r＝0.999 9），克拉維酸回歸方程為y＝22.206x－1.197（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，替卡西林和克拉維酸的檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為1.95～195.22、0.12～12.18 μg/mL。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，替卡西林峰面積的RSD＝0.13%（n＝6），克拉維酸峰面積的RSD＝0.46%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液（批號(hào)：110401，A廠）適量，分為2份，一份在4℃冰箱中保存，一份在室溫（20℃）下放置，分別于0、1、2、4、8、12 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，在4℃冰箱中保存的供試品溶液在12 h內(nèi)替卡西林、克拉維酸峰面積的RSD分別為0.4%、0.6%（n＝6）；在室溫下放置的供試品溶液在2 h內(nèi)替卡西林、克拉維酸峰面積基本無變化，而在12 h內(nèi)替卡西林、克拉維酸峰面積的RSD分別為2.0%、1.8%（n＝6）?？梢?，供試品溶液室溫放置的穩(wěn)定性稍差，故建議測(cè)定時(shí)應(yīng)臨用新制并于配制后2 h內(nèi)進(jìn)樣測(cè)定，或?qū)PLC儀的樣品室溫度調(diào)至4℃進(jìn)行檢測(cè)。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批樣品（批號(hào)：110401，A廠）適量，共6份，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果，替卡西林平均含量為85.7%，RSD＝0.20%（n＝6），克拉維酸平均含量為5.4%，RSD＝0.58%（n＝6），表明本方法重復(fù)性較好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品（批號(hào)：110401，A廠，替卡西林含量為85.67%，克拉維酸含量為5.40%）約0.1 g，共9份，每份約相當(dāng)于含替卡西林90 mg、克拉維酸6 mg，每3份分別精密加入低、中、高不同質(zhì)量的替卡西林和克拉維酸對(duì)照品各適量，分別置于100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5.0 mL，置于50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.9 樣品含量測(cè)定

取10批樣品和對(duì)照品各適量，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液和對(duì)照品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，依外標(biāo)法以峰面積計(jì)算樣品中兩種主成分的含量，結(jié)果見表2。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，%）Tab 2 Determination results of samples（n＝3，%）

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

筆者曾嘗試磷酸鹽緩沖液-乙腈的色譜系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)替卡西林兩異構(gòu)體峰之間的分離效果不及磷酸鹽緩沖液-甲醇色譜系統(tǒng)。同時(shí)，替卡西林在堿性條件下易發(fā)生聚合，克拉維酸在堿性條件下穩(wěn)定性差，故將流動(dòng)相的pH控制在8.0以下；考慮到色譜柱的耐受性，本試驗(yàn)將其流動(dòng)相中緩沖液的pH值定為7.0。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在此色譜條件下，替卡西林和克拉維酸的色譜峰峰形對(duì)稱，替卡西林兩異構(gòu)體峰的分離效果良好，并可以使兩主成分在20 min之內(nèi)全部洗脫完畢，且系統(tǒng)適用性好，準(zhǔn)確度高。

3.2 檢測(cè)波長的選擇

利用二極管陣列檢測(cè)器在190～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，替卡西林兩異構(gòu)體的峰純度均＞980，說明主峰峰純度高，主峰與相鄰雜質(zhì)峰完全分離；并且，替卡西林與克拉維酸均在220 nm波長處有較強(qiáng)吸收，故最終確定檢測(cè)波長為220 nm。

3.3 含量測(cè)定結(jié)果的比較

通過本方法檢測(cè)出替卡西林為雙峰，分別為替卡西林的R、S異構(gòu)體，且分離度符合要求。采用外標(biāo)法以兩個(gè)異構(gòu)體峰面積之和來計(jì)算替卡西林的含量，測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4個(gè)廠家樣品的色譜圖中替卡西林的雙峰高低并不相同，也就是說替卡西林中的R、S異構(gòu)體比例各不相同。廠家A與D的色譜圖基本一致，替卡西林R與S比例為1∶1；廠家B與C的色譜圖基本一致，替卡西林R與S比例為85∶15。雖然4個(gè)廠家的樣品替卡西林含量接近，但是替卡西林R、S異構(gòu)體的生物活性和藥理毒性的差異仍有待進(jìn)一步探究。

3.4 本研究的價(jià)值

目前，國內(nèi)注射用替卡西林鈉克拉維酸鉀尚無統(tǒng)一質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，各廠家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定方法各不相同，其產(chǎn)品質(zhì)量也參差不齊。而本研究所建立的方法簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確可靠、靈敏度高、重復(fù)性好，可作為一種注射用替卡西林鈉克拉維酸鉀中兩種主成分含量同時(shí)測(cè)定的有效方法，用于該制劑的質(zhì)量控制。

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[10]European Pharmacopoeia Commission.European Pharmacopoeia：7.0[S]，2010：3091-3092.

[11] 王茉莉，張?zhí)m桐，張菁，等.HPLC測(cè)定替卡西林鈉及注射用替卡西林鈉克拉維酸鉀中的有關(guān)物質(zhì)[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2016，33（12）：1553-1557.

（編輯：周 箐）

Simultaneous Determination of 2 Main Components in Ticarcillin Disodium and Potassium Clavulanate for Injection by Improved HPLC

WANG Moli1，2，ZHANG Jing1，ZHANG Shaomeng1，ZHANG Lantong2（1.Hebei Institute for Drug Control，Shijiazhuang 050011，China；2.School of Pharmacy，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China）

OBJECTIVE：To improve the method for the determination of 2 main components in Ticarcillin disodium and potassium clavulanate for injection.METHODS：HPLC was performed on the column of Waters XBridgeTMC18with mobile phase of 0.01 mol/L ammonium dibasic phosphate solution（pH 7.0）-menthol（80∶20，V/V）at a flow rate of 1.0 mL/min，the detection wavelength was 220 nm，column temperature was 30℃，and injection volume was 20μL.RESULTS：The linear range was 1.95-195.22 μg/mL for ticarcillin（r＝0.999 9）and 0.12-12.18 μg/mL for clavulanate（r＝0.999 9）；RSDs of precision，stability（under 4℃）and reproducibility tests were lower than 1.0%；recoveries were 99.3%-100.5%（RSD＝0.4%，n＝9）and 99.2%-101.0 %（RSD＝0.7%，n＝9）.CONCLUSIONS：The method is rapid，accurate and reliable，and can be used for the determination of 2 main components in Ticarcillin disodium and potassium clavulanate for injection.

HPLC；Ticarcillin；Clavulanate；Ticarcillin disodium and potassium clavulanate for injection；Content determination

R927.2

A

1001-0408（2017）06-0835-03

2016-03-01

2017-01-12）

＊副主任藥師，博士研究生。研究方向：藥品質(zhì)量控制及體內(nèi)藥物分析。電話：0311-85212008-8029。E-mail：moliwang_003@163.com

#通信作者：教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及體內(nèi)藥物分析。電話：0311-86266419。E-mail：zhanglantong@263.net

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.06.31