賈秀琴 楊繼紅 李映紅 郭文鵬 李利民 楊 敏

(廣東省深圳市第二人民醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，廣東 深圳 518035)

保腎沖劑對(duì)系膜增生性腎小球腎炎大鼠腎組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78表達(dá)的影響※

賈秀琴 楊繼紅1李映紅 郭文鵬2李利民 楊 敏

(廣東省深圳市第二人民醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，廣東 深圳 518035)

目的 觀察保腎沖劑對(duì)系膜增生性腎小球腎炎(MsPGN)大鼠腎臟的保護(hù)作用及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)相關(guān)蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)表達(dá)的影響，探討其作用機(jī)制。方法 將21只雄性SD大鼠隨機(jī)分為造模組(14只)及空白對(duì)照組(7只)。造模組大鼠予尾靜脈注射抗大鼠胸腺細(xì)胞抗血清(ATS)建立MsPGN模型，造模成功后再隨機(jī)分為模型組及中藥組，每組7只。中藥組給予保腎沖劑藥液灌胃，空白對(duì)照組和模型組予等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃，連續(xù)14周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，觀察比較各組大鼠治療前后24 h尿蛋白定量(24 h UTP)及血肌酐(Cr)水平變化，并檢測(cè)大鼠腎組織內(nèi)GRP78蛋白及基因表達(dá)水平情況。結(jié)果 治療前中藥組及模型組大鼠24 h UTP及Cr水平均明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)，治療后中藥組大鼠24 h UTP及Cr水平較模型組均明顯降低(P<0.05)；模型組及中藥組大鼠治療后GRP78蛋白及基因表達(dá)水平IOD值均明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)，但中藥組大鼠治療后GRP78蛋白及基因表達(dá)水平IOD值均低于模型組(P<0.05)。結(jié)論 MsPGN大鼠腎臟組織GRP78表達(dá)增高，提示ERS可能參與其腎臟損害過程，而中藥保腎沖劑對(duì)MsPGN模型大鼠腎臟具有一定的保護(hù)作用，可減輕大鼠腎功能損害，降低大鼠24 h UTP及Cr水平，降低GRP78蛋白及基因表達(dá)水平，從而起到治療作用，且抑制ERS相關(guān)蛋白GRP78的過度表達(dá)可能是其減輕腎功能損害的重要作用機(jī)制靶點(diǎn)之一。

腎小球腎炎，膜增生性；動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)；大鼠；中藥療法

系膜增生性腎小球腎炎(mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN)是原發(fā)性腎小球疾病中最常見的腎小球病變，是我國(guó)相關(guān)患者導(dǎo)致終末期腎病的主要原因之一，因此對(duì)MsPGN的研究倍受關(guān)注[1-3]。目前，MsPGN的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，近年來越來越多的研究證實(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)在許多疾病的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用，過強(qiáng)或者過長(zhǎng)時(shí)間的ERS都可引起細(xì)胞凋亡[4-6]，而腎臟細(xì)胞中具有發(fā)達(dá)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，慢性腎炎狀態(tài)下ERS激活的刺激因素大大增加，所以ERS與慢性腎炎腎損害的關(guān)系值得探討[7]。本研究擬通過建立大鼠MsPGN模型，觀察中藥保腎沖劑對(duì)MsPGN模型大鼠的治療作用，并通過測(cè)定大鼠24 h尿蛋白定量(24h UTP)、血肌酐(Cr)及ERS標(biāo)志分子——葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)[8]水平變化，探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 2個(gè)月齡清潔級(jí)SD雄性大鼠21只，體質(zhì)量(200±10)g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(鄂)2015-0018。實(shí)驗(yàn)期間自由飲水，室溫20～24 ℃，相對(duì)濕度40～50%。

1.2 藥物 保腎沖劑由生地黃、山藥、山茱萸、澤瀉、黨參、黃芪、丹參、白花蛇舌草、黃柏、茯苓、益母草及甘草等藥物組成，所有中藥材均購(gòu)自廣東省深圳市北京同仁堂藥店，常規(guī)水煎，濃縮成含原藥材1.962 g/mL，4 ℃冷藏保存?zhèn)溆??？勾笫笮叵偌?xì)胞抗血清(ATS)的制備：取4～6周齡大鼠胸腺細(xì)胞，純化為單胸腺細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞水平至5×107/L，成為單胸腺細(xì)胞懸液，與完全福氏佐劑做1∶2體積混合，按每只5×107/L個(gè)細(xì)胞量將胸腺細(xì)胞多點(diǎn)皮下注射免疫新西蘭兔，然后每隔2周按每只家兔1×107/L細(xì)胞經(jīng)耳靜脈直接注射加強(qiáng)免疫，共加強(qiáng)免疫3次，末次免疫1周后，間接免疫熒光測(cè)ATS的效價(jià)結(jié)果為1∶2 000時(shí)，表明ATS制備成功。第7周采血，4 ℃冷藏析出血清，并經(jīng)大鼠新鮮紅細(xì)胞及肝細(xì)胞吸附，分裝后于-20 ℃保存，使用時(shí)56 ℃水浴30 min滅活補(bǔ)體。

1.3 試劑與儀器

1.3.1 試劑 尿蛋白定量測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所提供；GRP78抗體，武漢維諾賽生物技術(shù)有限公司提供。

1.3.2 儀器 微型高速離心機(jī)，美國(guó)Labnet公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，日本ASONE株式會(huì)社；全自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；RM 2016輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，德國(guó)Leica公司；BX53型生物顯微鏡，日本奧林巴斯株式會(huì)社；ABI7900型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 造模 全部大鼠購(gòu)回后適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，并檢測(cè)尿蛋白定性(-)后，隨機(jī)分為造模組(14只)及空白對(duì)照組(7只)。造模組大鼠予尾靜脈注射ATS 1 mL/100 g，1周1次，共注射4次。注射結(jié)束1 d后查大鼠尿蛋白，如尿蛋白(+++)即可判定為模型成功?？瞻讓?duì)照組大鼠正常飼養(yǎng)。

1.4.2 分組及給藥 將14只造模組大鼠隨機(jī)分為中藥組及模型組，各7只。中藥組給予保腎沖劑藥液灌胃2 mL/只，每日1次，連用14周?？瞻讓?duì)照組及模型組予等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃，每日1次，連用14周。

1.5 觀察指標(biāo)及方法

1.5.1 腎臟病理檢查 各組大鼠均在實(shí)驗(yàn)第14周末采集留取血液標(biāo)本后，用3%戊巴比妥鈉(20 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉后處死，并迅速切取左腎，去掉被膜，置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.04多聚甲醛固定，進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)法染色，并在光鏡下觀察腎臟形態(tài)學(xué)改變。

1.5.2 24 h UTP及Cr檢測(cè) 各組大鼠造模治療前1 d及造模治療14周后收集24 h尿液，進(jìn)行24 h UTP測(cè)定。在造模治療前1 d及造模治療14周后經(jīng)股動(dòng)脈取血，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血Cr水平變化。

1.5.3 GRP78蛋白表達(dá) 采用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)觀察各組大鼠腎組織GRP78蛋白表達(dá)水平。取大鼠腎組織碎塊80 mg加400 μL單去污劑裂解液于勻漿器中勻漿，置冰上，重復(fù)碾至盡量碎，裂解30 min后，將裂解液移至1.5 mL離心管中，4 ℃以12 000 r/min離心5 min，取上清分裝于0.5 mL離心管中并置于-20 ℃保存。將制備好的蛋白樣品加入5%及10%凝膠中電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗(1∶2 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌緩沖液洗膜(5 min×6次)，加入二抗(1∶50 000)，37 ℃搖床孵育2 h，TBST洗滌緩沖液洗膜(5 min×6次)，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影。蛋白條帶采用Bandscan軟件進(jìn)行分析，將GRP78 的積分光密度(IOD)值與所對(duì)應(yīng)樣品的β-actin IOD值進(jìn)行比較，分析GRP78蛋白表達(dá)水平。

1.5.4 GRP78基因表達(dá) 采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)觀察各組大鼠腎臟GRP78基因表達(dá)水平。取-80 ℃冰箱中保存的新鮮冰凍腎組織，加入1 mL總RNA抽提試劑(Trizo)，用勻漿器研磨成漿，移至無核糖核酸酶(RNase)的1.5 mL EP管中，裂解10 min。加入200 μL氯仿，混勻后室溫放置5 min。4 ℃以12 000 r/min離心15 min。轉(zhuǎn)移上層水相(約400 μL)于另一新1.5 mL EP管中，加入400 μL異丙醇，混勻后室溫靜置10 min。離心后棄上清，加入無RNase的75%乙醇1 mL，混勻后再離心。棄上清，空氣中干燥RNA沉淀5～10 min后溶于20 μL焦碳酸二乙酯(DEPC)水中。將總RNA放于-80 ℃冰箱內(nèi)保存以備用。以提取的RNA為模板合成cDNA，反應(yīng)體系：總RNA 2.322 μg，Oligo (dT) 15(10 μM) 2 μL，以DEPC水補(bǔ)足容積到8.5 μL，85 ℃水浴5 min，置于冰上。加入5×Hiscript Buffer 4 μL，2.5 mM脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)4 μL，Hiscript逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL，核糖核酸酶抑制因子(Ribonuclease Inhibitor) 0.5 μL，總體積為20 μL，25 ℃水浴5 min，50 ℃水浴15 min，85 ℃水浴5 min后置于冰上10 min，-20 ℃保存?zhèn)溆?。引物合成委托北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。GRP78 (195 bp)包括正義鏈5'-ACGACCCCTGACAAAAGACA-3'和反義鏈5'-GTCAGGCGGTTTTGGTCATT-3'，β-actin (240bp)包括正義鏈5'-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3'和反義鏈5'-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3'。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系見表1。蛋白表達(dá)條帶采用Bandscan軟件進(jìn)行分析，將GRP78 mRNA的IOD值分別與所對(duì)應(yīng)樣品的β-actin的IOD值進(jìn)行比較，分析其表達(dá)水平。

表1 RT-PCR反應(yīng)體系

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠治療后腎組織GRP78蛋白及基因表達(dá)水平IOD值比較 見表2。

表2 各組大鼠治療后腎組織GRP78蛋白

與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

由表2可見，模型組及中藥組大鼠治療后GRP78蛋白及基因表達(dá)水平IOD值均高于空白對(duì)照組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中藥組大鼠治療后GRP78蛋白及基因表達(dá)水平IOD值均低于模型組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 各組大鼠治療后腎臟形態(tài)學(xué)比較 模型組大鼠腎小球彌漫肥大，腎小球內(nèi)系膜細(xì)胞和基質(zhì)增多，基底膜增厚，腎小球囊腔狹窄，可見有包氏囊粘連，腎小管上皮細(xì)胞腫脹，部分腎小管萎縮或擴(kuò)張，部分腎小管腔內(nèi)可見粉染無結(jié)構(gòu)物，部分腎小管上皮細(xì)胞基底膜增厚，腎間質(zhì)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，小葉間動(dòng)脈管壁輕度增厚。中藥組大鼠部分腎小球肥大，腎小球內(nèi)系膜細(xì)胞和基質(zhì)輕度增多，基底膜輕度增厚，部分腎小球囊腔輕度狹窄，部分腎小管上皮細(xì)胞基底膜輕度增厚，腎間質(zhì)小灶狀炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，小血管未見明顯異常?？瞻讓?duì)照組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)無異常。表明模型組大鼠腎組織發(fā)生明顯病理?yè)p害，中藥組大鼠腎臟病理?yè)p害有一定程度減輕，見圖1。

圖1 各組大鼠腎臟病理組織檢查結(jié)果(HE×200)

2.3 各組大鼠治療前后24 h UTP 及Cr水平變化比較 見表3。

表3 各組大鼠治療前后24 h UTP 及Cr水平變化比較

組 別n24hUTP(mg/L)治療前治療后Cr(μmol/L)治療前治療后模型組74982.019±840.722*4153.453±400.76185.786±6.394*81.043±6.111中藥組74875.792±998.458*1946.978±455.494△87.386±6.177*38.386±6.700△空白對(duì)照組71110.825±201.584958.314±183.14129.714±3.50228.567±11.174

與空白對(duì)照組治療前比較，*P<0.05；與模型組治療后比較，△P<0.05

由表3可見，治療前，中藥組及模型組大鼠24 h UTP及Cr水平均高于空白對(duì)照組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療后，中藥組大鼠24 h UTP及Cr水平均低于模型組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

MsPGN病變可導(dǎo)致腎小球硬化并最終出現(xiàn)腎衰竭，嚴(yán)重影響患者健康，并產(chǎn)生高額的醫(yī)療費(fèi)用，目前對(duì)其發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)尚不完全，近年來越來越多的研究證實(shí)，ERS在其發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[9]。ERS作為機(jī)體自身的一種內(nèi)源性保護(hù)防御機(jī)制，是細(xì)胞對(duì)外界刺激因素的適應(yīng)性反應(yīng)，在維持細(xì)胞生存或細(xì)胞凋亡平衡中具有重要作用,一定程度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)可以激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶等保護(hù)因子的表達(dá)，保護(hù)細(xì)胞抵抗應(yīng)激[10]。但是反應(yīng)過強(qiáng)或持續(xù)時(shí)間過長(zhǎng)即可引起細(xì)胞功能失調(diào)，甚至細(xì)胞死亡等病理現(xiàn)象，故ERS具有重要的生理及病理意義。腎臟細(xì)胞具有發(fā)達(dá)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從腎臟細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能分析，腎臟具有發(fā)生ERS的條件和基礎(chǔ)。目前關(guān)于ERS與慢性腎炎腎損害的具體實(shí)驗(yàn)證據(jù)尚不充分,針對(duì)ERS及其信號(hào)傳導(dǎo)通路在腎臟疾病發(fā)病中的作用進(jìn)行研究，可能為尋找腎臟疾病新的防治靶點(diǎn)提供新思路和新方向[11]。

GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)一種特異的分子伴侶，屬于熱休克蛋白70家族，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的感受器，在檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白質(zhì)的聚集和ERS的激活過程中發(fā)揮重要作用。GRP78在應(yīng)激狀態(tài)下可通過解離調(diào)節(jié)ERS相關(guān)跨膜信號(hào)感受器活性，被廣泛認(rèn)為是ERS激活的標(biāo)志分子[12]，GRP78表達(dá)異?？擅黠@加重ERS引起的細(xì)胞損傷[13]，高血糖、蛋白尿等引起的腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞凋亡中均有ESR的參與[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組GRP78蛋白及基因表達(dá)水平IOD值均明顯升高(P<0.05)，病理觀察結(jié)果也顯示模型組大鼠腎臟呈現(xiàn)腎小球彌漫肥大，腎小球內(nèi)系膜細(xì)胞和基質(zhì)增多，基底膜增厚，腎小球囊腔狹窄，可見有包氏囊粘連，腎小管上皮細(xì)胞腫脹，腎間質(zhì)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，小葉間動(dòng)脈管壁輕度增厚，可以判斷模型組出現(xiàn)了MsPGN的病理改變。

MsPGN屬中醫(yī)學(xué)腰痛、水腫等范疇，本病病情表現(xiàn)復(fù)雜，病程冗長(zhǎng)，其病機(jī)特點(diǎn)多為本虛標(biāo)實(shí)，虛實(shí)夾雜。本虛表現(xiàn)以脾腎氣陰兩虛、腎絡(luò)空虛為主，標(biāo)實(shí)主要表現(xiàn)為濕熱、瘀血、濁毒郁滯腎絡(luò)，正虛與邪實(shí)互為因果相互影響[15]。保腎沖劑正是針對(duì)本病腎絡(luò)空虛、瘀濁阻滯病機(jī)，采用六味地黃湯加減而成。方中生地黃、山茱萸滋補(bǔ)肝腎；黨參、黃芪、茯苓、澤瀉補(bǔ)益脾腎，利水消腫；山藥補(bǔ)脾澀精固腎；白花蛇舌草解毒化濁；丹參活血化瘀；黃柏滋陰清熱燥濕；益母草活血利水；甘草和中解毒。諸藥合用，共奏益氣養(yǎng)陰、活血祛濁通絡(luò)之功[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，中藥組腎組織病理變化明顯輕于模型組，中藥組治療后24 h UTP及Cr水平均低于模型組(P<0.05)，GRP78蛋白及基因表達(dá)水平也明顯低于模型組(P<0.05)。

本研究結(jié)果表明，MsPGN大鼠腎臟組織GRP78表達(dá)增高，提示ERS可能參與其腎臟損害過程，而中藥保腎沖劑對(duì)MsPGN模型大鼠腎臟具有一定的保護(hù)作用，可減輕大鼠腎功能損害，降低大鼠24 h UTP及Cr水平，降低GRP78蛋白及基因表達(dá)水平，從而起到治療作用，且抑制ERS相關(guān)蛋白GRP78的過度表達(dá)可能是其減輕腎功能損害的重要作用機(jī)制靶點(diǎn)之一。

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(本文編輯：石 康)

Effects of Protect-kidney granules on the expression of ERS-related glucose regulation protein-78 in kidney of mesangial proliferative glomerulonephritis rats

JIAXiuqin*,YANGJihong,LIYinghong,etal.

*InstituteofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,SecondPeople'sHospitalinShenzhenCity,Guangdong,Shenzhen518035

Objective To observe the effects of Protect-renal granules on the protection of kidney in rats with mesangial proliferative glomerulonephritis(MsPGN)and the expression of endoplasmic reticulum stress (ERS) related glucose regulation protein-78 (GRP78), and to explore its action mechanism. Methods 21 male SD rats were randomly divided into modeling group (n=14) and blank control group (n=7). MsPGN models were established by the tail vein injection of anti-rat thymocyte serum(ATS)in modeling group. Rats with successful modeling were randomly divided into model group and traditional Chinese medicine(TCM) group, 7 rats in each group. The TCM group received Protect-kidney granules by gavage, the blank and model group were received 0.9% sodium chloride injection by gavage at the same volume, continuously taking for 14 weeks. After the experiment, the changes of the 24 hour urine protein quantification(24h UTP)and serum creatinine(Cr)before and after treatment were observed in each group. The expressions of protein and genes of GRP78 in rats' kidney were measured. Results The levels of 24h UTP and Cr before treatment in TCM and model group were obviously higher than blank control group (P<0.05). The levels of 24 h UTP and Cr after treatment in TCM group were significantly lower than model group (P<0.05). The immediate oxygen demand (IOD) of protein and gene expressions of GRP78 after treatment in model and TCM group were obviously higher than blank control group (P<0.05), but the IOD after treatment in TCM group was obviously lower than model (P<0.05).Conclusion The increased expression of GRP78 in MsPGN rats'kidney tissue indicate that ESR may participate in the pathogenesis of kidney damage, while the Protect-renal granules has certain protection of MsPGN, can reduce kidney damage, decrease the levels of 24 h UTP and Cr, and down-regulated expression of protein and gene of GRP78, thus play a therapeutic role, and to suppress the overexpression of ERS-related protein GRP78 may be one of the target spot of kidney renal damage.

Glomerulonephritis; Membrane proliferative; Animals; Experiment; Rats; Traditional Chinese medicine therapy

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.01.027

※ 項(xiàng)目來源：深圳市科技創(chuàng)新委員會(huì)2014年市科技研發(fā)資金知識(shí)創(chuàng)新計(jì)劃(編號(hào)：JCYJ20140414170821241)

賈秀琴(1962—)，女，主任醫(yī)師，學(xué)士。從事中西醫(yī)結(jié)合腎臟病臨床及基礎(chǔ)研究。

R285.5；R692.31

A

1002-2619(2017)01-0104-05

2016-11-22)

1 廣東省深圳市第二人民醫(yī)院兒科，廣東 深圳 518035

2 廣東省深圳市第二人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518035