李賓，吳鵬

（1.山東省博興縣畜牧獸醫(yī)局 山東濱州 256500；2.安徽省東至縣農(nóng)業(yè)委員會(huì) 安徽東至 247200）

2015年以來，我國(guó)家禽自沿海地區(qū)逐步向內(nèi)陸省份發(fā)生一起以心包積液、肝臟壞死為主要特征的急性、烈性傳染病，感染所涉及的省份包括遼寧、山東、江蘇、廣東、河北、山西、河南、安徽、湖北等，感染所涉及的家禽包括肉雞、蛋雞、種雞、肉鴨等，死亡率一般在10%～30%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)80%，已給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。隨著對(duì)該病病原學(xué)研究的深入，該病被確診為由I亞群禽腺病毒引起，統(tǒng)一命名為安卡拉病[2]。本研究利用分離的肉雞源I亞群禽腺病毒制備雞安卡拉病油乳劑滅活疫苗，將其多次強(qiáng)化免疫高產(chǎn)蛋雞后采集高免蛋，制備雞安卡拉病卵黃抗體，并分析了卵黃抗體對(duì)人工感染I亞群禽腺病毒肉仔雞的治療效果，旨在為安卡拉病的綜合防治提供一種經(jīng)濟(jì)、安全、有效的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 抗原與試驗(yàn)動(dòng)物

肉雞源I亞群禽腺病毒由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室分離 并保存；30日齡健康肉仔雞和210日齡健康產(chǎn)蛋雞均選自無I亞群禽腺病毒感染史的雞群。

1.2 病毒的增殖

將I亞群禽腺病毒用滅菌生理鹽水100倍稀釋后卵黃囊途徑接種7日齡SPF雞胚，無菌收集接種48h后死亡雞胚的卵黃液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 滅活疫苗的制備

取-20℃保存的卵黃液1000mL，加甲醛2.0mL，置37℃滅活24h后，加吐溫-80溶液40mL，混合均勻即為水相。取白油960mL，加司本40mL，混合均勻后加入硬脂酸鋁40mL，高壓滅菌后即為油相。將油相900mL與水相600mL混合后高速攪拌乳化，即得油包水型雞安卡拉病滅活疫苗，分裝成100mL/瓶，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 蛋雞的免疫

利用雞安卡拉病滅活疫苗免疫210日齡健康產(chǎn)蛋雞50只，胸部肌肉注射疫苗1.0mL/只，14d后按照上述方法進(jìn)行二免，二免14d后進(jìn)行三免，三免7d后收集雞蛋。

1.5 卵黃抗體的制備

利用0.05%百毒殺對(duì)收集的雞蛋浸泡消毒后，滅菌紗布擦干，無菌收集卵黃液，加青、鏈霉素各500IU/mL，即得雞安卡拉病卵黃抗體，分裝成100mL/瓶，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 卵黃抗體效價(jià)的測(cè)定

采用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)方法，以1.3中的滅活病毒液為檢測(cè)抗原測(cè)定卵黃抗體的抗體效價(jià)。

1.7 卵黃抗體安全性檢驗(yàn)

將卵黃抗體頸部皮下注射30日齡健康肉仔雞10只，2.0mL/只，觀察14日，注射雞應(yīng)全部健活且無臨床不適反應(yīng)。

1.8 卵黃抗體治療效果試驗(yàn)

將40只30日齡健康肉仔雞隨機(jī)分成4組（對(duì)照組、治療I組、治療II組、治療III組），每組10只雞，各組均肌肉注射1.2中制備的病毒液0.5mL，24h后，對(duì)照組、治療I組、治療II組、治療III組分別頸部皮下注射卵黃抗體0、0.25、0.5、1.0mL，隔離飼養(yǎng)，觀察至14d，統(tǒng)計(jì)各組雞的死亡數(shù)與治愈數(shù)，分析卵黃抗體不同使用劑量對(duì)人工感染I亞群禽腺病毒肉仔雞的治療效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果

采用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)方法測(cè)定卵黃抗體的抗體效價(jià)達(dá)1∶64。

2.2 安全性檢驗(yàn)結(jié)果

10只肉仔雞全部健活，且注射部位吸收良好，食欲、精神狀態(tài)良好，無不適反應(yīng)。

2.3 治療效果試驗(yàn)結(jié)果

如表1所示，對(duì)照組的10只肉仔雞全部死亡，而卵黃抗體0.25、0.5、1.0mL注射劑量組的10只肉仔雞分別死亡7、1、0只，治愈率分別達(dá)30%、90%和100%。表明當(dāng)卵黃抗體的使用劑量≥0.5mL時(shí)，對(duì)I亞群禽腺病毒的感染雞群即可產(chǎn)生良好的治療作用。

表1 不同劑量卵黃抗體對(duì)人工感染I亞群禽腺病毒肉仔雞的治療效果

3 討論

目前安卡拉病尚無有效的商品化疫苗和治療藥物，為有效地控制該病的流行，降低養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)損失，研制針對(duì)該病的預(yù)防與治療藥物已迫在眉睫。卵黃抗體（IgY）又稱為卵黃免疫球蛋白，是禽類在特異性抗原刺激下由B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的血清中免疫球蛋白G（IgG）移行至卵黃中形成的多克隆抗體，具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、耐堿、耐酸、耐熱、易于制備、可規(guī)?；a(chǎn)、成本低、安全高效等優(yōu)點(diǎn)[3]。卵黃抗體通過被動(dòng)免疫可使注射動(dòng)物獲得堅(jiān)實(shí)的保護(hù)力，是動(dòng)物疫病特異性地預(yù)防和治療的良好生物制品，在動(dòng)物疫病的綜合防控中已得到了廣泛應(yīng)用，尤其在我國(guó)雞傳染性法氏囊、小鵝瘟等家禽急性傳染病的預(yù)防和治療方面發(fā)揮了重要作用。本研究制備的安卡拉病卵黃抗體瓊擴(kuò)抗體效價(jià)達(dá)1：64，0.5和1.0mL使用劑量對(duì)人工感染I亞群禽腺病毒的肉仔雞治愈率分別達(dá)90%和100%，0.5mL的使用劑量即對(duì)安卡拉病具有良好的治療作用，但本研究只是停留在實(shí)驗(yàn)室的研制與檢驗(yàn)階段，下一步計(jì)劃將其應(yīng)用于臨床，查看其在臨床中的應(yīng)用效果，以便為我國(guó)安卡拉病的預(yù)防與治療提供一種有效的技術(shù)手段，逐步降低我國(guó)安卡拉病的發(fā)病率，保障養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展。■

[1] 蔡宇威，劉蘭，梁雄燕，等.1例雞安卡拉病的診斷及病原分離鑒定[J].畜牧與獸醫(yī)，2016，48(12):89-91.

[2] 王龍,劉學(xué)輝,劉暢.一例肉雞安卡拉病毒病的診治[J].家禽科學(xué)，2016(8):33-34.

[3] 安芳蘭,李菁，張榮，等.卵黃抗體在疾病防治中應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44(5):68-71.