王珊珊，谷 舞，許 汝，李泰雅，王繽晨

（1．沈陽工學(xué)院生命工程學(xué)院，遼寧撫順 113122；2．大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連 116034）

五味子色素的提取工藝優(yōu)化及其穩(wěn)定性研究

王珊珊1，谷 舞1，許 汝1，李泰雅1，王繽晨2

（1．沈陽工學(xué)院生命工程學(xué)院，遼寧撫順 113122；2．大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連 116034）

以五味子色素提取液中花色素苷含量為指標(biāo)，乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比、提取溫度為考察因素，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面方法優(yōu)化五味子色素提取工藝，并以色素色度為指標(biāo)，研究五味子色素的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，以55%濃度乙醇為提取液，按1∶20 g／mL的料液比，在80℃下提取80 min，五味子色素提取量最大，為11．89 mg／L。五味子色素穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明：五味子色素光穩(wěn)定性較好；蔗糖、抗壞血酸對(duì)色素有穩(wěn)定、增色作用；五味子色素易被雙氧水氧化；在酸性、中性和弱堿性條件下五味子色素較穩(wěn)定，強(qiáng)堿條件下顏色改變；Ca2＋、Mg2＋、Na＋、K＋對(duì)色素穩(wěn)定性無明顯影響，Al3＋對(duì)色素穩(wěn)定性有破壞作用，F(xiàn)e3＋、Cu2＋對(duì)色素穩(wěn)定性有保護(hù)作用。

五味子色素；提取；響應(yīng)面分析；穩(wěn)定性

五味子（Schisandra chiennsis Bail）為我國常用滋補(bǔ)強(qiáng)壯中藥，始載于神農(nóng)本草經(jīng)，結(jié)合代表五行的辛、甘、酸、苦、咸五種味道于一身［1］。五味子具有多種有效成分和多項(xiàng)藥理作用［2］，能調(diào)節(jié)心腦血管系統(tǒng)、改善血液循環(huán)、興奮中樞神經(jīng)，對(duì)治療疲勞、嗜睡、神經(jīng)衰弱有特效。適量的五味子還有利于恢復(fù)心肌的正常功能［3］。天然植物色素多具有很強(qiáng)的藥理作用，具有明顯的抗氧化［4－5］、抗癌活性［6－8］作用，加上其安全性高、色澤鮮艷，常被用來做食品著色劑［9］，五味子中含有豐富的花色素苷類天然紅色素，具有抗氧化［10］、抗突變［11］和預(yù)防心血管疾?。?2］等生理學(xué)功能，是一種極具開發(fā)潛力的天然活性成分，可廣泛應(yīng)用于食品、藥品、化妝品等產(chǎn)業(yè)［13］。目前已知的花色素苷類色素有20多種，常見的有矢車菊素、天竺葵素、飛燕草素、芍藥素、牽牛素、錦葵素。近年來，國內(nèi)外對(duì)植物源天然色素的研究較為關(guān)注，但有關(guān)五味子色素的報(bào)道不多。因此，對(duì)五味子色素提取工藝及穩(wěn)定性進(jìn)行研究具有重要意義。

1 材料與方法

1．1 材料、試劑與儀器

五味子：撫順市成大方圓連鎖大藥房。

乙醇、過氧化氫、抗壞血酸、蔗糖、鹽酸、氫氧化鈉、硫酸銅、硫酸鋁、氯化鉀、碳酸鈉、硫酸鎂、氯化鐵、氯化鈣：均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

恒溫水浴鍋HH－6：常州國華電器有限公司；電子天平JD100－3：沈陽龍騰電子有限公司；低速臺(tái)式離心機(jī)TDL－40B：上海安亭科學(xué)儀器廠；pH計(jì)PHS－3CU、可見分光光度計(jì)721、恒溫培養(yǎng)箱HPX－9052MBE、高壓立式蒸汽滅菌鍋YXQ－LS－50SⅡ、垂直流超凈工作臺(tái)SW－CJ－2FD、大容量恒溫?fù)u床KYC1112：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1．2 五味子色素提取條件的優(yōu)化

以提取液中花色素苷的含量為指標(biāo)，料液比、乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間為考察因素，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面法優(yōu)化五味子色素的提取。

1．3 色素的穩(wěn)定性研究

色素色度測(cè)定：以在最佳提取工藝下制備的色素提取液為處理對(duì)象，在五味子色素的三個(gè)顯著波長（506、519、532 nm）［14－17］下測(cè)得吸光度，取平均值。

1．3．1 光照對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

取100 mL色素原液（在最佳工藝下制備的色素提取液），于不同環(huán)境（室內(nèi)散光、紫外燈、日光燈）下靜置，1、2、3、4、5 h時(shí)分別測(cè)色素液的色度。

1．3．2 蔗糖對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

取5份100 mL的色素原液，加入蔗糖，使其濃度為0、2%、4%、6%、8%。在室溫下放置0．5、1、1．5、2、2．5 h，分別測(cè)色素提取液的色度。

1．3．3 過氧化氫對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

取4份100 mL的色素原液，加入過氧化氫，使其濃度為0．5%、1%、1．5%、2%。在室溫下放置1、 2、3、4、5 h，分別測(cè)色素提取液的色度。

1．3．4 抗壞血酸對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

取5份100 mL的色素原液，加入抗壞血酸，使其濃度分別為0、1%，、2%、3%、4%。在室溫下放置0．5、1、1．5、2、2．5 h，分別測(cè)色素提取液的色度。

1．3．5 pH值對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

取色素原液，使用一定濃度的鹽酸和氫氧化鈉溶液，將色素液調(diào)節(jié)到不同pH值，觀察其顏色變化。

1．3．6 金屬離子對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

取6份100 mL的色素原液，分別配制含有0．02 mol／L的Fe3＋、Cu2＋、Mg2＋、Al3＋、Na＋、K＋的色素溶液，放置10、20、30、40、50 min后，測(cè)色素提取液的色度［14］。

2 結(jié)果與分析

2．1 五味子色素中花色素苷含量的測(cè)定

由于五味子色素目前無標(biāo)準(zhǔn)品作為含量檢測(cè)對(duì)照，本實(shí)驗(yàn)以五味子色素提取液中花色素苷的含量來鑒定五味子色素的提取效果，采用Giusti等報(bào)道的pH示差法測(cè)定樣品中花色素苷的含量［18－20］，根據(jù)文獻(xiàn)［21－22］報(bào)道，在不清楚待測(cè)樣品主要成分時(shí)以矢車菊色素－3－葡萄糖苷作為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)樣品，計(jì)算公式為：

花色素苷含量／（mg／L）＝［（Aλvis－max－A700）× pH1．0－（Aλvis－max－A700）×pH4．5］×MW×DF× 1 000／ε×1

式中：Aλvis－max—樣品提取液在可見光區(qū)的最高吸收波長（λvis－max）的吸光值；A700—700 nm處的吸光值；MW—矢車菊色素－3－葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量，449．2 g／mol；ε—矢車菊色素－3－葡萄糖苷消光系數(shù)，26 900 L／mol／cm；DF—樣品稀釋后的體積／最初的體積。

2．2 五味子色素提取單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2．2．1 料液比對(duì)色素提取的影響

準(zhǔn)確稱取5份5 g的五味子粉末，分別置于250 mL三角瓶中，配置濃度為55%的乙醇，分別按料液比為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g／mL的體積加入三角瓶中，在70℃下水浴1 h，離心去沉淀取上清液，測(cè)定花色素苷含量。

由圖1可看出，當(dāng)乙醇濃度為55%，70℃水浴1 h，不同料液比條件下色素含量先迅速增高后以一定速率逐漸降低，料液比為1∶20時(shí)含量最高，為9．852 mg／L，當(dāng)料液比小于1∶20時(shí)含量幾乎呈直線下降。

2．2．2 乙醇濃度對(duì)色素提取的影響

準(zhǔn)確稱取5份5 g五味子粉末，分別置于250 mL三角瓶中，分別加入濃度為45%、55%、65%、75%、85%的乙醇100 mL，在70℃水浴鍋中水浴1 h，4 000 r／min離心15 min去沉淀取上清液，測(cè)定花色素苷含量。

由圖2可看出，料液比為1∶20 g／mL在70℃條件下浸提1 h，當(dāng)乙醇濃度從45%提高至55%時(shí)花色素苷含量略有上升，當(dāng)乙醇濃度為55%時(shí)出現(xiàn)峰值，含量為8．447 mg／L，當(dāng)乙醇濃度大于55%時(shí)，隨著乙醇濃度的提高花色素苷含量逐漸降低。

圖1 料液比對(duì)色素提取的影響

圖2 乙醇濃度對(duì)色素提取的影響

2．2．3 提取溫度對(duì)色素提取的影響

準(zhǔn)確稱取5份5 g五味子粉末，分別置于250 mL三角瓶中，按料液比為1∶20 g／mL加入55%的乙醇，分別置于溫度為40、50、60、70、80℃的水浴鍋中水浴1 h，離心去沉淀取上清液，測(cè)定花色素苷含量。

由圖3可看出，當(dāng)乙醇濃度為55%，料液比1∶20 g／mL，在不同溫度下水浴1 h，隨著溫度的提高，花色素苷含量先呈梯度上升，后迅速降低。在40～50℃之間含量基本沒變化，高于50℃后隨著溫度的提高，花色素苷含量緩慢上升，70℃時(shí)達(dá)到峰值，為最適提取溫度，在該溫度下的含量為10．504 mg／L，再提高溫度，花色素苷含量迅速下降。

2．2．4 提取時(shí)間對(duì)色素提取的影響

準(zhǔn)確稱取5份5 g五味子粉末，分別置于250 mL三角瓶中，按料液比1∶20 g／mL加入55%的乙醇，在70℃水浴鍋中分別水浴40、50、60、70、80 min，離心去沉淀取上清液，測(cè)定花色素苷含量。

由圖4可看出，乙醇濃度為55%，料液比1∶20 g／mL，在70℃條件下水浴，隨著水浴時(shí)間的延長，花色素苷含量先提高后降低。在時(shí)間為40～50 min間花色素苷含量幾乎不變，大于60 min后再延長水浴時(shí)間，花色素苷含量迅速提高，在70 min時(shí)含量最大，為11．347 mg／L，超過70 min后含量迅速降低。

圖3 提取溫度對(duì)色素提取的影響

圖4 提取時(shí)間對(duì)色素提取的影響

2．3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化五味子色素提取工藝

2．3．1 回歸模型的建立及方差分析

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上利用Design－Expert軟件進(jìn)行Box－Behnken設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)處理，確定最佳提取工藝。

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取花色素苷提取量為指標(biāo)，乙醇濃度（A）、提取時(shí)間（B）、料液比（C）、提取溫度（D）為考察因素，進(jìn)行4因素3水平的Box－Behnken Design（BBD）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)因素水平見表1。響應(yīng)面分析方案與結(jié)果見表2。利用Design－Expert 8．0．6軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得以五味子色素提取量為響應(yīng)值的回歸方程：

提取量＝7．58－0．17A＋0．78B－1．63C＋0．1D－0．37AB－0．27AC＋0．032AD－0．32BC＋0．48BD＋0．76CD－0．79A2＋0．22C2＋1．12D2

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平

表2 響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

回歸模型方差分析結(jié)果顯示（表3）：該模型極顯著（P＜0．000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0．05），回歸模型的決定系數(shù)R2＝0．994 9，調(diào)整系數(shù)，說明該模型與實(shí)際擬合較好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，可以用于五味子色素提取量的理論預(yù)測(cè)。從回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，各因素對(duì)色素提取率的影響程度依次為：料液比＞提取溫度＞提取時(shí)間＞乙醇濃度；交互項(xiàng)AB、AC、BC、BD、CD極顯著（P＜0．01）；二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì)色素提取率有極顯著影響（P＜0．01）。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果

2．3．2 響應(yīng)面分析及最佳提取工藝研究

響應(yīng)面優(yōu)化主要是根據(jù)響應(yīng)面的三維圖以及標(biāo)準(zhǔn)殘差圖來對(duì)影響響應(yīng)值的獨(dú)立變量進(jìn)行進(jìn)一步的分析，從3D圖中可以很直觀的看出各個(gè)變量之間的交互作用對(duì)結(jié)果的影響。五味子色素提取工藝優(yōu)化的響應(yīng)面及等高線見圖5，圖5列出了自變量極顯著（P＜0．01）的3項(xiàng)AB、BD、CD，直觀地反映了各因素對(duì)提取量響應(yīng)值的影響。

圖a表示提取時(shí)間、乙醇濃度及兩者交互作用對(duì)五味子色素提取量的影響。從圖中可以看到，當(dāng)乙醇濃度一定時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長，色素提取量逐漸增加；當(dāng)提取時(shí)間一定時(shí)，隨著乙醇濃度的提高提取量先增大后減小。

圖b表示提取時(shí)間、提取溫度及兩者交互作用對(duì)五味子色素提取量的影響。從圖中可以看出，當(dāng)提取時(shí)間一定時(shí)，五味子色素提取量隨溫度的上升先降低，后逐漸上升；當(dāng)提取溫度一定時(shí)，色素提取量隨提取時(shí)間的延長而增長。

圖c表示料液比、提取溫度及兩者交互作用對(duì)五味子色素提取量的影響。從圖中可以看出，當(dāng)提取溫度一定時(shí)，隨著液體相對(duì)量的增大五味子色素提取量持續(xù)下降，當(dāng)料液比一定時(shí)，五味子色素提取量隨著提取溫度的提高先下降后上升。

圖5 各因素交互效應(yīng)對(duì)五味子色素提取量影響的曲面圖

運(yùn)用Design Expert 8．0．6的響應(yīng)面分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化，得到五味子色素的最優(yōu)條件是：提取時(shí)間80 min，乙醇濃度53．26%，料液比1∶20 g／mL，提取溫度80℃，此時(shí)，五味子色素提取量預(yù)測(cè)達(dá)到最大值，為11．939 9 mg／L。為符合實(shí)際操作，將上述最優(yōu)提取條件簡(jiǎn)化為：提取時(shí)間80 min，乙醇濃度55%，料液比1∶20 g／mL，提取溫度80℃，按此提取工藝提取五味子色素，進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，得到提取量的平均值為11．89 mg／L，與預(yù)測(cè)值接近，說明響應(yīng)面優(yōu)化得到五味子色素的提取工藝在實(shí)踐中可行。

2．4 五味子色素穩(wěn)定性的研究

由于五味子色素目前暫無標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照，因此，以不同條件下的色素提取液的色度為指標(biāo)來檢測(cè)其穩(wěn)定性的變化。

2．4．1 光照對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

以色度為指標(biāo)，檢測(cè)在不同光照條件下色素穩(wěn)定性的變化，結(jié)果如圖6所示，在紫外光及室內(nèi)散光的條件下，五味子色素的色度均有上下波動(dòng)變化，但變化不大，說明光照對(duì)五味子色素穩(wěn)定性影響不大。

圖6 光照對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

2．4．2 蔗糖對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

將色素提取液配制成不同濃度的蔗糖溶液，以色度為指標(biāo)，檢測(cè)其穩(wěn)定性。結(jié)果如圖7所示，當(dāng)蔗糖濃度為0時(shí)色素色度值隨時(shí)間變化有小幅度波動(dòng)，隨著蔗糖濃度的增大波動(dòng)幅度降低，當(dāng)濃度達(dá)到8%時(shí)，色素色度隨時(shí)間延長有穩(wěn)定上升趨勢(shì)，可能是由于糖與花色素苷類色素結(jié)合形成穩(wěn)定的絡(luò)合物導(dǎo)致的，這說明一定濃度的蔗糖可對(duì)五味子色素起到增色作用［23］。

圖7 蔗糖對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

2．4．3 過氧化氫對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

配制不同濃度的過氧化氫色素溶液，通過測(cè)量色素色度考察過氧化氫對(duì)色素穩(wěn)定性的影響，結(jié)果如圖8所示，色素溶液的色度隨時(shí)間的延長逐漸下降，且隨過氧化氫濃度的增加下降的幅度加大，一定時(shí)間后趨于穩(wěn)定，溶液顏色變淺。這說明五味子色素的耐性較差，這與文獻(xiàn)中報(bào)道［23］的分子氧對(duì)花色苷具有毒害作用相符。作用機(jī)理是氧可以通過直接氧化或間接氧化使花色苷降解，從而改變花色素苷的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)。

圖8 過氧化氫對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

2．4．4 抗壞血酸對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

在添加不同濃度的抗壞血酸條件下，檢測(cè)抗壞血酸對(duì)五味子色素穩(wěn)定性的影響，結(jié)果如圖9所示。隨著抗壞血酸濃度的增加，色素的色度逐漸增加，且隨時(shí)間的延長變化不大，由此說明抗壞血酸對(duì)五味子色素有增色作用，可作為增色劑和穩(wěn)定劑添加到色素中。這一結(jié)果與文獻(xiàn)中報(bào)道［24］的抗壞血酸對(duì)花色苷具有穩(wěn)定作用相符合。

圖9 抗壞血酸對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

2．4．5 pH值對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

將五味子色素液調(diào)節(jié)到不同pH值，通過觀察顏色變化研究pH值對(duì)五味子色素穩(wěn)定性的影響?？疾旖Y(jié)果如表4所示，pH為1～3時(shí)色素顏色為鮮紅色不改變，pH為4～6時(shí)略有變淺為淺紅色，pH為7～9時(shí)為淺粉紅色，當(dāng)pH＞10時(shí)，色素呈現(xiàn)棕色，且隨pH值增大顏色加深。說明五味子色素在酸性、中性和弱堿性條件下較穩(wěn)定，且酸性越大，色素越紅，在強(qiáng)堿性條件下色素不穩(wěn)定。這與文獻(xiàn)［25］中報(bào)道的花色素苷類色素的酸堿穩(wěn)定性變化相符。

表4 不同pH值對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

2．4．6 金屬離子對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

以色素色度為指標(biāo)，研究不同金屬離子對(duì)五味子色素的影響。結(jié)果如表5所示，Ca2＋、Mg2＋、Na＋、K＋對(duì)色素穩(wěn)定性無明顯影響；Al3＋對(duì)色素穩(wěn)定性有破壞作用；Fe3＋、Cu2＋對(duì)色素穩(wěn)定性有保護(hù)作用。因此，F(xiàn)e3＋和Cu2＋可作為穩(wěn)定劑添加到五味子色素產(chǎn)品中。

表5 金屬離子對(duì)五味子色素的影響

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典的有機(jī)溶劑提取法，選取乙醇作為提取溶劑提取五味子色素，通過對(duì)提取時(shí)間、料液比、乙醇濃度和提取溫度單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析，確定五味子色素的最佳提取工藝：以55%濃度乙醇為提取液，按1∶20 g／mL的料液比，在80℃下提取80 min，五味子色素提取量可達(dá)到最大，為11．89 mg／L。

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，五味子色素光穩(wěn)定性較好；蔗糖、抗壞血酸對(duì)色素有穩(wěn)定、增色作用；色素易被過氧化氫氧化；在酸性、中性和弱堿性條件下較穩(wěn)定，強(qiáng)堿條件下顏色改變；Ca2＋、Mg2＋、Na＋、K＋對(duì)色素穩(wěn)定性無明顯影響，Al3＋對(duì)色素穩(wěn)定性有破壞作用，F(xiàn)e3＋、Cu2＋對(duì)色素穩(wěn)定性有保護(hù)作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，五味子色素可作為著色劑廣泛應(yīng)用于各類食品、藥品、化妝品等與人類生活息息相關(guān)的產(chǎn)品中，同時(shí)，由于五味子色素產(chǎn)自天然植物的特性，使五味子色素的使用更安全放心。

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Optimization of extraction process of Schisandra pigment and its stability

WANG Shan－shan1，GU Wu1，XU Ru1，LI Tai－ya1，WANG Bin－chen2
（1．College of Life Engineering，Shenyang Institute of Technology，F(xiàn)ushun Liaoning 113122；2．School of Food Science and Technology，Dalian Polytechnic University，Liaoning Dalian 116034）

The extraction technology of Schisandra pigment was optimized by response surface method on the basis of single factor experiment with anthocyanin from Schisandra pigment extract as index and ethanol concentration，extraction time，solid－liquid ratio and extraction temperature as factors．The pigment stability was studied with chroma as index．The results showed that：with the ethanol of concentration of 55%as the extracting solution，the solid－liquid ratio 1∶20 g／mL，extracted for 80 min at 80℃，the amount of pigment extracted from the fruit can reach the maximum of 11．89 mg／L．The pigment stability experiments showed that light stability was good；sucrose and ascorbic acid were of stable and hyperchromic effect；the pigment was oxygenated easily by hydrogen peroxide，and was stable in acidic，neutral and alkalescent conditions；the pigment changed color under alkali conditions；Ca2＋，Mg2＋，Na＋，K＋had little effect on the stability of the pigment，Al3＋had damaging effect on the stability of the pigment，and Fe3＋and Cu2＋had protective effect on the stability of the pigment．

Schisandra pigment；extraction；response surface analysis；stability

R 284．2

A

1007－7561（2017）02－0078－07

2016－07－18

省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（20163201000017）

王珊珊，1984年出生，女，講師．