吉惠杰，楊艷俊，沈啟慧，于麗穎，張躍偉，李長健

（吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林 132022）

超聲輔助酶解法提取仙人草多糖的工藝研究

吉惠杰，楊艷俊，沈啟慧，于麗穎，張躍偉，李長健

（吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林 132022）

以仙人草為原料，采用超聲輔助酶解法提取仙人草多糖。通過單因素法考察了單一酶種類和濃度、復(fù)合酶濃度和配比、酶解溫度、酶解時間、酶解pH值對多糖提取率的影響。利用正交實驗優(yōu)化了超聲輔助酶解法提取仙人草多糖的工藝條件。結(jié)果表明，超聲波輔助酶解法提取仙人草多糖的最佳提取條件為復(fù)合酶（纖維素酶∶果膠酶＝1∶1）濃度5%、酶解溫度50℃、酶解時間2 h、酶解pH值7，在此條件下仙人草多糖的提取率為6．60%。

仙人草；超聲波；酶解；多糖

仙人草（Mesona chinensis Benth），為唇形科涼粉草屬一年生草本植物，是一種重要的藥食兩用植物資源，廣泛分布于我國廣東、廣西、福建、浙江等地［1］。仙人草全草富含多糖、黃酮類化合物、熊果酸、齊墩果酸、微量元素、維生素等有效生物成分，具有調(diào)節(jié)和增強生理機能的作用［2］。大量研究表明，仙人草多糖具有清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化［3］、增強機體免疫機能［4－5］、抑制人類肝癌細胞生長與肝纖維化［6－7］、抗高血壓［8］、抗氧化性與抑菌效能［9－10］等功效。

植物有效成分的提取方法有超臨界流體提取［11］、超聲輔助提取法［12］、酶提取法［13］等。超聲波法，對植物有效成分提取具有很好的作用［14－18］。酶解法反應(yīng)條件溫和，近年來已經(jīng)廣泛應(yīng)用于天然藥用植物有效成分提?。?9］。目前，對仙人草多糖提取方法的研究較少。主要的提取技術(shù)還是用堿液輔助熱水提取，耗時，堿液濃度要求高，提取率低［20］。仙人草多糖酶解法提取研究目前只限于選用纖維素酶單一種類酶，未涉及其他種類酶或復(fù)合酶提取工藝研究。本文探索利用超聲波輔助酶解法提取仙人草多糖，采用正交實驗對復(fù)合酶解提取仙人草多糖工藝進行優(yōu)化，以期為仙人草多糖深加工的多元化、產(chǎn)業(yè)化提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1．1 主要材料

仙人草：購于廣東省長壽蕉嶺仙人草種植基地。

纖維素酶，活性≥10 000 U／g；果膠酶，活性≥30 U／mg；氯仿、正丁醇、苯酚、濃硫酸、無水葡萄糖、石油醚，以上化學(xué)試劑均為分析純；蒸餾水，自制。

XH－300UL型電腦微波超聲波紫外光組合催化合成儀：北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；EV－211型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：吉林省億盈科技有限公司；TS－200B型恒溫振蕩培養(yǎng)搖床：上海天呈儀器制造有限公司；SHB－3循環(huán)水多用真空泵：鄭州杜甫儀器廠；FA2005N型電子分析天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；TU－1950型雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器責任有限公司；DRK612型高溫鼓風干燥箱：山東德瑞克儀器有限公司。

1．2 實驗方法

1．2．1 葡萄糖標準曲線的繪制

以多糖提取率為研究指標，無水葡萄糖為對照品，采用苯酚—硫酸法，在489 nm波長處測定吸光度。精密稱取22．6 mg的葡萄糖標準品于250 mL容量瓶內(nèi)，用蒸餾水定容至刻度，分別吸取對照品溶液1．0、2．0、3．0、4．0、5．0、6．0 mL于10 mL具塞試管中，加蒸餾水稀釋至刻度，取上述葡萄糖對照品溶液各2 mL，加4%苯酚溶液1．0 mL，混勻，迅速加入濃硫酸7．0 mL搖勻，于40℃水浴中保溫30 min，取出，以相應(yīng)試劑為空白，進行分析，得回歸方程為y＝0．045 7x＋0．09，R2＝0．999 8，結(jié)果見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線

1．2．2 仙人草多糖的含量測定

吸取仙人草多糖提取液適量，按1．2．1方法，采用苯酚—硫酸法測吸光度，通過線性方程計算提取液中多糖濃度，按公式（1）計算仙人草多糖提取率：

1．2．3 仙人草多糖的提取方法

仙人草干燥恒重粉碎過40目篩，準確稱取仙人草粉末5．0 g，以料液比1∶30 g／mL加入蒸餾水，在一定的超聲波頻率下進行超聲處理，通過改變酶濃度、酶解溫度、酶解時間、酶解pH值進行提取，抽濾后，仙人草提取物加入石油醚脫脂，經(jīng)離心收集上清液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至10 mL左右，用Sevage法除蛋白［21］后，用蒸餾水定容于250 mL容量瓶中，測定吸光度，計算提取率。

1．2．4 超聲輔助酶解法提取仙人草多糖單因素實驗

1．2．4．1 酶種類及酶濃度的確定

準確稱取5．0 g仙人草粉，設(shè)定超聲頻率70 W，在酶解溫度50℃、酶解時間2．5 h、酶解pH 6的條件下，考察單一酶及復(fù)合酶的濃度及配比對仙人草多糖提取率的影響。所用酶分別為纖維素酶（濃度2%、3%、4%、5%），果膠酶（濃度2%、3%、4%、5%），纖維素酶∶果膠酶＝1∶1的復(fù)合酶（濃度2%、3%、4%、5%），纖維素酶∶果膠酶＝2∶3的復(fù)合酶（濃度2%、3%、4%、5%），纖維素酶∶果膠酶＝3∶2的復(fù)合酶（濃度2%、3%、4%、5%）。

1．2．4．2 酶解溫度對多糖提取率的影響

準確稱取5．0 g仙人草粉，加入4%復(fù)合酶（纖維素酶∶果膠酶＝1∶1），提取液pH 6，在70 W超聲功率下，分別設(shè)置酶解溫度為40、45、50、55℃，酶解時間2．5 h進行實驗，考察酶解溫度對仙人草多糖提取率的影響。

1．2．4．3 酶解時間對多糖提取率的影響

準確稱取5．0 g仙人草粉，加入4%復(fù)合酶（纖維素酶∶果膠酶＝1∶1），提取液pH 6，在70 W超聲功率下，酶解溫度50℃，設(shè)置酶解時間分別為1．5、2、2．5、3 h進行實驗，考察酶解時間對仙人草多糖提取率的影響。

1．2．4．4 酶解pH值對多糖提取率的影響

準確稱取5．0 g仙人草粉，加入4%復(fù)合酶（纖維素酶∶果膠酶＝1∶1），酶解pH值分別為4、5、6、7，在70 W超聲功率下，酶解溫度50℃，酶解時間2．5 h進行實驗，考察酶解pH值對仙人草多糖提取率的影響。

1．2．5 正交實驗優(yōu)化仙人草多糖提取工藝

在單因素實驗基礎(chǔ)上，以仙人草中多糖提取率為考察指標，選擇復(fù)合酶濃度、酶解溫度、酶解時間、酶解pH值為考察因素，設(shè)計L9（34）正交實驗，正交實驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 正交實驗因素水平

2 結(jié)果與分析

2．1 單因素實驗

2．1．1 酶種類及酶濃度的確定

酶種類及酶用量對仙人草多糖提取率的影響見圖2。由圖2可知，單一的纖維素酶、果膠酶和復(fù)合酶在相同條件下提取仙人草多糖時，復(fù)合酶較佳，其中當纖維素酶與果膠酶1∶1復(fù)合時，仙人草多糖的提取效率最高。這是由于仙人草細胞壁是由纖維素與果膠組成，可用纖維素酶與果膠酶酶解破壁溶出有效成分，故纖維素酶與果膠酶共用效果最好。當復(fù)合酶濃度達到4%時，仙人草提取率明顯高于2%、3%時的提取率，繼續(xù)提高酶濃度對提取率沒有明顯作用。綜合考慮，采用纖維素酶與果膠酶1∶1復(fù)合、酶濃度為4%提取仙人草多糖較佳。

圖2 酶種類及濃度對多糖提取率的影響

2．1．2 酶解溫度對多糖提取率的影響

由圖3可知，當酶解溫度為50℃時，仙人草多糖提取率最佳，當酶解溫度繼續(xù)升高時，提取率下降。這是由于酶解溫度過高會影響酶的活性，使酶的作用受到抑制。因此，較適酶解溫度為50℃。

圖3 酶解溫度對多糖提取率的影響

2．1．3 酶解時間對多糖提取率的影響

由圖4可知，當酶解時間為2．5 h時，仙人草多糖的提取率達到最大值，繼續(xù)延長時間則呈下降趨勢。當酶解時間過多時，超聲波具有較強的機械剪切作用，會使多糖結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致多糖提取率下降。

圖4 酶解時間對多糖提取率的影響

2．1．4 酶解pH值對多糖提取率的影響

由圖5可知，酶解pH值4～6時，隨著pH提高仙人草多糖提取率逐漸增加，當pH值為6．0時提取率最高，繼續(xù)加大pH值時仙人草多糖提取率呈下降趨勢。酶解pH值為6時酶活性最大，因此確定提取仙人草多糖適宜酶解pH值為6。

圖5 酶解pH值對多糖提取率的影響

2．2 正交實驗

正交實驗設(shè)計方案與結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 正交實驗方案及結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

由表2～表3可知，各因素影響仙人草多糖提取率的主次順序為A＞B＞C＞D，即復(fù)合酶濃度＞酶解溫度＞酶解時間＞酶解pH值。仙人草多糖提取最佳工藝條件為：復(fù)合酶濃度5%，酶解溫度50℃，酶解時間2 h，酶解pH值為7，在此條件下多糖的提取率為6．57%。

2．3 最佳工藝驗證實驗

為進一步考察最佳工藝的穩(wěn)定性和可行性，根據(jù)正交實驗得出的最佳工藝條件，進行3次驗證性實驗。3次驗證實驗的結(jié)果分別為6．61%、6．65%、6．55%，平均提取率為6．60%，說明此工藝條件的穩(wěn)定性好，可行性強。

3 結(jié)論

通過單因素實驗和L9（34）正交實驗，確定了超聲輔助酶解法提取仙人草多糖的最佳工藝條件為：復(fù)合酶（纖維素酶∶果膠酶＝1∶1）濃度5%、酶解溫度50℃、酶解時間2 h、酶解pH值為7。在此最佳提取工藝條件下，多糖的平均提取率為6．60%。

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Study on extraction process of polysaccharide from Mesona chinensis by ultrasonic－assisted enzymatic method

JI Hui－jie，YANG Yan－jun，SHEN Qi－h(huán)ui，YU Li－ying，ZHANG Yue－wei，LI Chang－jian
（College of Chemistry and Pharmaceutical Engineering，Jilin Institute of Chemical Technology，Jilin Jilin 132022）

Taking Mesona chinensis as raw material，the polysaccharides was extracted by ultrasonic assisted enzymatic method．The effects of single factors，including the variety and the concentration of signal enzyme，the concentration of complex enzymes and the ratio，enzymolysis time，enzymolysis temperature and pH on the extraction efficiency of polysaccharides were investigated，and orthogonal experiments was used to optimize the extraction process．Results showed that the optimum conditions were as follows：concentration of complex enzyme（cellulose∶pectinase＝1∶1）5%，enzymolysis temperature 50℃，enzymolysis time 2 h and pH of 7．Under these conditions，the extraction efficiency of polysaccharides reached 6．60%．

Mesona chinensis；ultrasonic；enzymatic hydrolysis；polysaccharide

R 284．2

A

1007－7561（2017）02－0074－04

2016－10－19

吉惠杰，1973年出生，女，本科．

于麗穎，1967年出生，女，教授．