MMPs和TIMPs與糖尿病心肌病心室重構(gòu)的關(guān)系及糖心寧的干預作用

谷玉紅 李 解欣然 劉 杰 周旭升 岳改英 易京紅 魏執(zhí)真

(1 首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京，100010； 2 首都醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，北京，100069；3 北京市中醫(yī)研究所，北京，100010； 4 首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院心內(nèi)科，北京，100010)

MMPs和TIMPs與糖尿病心肌病心室重構(gòu)的關(guān)系及糖心寧的干預作用

(1 首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京，100010； 2 首都醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，北京，100069；3 北京市中醫(yī)研究所，北京，100010； 4 首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院心內(nèi)科，北京，100010)

目的：探討MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-1在糖尿病心肌病心室重構(gòu)過程中的作用，以及糖心寧的心肌保護作用及機制。方法：36只SD大鼠，其中9只作為空白對照組，27只腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)制備糖尿病心肌病大鼠模型，隨機分為模型組、糖心寧高劑量組、糖心寧等效劑量組3組，糖心寧組灌服中藥，模型組及空白對照組灌服等量清潔飲用水，給藥8周后處死大鼠，計算左心室肥厚指數(shù)，檢測血清T-SOD活性和MDA含量；Masson染色觀察心肌組織中膠原，免疫組化法檢測心肌組織MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-1的蛋白表達。結(jié)果：糖尿病心肌病大鼠用藥8周后，糖心寧高劑量組、糖心寧等效劑量組均能降低左心室肥厚指數(shù)，減少MDA含量，升高T-SOD水平，且同時升高MMP-9/TIMP-1和MMP-2/TIMP-2比值，降低心肌膠原含量。結(jié)論：糖心寧具有通過改善氧化應激，重新調(diào)整MMP-9/TIMP-1平衡、減弱TIMP-1對MMP-9抑制從而減輕DCM心室重構(gòu)的作用。

糖尿病心肌病；氧化應激；MMPs；TIMPs；糖心寧

糖尿病心肌病(Diabetic Ardiomyopathy，DCM)是指糖尿病患者心肌細胞原發(fā)性損傷引起廣泛的結(jié)構(gòu)異常，最終引起左心室肥厚、舒張和(或)收縮期功能障礙的一種疾病狀態(tài)。DCM主要病理改變表現(xiàn)為心室重構(gòu)，而心室重構(gòu)的形成不僅取決于心肌細胞本身,還包括心肌細胞外基質(zhì)代謝失平衡導致的心肌間質(zhì)重構(gòu)，最終誘發(fā)心力衰竭?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是降解細胞外基質(zhì)的關(guān)鍵酶，心肌中的MMPs能夠降解除多糖以外的所有基質(zhì)成分。糖尿病時高血糖誘導的氧化應激可通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白激酶(MMPs)/基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物(TIMPs)的平衡參與DCM心室重構(gòu)[1-3]。糖心寧是我院國家級名老中醫(yī)魏執(zhí)真教授結(jié)合多年臨床經(jīng)驗，潛心組方形成的經(jīng)驗方，既往實驗研究結(jié)果表明：糖心寧對DCM心肌超微結(jié)構(gòu)病理改變具有改善作用，可抑制血管平滑肌細胞的增值、血小板衍化生長因子的生成和原癌基因C-myc、C-fox基因的表達，從而起到對糖尿病心臟的保護作用[4-5]。本研究采用STZ誘導的SD雄性大鼠DCM模型，初步探討糖心寧對DCM心室重構(gòu)的影響，DCM大鼠心肌組織中氧化應激反應及MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-1表達情況以及糖心寧的干預作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性SD大鼠(由中國食品藥品檢定研究院提供，SCXK(京)2014-0013)36只，SPF級，體重180～220 g，于SPF級動物房喂養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為恒溫20～24 ℃，相對濕度40～70，明暗交替12 h/12 h，普通飼料，自由進食水。

1.1.2 藥物 糖心寧組成(太子參、麥冬、五味子、丹參、川芎、香附、香櫞、佛手、牡丹皮、赤芍、黃連)，由北京中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供。糖心寧制備成水煎劑，等效劑量為成人正常劑量按體表面積系數(shù)折算乘以7，高劑量為等效劑量的2倍。

1.1.3 試劑與儀器 鏈脲佐菌素(STZ貨號：S0130,Sigma)、糖原染色試劑盒(PAS貨號：MST-8037，邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)、Masson染色試劑盒(貨號：D026，南京建成科技有限公司)、總超氧化物歧化酶試劑盒(T-SOD貨號：A001-1，南京建成科技有限公司)、丙二醛試劑盒(MDA貨號：A003-1，南京建成科技有限公司)、兔抗大鼠MMP-2單克隆抗體(貨號：BA0569，武漢博士德生物公司)、兔抗大鼠MMP-9單克隆抗體(貨號：PB0710，武漢博士德生物公司)、兔抗大鼠TIMP-1多克隆抗體(貨號：BA0575，武漢博士德生物公司)、兔抗大鼠TIMP-2多克隆抗體等(貨號：BA0576，武漢博士德生物公司)、脫水機、包埋機(Leica，EG1140C)、石蠟切片機(Leica公司，RM2135)生物圖像分析軟件AON-STUDIO 2012等。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備 采用鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射制作糖尿病大鼠模型[6-7]。普通飼料適應性喂養(yǎng)1周后，禁食12 h，期間自由飲水，隨機分為空白對照組9只，造模組27只，造模組按55 mg/kg劑量單次腹腔內(nèi)注射STZ,空白對照組腹腔內(nèi)注射等體積檸檬酸緩沖液，分別于72 h、1周后，采用葡萄糖氧化酶法尾靜脈取血測定空腹血糖，兩次空腹血糖均≥11.1 mmol/L，定義為糖尿病大鼠造模成功。第5周(STZ注射后第4周)，空白組隨機抽取1只大鼠，造模組隨機抽取3只大鼠取材，光鏡下觀察空白組及造模組的心肌組織，若造模組表現(xiàn)為心肌細胞肥大、心肌間質(zhì)纖維化，且心肌過碘酸雪夫染色呈陽性，可認為DCM造模成功。

1.2.2 實驗分組及給藥 大鼠32只，分為4組，其中包括空白對照組(Control)8只，將造模組24只隨機平均分為3組，分別為模型組(Model)、糖心寧高劑量組(TXN-H)、糖心寧等效劑量組(TXN-L)。

糖心寧高劑量組和糖心寧等效劑量組每日中藥灌胃1次，空白對照組、模型組予等量清潔飲用水灌胃，1次/d，按1 mL/100 g計算，共給藥8周。

1.2.3 一般情況 平時記錄大鼠活動狀態(tài)、毛色、精神狀態(tài)、飲食、二便情況。每周測血糖和稱重。

1.2.4 標本采集 給藥8周結(jié)束后，腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)將大鼠麻醉，腹主動脈取血，3 000 r/min離心15 min，分離血清，處死動物，迅速取出心臟，稱取動物心重、稱取左心室游離壁濕重，計算左室肥厚指數(shù)(LVHI左心室重量/全心濕重)。心臟保存于10%福爾馬林溶液。

1.2.5 生化法測定氧化應激指標 采用硫代巴比妥酸法測定MDA的含量。用可見分光光度計測量其吸收度，通過公式計算MDA含量。具體操作按試劑盒說明書進行。采用黃嘌呤氧化酶法(羥胺法)測定T-SOD活力，通過比色法可以測定被測樣品具有的T-SOD活力。具體操作按試劑盒說明書進行。

1.2.6 Masson染色測定心肌膠原含量 心肌組織常規(guī)脫水、包埋、切片，按照Masson染色說明說操作，光鏡下觀察心肌細胞，在200倍鏡下拍片，每張片選10個視野，,采用生物圖像分析軟件AON-STUDIO 2012分析心肌組織膠原含量，測量膠原面積百分比(Percent)和積分光密度(IOD)，結(jié)果用質(zhì)量評分公式Q=P/I(Q：Quality、P：Percent陽性物質(zhì)表達面積、I：IOD值)來評價心肌膠原的含量。

1.2.7 心肌MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-1蛋白表達測定 采用免疫組化方法石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，過梯度乙醇，PBS清洗后甩干，內(nèi)源性過氧化物酶封閉消除背景染色，PBS清洗，浸入檸檬酸鹽溶液，水浴鍋加熱法修復抗原，冷卻至常溫，正常山羊血清封閉非特異性抗原，PBS清洗甩干，滴加一抗小鼠一抗，4 ℃過夜。PBS泡洗、甩干，加入羊抗小鼠二抗，PBS洗片，DAB顯色,封片，在400倍鏡下拍片，每張片選10個視野。應用生物圖像分析軟件AON-STUDIO 2012對MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-1(細胞質(zhì)中棕褐色顆粒為陽性)表達進行圖像分析,測量陽性物質(zhì)的面積百分比(Percent)和積分光密度(IOD)，結(jié)果用質(zhì)量評分公式Q=P×I(Q：Quality、P：Percent陽性物質(zhì)表達面積、I：IOD值)來評價蛋白表達情況。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism6.01軟件進行數(shù)據(jù)分析，計算結(jié)果采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用單因素ANOVA分析各組組間差異，2組間采用配對t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 對照組大鼠體重隨時間明顯增加，精神狀況良好，毛皮有光澤，反應靈敏。模型組大鼠均出現(xiàn)多飲、多食、多尿及消瘦等癥狀，毛皮雜亂、失去光澤，倦怠少動，反應遲鈍，灌服中藥組大鼠整體狀況雖不及正常組，但較模型組有所改善。

糖尿病心肌病大鼠成模后，空腹血糖比對照組空腹血糖明顯升高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義；給藥期間，各組血糖數(shù)值無明顯波動；用藥后，糖心寧組血糖與模型組血糖比較(P>0.05)，差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 各組大鼠空腹血糖的比較

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 左心室肥厚指數(shù) 模型組大鼠LVHI(0.73±0.08)明顯高于對照組(0.61±0.06)(P<0.01)，糖心寧高劑量組LVHI(0.64±0.06)和糖心寧等效劑量組LVHI(0.64±0.06)均低于模型組(P<0.05)。

2.3 T-SOD活力和MDA含量 模型組較對照組T-SOD活力顯著下降，MDA含量升高(P<0.01)；而糖心寧高劑量和糖心寧等效劑量均可升高T-SOD活力(P<0.01)，降低MDA含量(P<0.05)。見表2。

表2 糖心寧對糖尿病心肌病大鼠血清T-SOD及MDA的影響(mean±SD，n=8)

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.4 Masson染色結(jié)果膠原蛋白分析 模型組大鼠心肌膠原較對照組顯著增多(Q：0.06±0.02比0.02±0.01，P<0.01)。糖心寧高劑量組(Q：0.02±0.01比0.06±0.02，P<0.01)及糖心寧等效劑量組(Q：0.03±0.0.03比0.06±0.02，P<0.05)均可降低心肌膠原。所有數(shù)值均采用科學計數(shù)(10-2)法表示。見圖1。

2.5 大鼠心肌MMP2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-1蛋白表達 大鼠心肌MMP2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-1蛋白表達情況見表3,MMP-2見圖2，MMP-9見圖3，TIMP-2見圖4，TIMP-1見圖5。

圖1 各組膠原纖維表達水平(×400)

圖2 各組MMP-2蛋白表達水平(×400)

組別MMP?2MMP?9TIMP?2TIMP?1對照組029±006??554±222?040±006??023±007??模型組065±014879±364123±025079±043糖心寧高劑量035±015??551±198?041±011??024±022?糖心寧等效劑量038±027?437±274?051±022??034±033?

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。所有數(shù)值均采用科學計數(shù)法(10-2)表示。

圖3 各組MMP-9蛋白表達水平(×400)

圖4 各組TIMP-2蛋白表達水平(×400)

2.6 各組大鼠 MMP-2與TIMP-2、MMP-9與TIMP-1蛋白含量比值比較見表4。

表4 各組大鼠心肌MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1蛋白含量比值比較(mean±SD，n=8)

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。所有數(shù)值均采用科學計數(shù)法(10-2)表示。

3 討論

DCM心室重構(gòu)包括心肌細胞肥大、心肌間質(zhì)纖維化和心肌細胞凋亡,糖尿病時高血糖誘導的氧化應激是心肌損傷的主要機制之一[8-9],氧化應激可通過調(diào)節(jié)MMPs/TIMPs的平衡參與DCM心肌損傷，促進心肌間質(zhì)纖維化,而心肌間質(zhì)纖維化是糖尿病心肌病心室重構(gòu)的病理特點之一。心肌細胞外基質(zhì)最主要的成分是膠原，其中Ⅰ型、Ⅲ型膠原占90%以上，MMPs是降解細胞外基質(zhì)的關(guān)鍵酶，MMP-2和MMP-9是心肌組織I、III型膠原完全降解的限速酶，決定I、III型膠原降解的速度[10-11]。TIMPs為MMPs內(nèi)源性的特異性抑制劑，與MMPs共同構(gòu)成體內(nèi)調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)動態(tài)平衡的最重要的系統(tǒng),目前發(fā)現(xiàn)與MMP-2和MMP-9關(guān)系密切而且在心臟表達較多的是TIMP-1、TIMP-2；TIMP-1主要抑制MMP-9，TIMP-2主要抑制MMP-2[12]。

現(xiàn)代醫(yī)學目前尚無治療DCM的特異性藥物，臨床主要以糾正糖、脂代謝紊亂，控制血壓，保護心肌細胞等對癥綜合治療為主，尤其是糾正糖、脂代謝紊亂是治療DCM的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。高額的治療費用和化學藥物所帶來的不良反應使上述藥物的臨床獲益受限，因此，加強傳統(tǒng)中醫(yī)藥學在相關(guān)領(lǐng)域的研究，具有重要臨床意義。

中醫(yī)雖無DCM的明確記載，但對其癥狀與病機的描述可見于“消渴病”并發(fā)“心悸”“怔忡”“胸痹心痛”“厥心痛”“真心痛”等證之中。“瘀血”在糖尿病心肌病的發(fā)生、發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。消渴病遷延日久,氣陰兩虛,氣虛無力推動血行,陰虛脈道不充,則更易導致瘀血阻滯；瘀血一旦形成,即成為新的致病因素,如血瘀氣滯可影響水津的輸布和吸收,水液停蓄成痰,形成瘀痰互結(jié)，痹阻心脈，故目前多以以益氣養(yǎng)陰活血法為DCM基本治療大法[13-14]。糖心寧由太子參、麥冬、五味子、丹參、川芎、香附、香櫞、佛手、牡丹皮、赤芍、黃連組成。方中以太子參、麥冬、五味子益氣養(yǎng)心，以香附、香橡、佛手寬胸理氣，配以丹參、川芎活血通脈,牡丹皮、赤芍涼血清熱,黃連厚腸理氣，諸藥相伍,共奏益氣養(yǎng)心、理氣通脈、涼血清熱之功，具有良好的臨床療效。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠左心室肥厚指數(shù)升高，MDA含量增多、T-SOD活力下降，提示氧化應激參與了糖尿病心肌病心室重構(gòu)的發(fā)生和發(fā)展；而MMPs/TIMPs在模型組和對照組之間也存在差異，模型組比值有下降趨勢，尤其以MMP9/TIMP1比值降低明顯，提示MMPs和TIMPs失衡可能是糖尿病心肌病心室重構(gòu)的發(fā)病機制之一，且氧化應激與MMPs/TIMPs平衡可能存在一定的聯(lián)系。應用糖心寧后，能夠降低左心室肥厚指數(shù)，提高T-SOD活力，減少MDA含量，升高MMPs/TIMPs比值，尤以MMP9/TIMP1比值升高明顯，達到保護心肌的目的。

研究結(jié)果提示糖心寧可以降低左心室肥厚指數(shù)，減輕DCM心室重構(gòu)，實現(xiàn)途徑與改善氧化應激反應，減弱TIMP-1對MMP-9的抑制密切相關(guān)。至于糖心寧其他減輕心肌細胞損傷具體作用環(huán)節(jié)及其改善心室重構(gòu)的分子通路機制尚有待進一步研究。

[1]康雅萍.α-硫辛酸對糖尿病大鼠心肌損傷的保護作用[D].沈陽：遼寧醫(yī)學院，2012.

[2]NabeebaccusA,ZhangM,etal.NADPH oxidases and cardiac remodeling[J].Heart Fail Rev,2011，16(1):5-12.

[3]呂琳.氧化應激介導糖尿病心肌纖維化的機制研究[D].天津：天津醫(yī)科大學，2009.

[4]宋冰,魏執(zhí)真,呂仁和.中藥糖心寧口服液對血管平滑肌細胞原癌基因C-myc和C-fox表達的影響[J].中醫(yī)雜志,2004,45(4):292-294.

[5]魏執(zhí)真,易京紅,宋冰,等.糖心寧治療糖尿病性心臟病的試驗研究[J].中國醫(yī)藥學報,2004,45(4):292-294.

[6]張春虹，臧偉進，徐靜,等.建立糖尿病心肌病動物模型方法的實驗研究[J].衛(wèi)生研究,2006，35(6):707-711.

[7]Liu Wen-qi，Dai Hong-yan，Xing Ming-qingetal.Establishiment of animal models of diabetic cardiomyopathy[J].Chinese Journal of Tissue Engineering Research,2015,19(27):4265-4270.

[8]Huynh K,Bernardo BC,McMullen JR，et al.Dibetic cardiomyopathy:mechanisms and new treatment strategies targeting antioxidant signaling pathways[J].Pharmacol Ther,2014,142(3):375-415.

[9]Joshi M,Kotha SR,Malireddy S,et al.Conundrum of pathogenesis of diabetic cardiomyopathy:role of vascular endothelial dysfunction,reactive oxygen species,and mitochondria[J].Mol Cell Biochem,2014,386(1/2):233-249.

[10]張建，華綺.代謝綜合征[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,2003:23-28,92-98.

[11]Peterson JT,LiH,Bryant JW.Evolution of matrix metalloprotease and tissue inhibitor expression during heart failure progression in the infracted rat[J].Cardiovase Res,2004,6:307-315.

[12]Visser,NagaseH.Matrix Metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases:structure,function and biochemistry[J].Circulation Research,2003,92(8):827-839.

[13]王海穎,陳城,陸敏,等.怡心飲對糖尿病心臟病大鼠心肌CTGF-mRNA和MCP-1mRNA表達的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2012,10(9):1086-1088.

[14]鄭永鈿,繆英年,林澤宏.益氣化瘀湯對糖尿病心肌病大鼠心肌細胞纖維化的影響[J].中國醫(yī)藥指南，2014,12(15)：67-68.

(2016-12-20收稿 責任編輯：洪志強)

MMPs and TIMP′s Relationship with Diabetic Cardiomyopathy Ventricular Remodelingand Intervention Effect of Tangxinning

(1DepartmentofEndocrinology，BeijingHospitalofTraditionalChineseMedicine，CapitalMedicalUniversity，Beijing100010,China；2CollegeofBasicMedicalSciences，CapitalMedicalUniversity，Beijing100010,China; 3BeijingInstituteofTraditionalChineseMedicine，Beijing100010,China)

Objective:To study the MMP-2，MMP-9，TIMP-2 and TIMP-1′s function during diabetic cardiomyopathy ventricular remodeling process，as well as the myocardial protective effect and mechanism of Tangxinning.Methods:A total of 36 SD rats were included into the study，9 of them were taken as normal control rats，and the other 27 rats were injected with streptozotocin(STZ).These 27 rats were randomly divided into three groups：a model group and a high dose group of Tangxinning and an equal dose group of Tangxinning.The groups of Tangxinning were given a gavage of Chinese traditional medicine.The groups of model and control were given a gavage of clean drinking water.The experiment lasted 8 weeks.Then，the rats were killed to calculate the left ventricular hypertrophy index and estimate the activities of the T-SOD and MDA in serum.The cardiac histological changes were observed by Masson staining.The protein expression of MMP-2，MMP-9 and TIMP-2 and TIMP-1 in myocardium were detected by immunohistochemical method.Results:After 8 weeks of medication，both high dose group and the equal dose group of Tangxinning could reduce index of left ventricular hypertrophy and MDA，increase the level of T-SOD and the ratio of MMP-9/TIMP-1 and MMP-2/TIMP-2.The myocardial collagen content dropped.Conclusion:Tangxinning may have the effect to readjust the balance of MMP-9/TIMP-1 by improving oxidative stress and weakening TIMP-1 to MMP-9，Then DCM ventricular remodeling effect was reduced.

Diabetic cardiomyopathy; Oxidative stress; MMPs; TIMPs; Tangxinning

首都中醫(yī)藥研究專項一般項目(編號：15ZY15)；首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院“育苗計劃”院級課題(編號：2014YM-07)

谷玉紅(1988.03—)，女，在讀碩士研究生，研究方向：中醫(yī)內(nèi)科學內(nèi)分泌方向，E-mail:guyuhongtt@163.com

易京紅(1963.07—)，女，碩士，主任醫(yī)師，研究方向：糖尿病及其并發(fā)癥的中醫(yī)藥研究，E-mail：kycyjh@sina.com;魏執(zhí)真(1937.04—)，女，學士,教授，主任醫(yī)師，國家級名老中醫(yī)，研究方向：心血管疾病、糖尿病及其并發(fā)癥的中醫(yī)藥研究

R587.2

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.01.006