●本刊記者/

乙型病毒性肝炎（viral hepatitis type B，簡稱乙肝）是由乙肝病毒（HBV）引起的，具有傳染性，主要臨床表現(xiàn)為：乏力、食欲減退、惡心、嘔吐、肝大及肝功能異常等。根據(jù)癥狀體征，乙肝又分為急性乙肝、慢性乙肝、重型乙肝等。我國有大約7800 萬慢性乙肝感染者，其中慢性乙肝患者約2800 萬人。目前，臨床上用于治療慢性乙肝的常用藥物為核苷（酸）類似物和長效干擾素，二者均不能直接作用于HBV 的復(fù)制模板——共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA），難以有效清除病毒實(shí)現(xiàn)臨床治愈。因此，研發(fā)直接靶向cccDNA 的藥物，尋找清除cccDNA的新方法和新策略是當(dāng)前研發(fā)治療慢性乙肝藥物的熱點(diǎn)。日前，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院魯鳳民教授課題組與許中偉、夏寧邵教授等合作，在《Theranostics》雜志上在線發(fā)表了研究論文,探索HBV病毒清除的新路徑。王杰、陳然和張瑞陽為該論文的共同第一作者。

慢性乙肝難以實(shí)現(xiàn)臨床治愈

慢性乙肝的傳播途徑為血液傳播、母嬰傳播、性傳播、皮膚黏膜破損傳播等。感染慢性乙肝的患者乙肝病毒檢測為陽性，病程超過半年或發(fā)病日期不明確。治療慢性乙肝的總體目標(biāo)是最大限度地長期抑制HBV，減輕肝細(xì)胞炎癥壞死及肝纖維化，延緩和減少肝臟失代償、肝硬化、肝癌及其并發(fā)癥的發(fā)生，從而改善患者生活質(zhì)量，延長存活時(shí)間。

HBV 的復(fù)制模板cccDNA 半衰期較長，再加上cccDNA 池的不斷補(bǔ)充，使細(xì)胞核內(nèi)的cccDNA 持續(xù)存在，感染慢性化。目前，臨床上用來治療慢性乙肝的藥物主要為干擾素（分為普通干擾素和長效干擾素）和核苷（酸）類似物，二者的治療效果較好，但均不能直接作用于cccDNA，難以有效清除病毒實(shí)現(xiàn)臨床治愈。因此，研發(fā)直接靶向cccDNA 的藥物，尋找清除cccDNA 的新方法和新策略勢在必行。

采用基因編輯和RNA 干擾技術(shù)抑制HBV 復(fù)制

近日，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院魯鳳民教授課題組與許中偉、夏寧邵教授等合作，通過模擬microRNA（miRNA）的生成過程，整合雙gRNA 導(dǎo)向的CRISPR/Cas9 和RNA 干擾技術(shù)，高效破壞cccDNA，為探索直接靶向cccDNA的藥物提供了新思路。

該研究以miRNA-31 為基本骨架，通過模擬其核心序列的二級結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)HBV特 異 的miRNA——miR-HBV，miRNA兩側(cè)側(cè)翼序列為特異性靶向cccDNA 不同位點(diǎn)的引導(dǎo)RNA——gRNA。該gRNA-(miR-HBV)-gRNA 三聯(lián)體表達(dá)體系導(dǎo)入細(xì)胞后，在細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄形成gRNA-(miR-HBV)-gRNA 長 轉(zhuǎn) 錄 本，經(jīng) 內(nèi) 源的Drosha/DGCR8 復(fù)合體剪切，形成2個(gè)gRNA 和1 個(gè)miR-HBV 前 體premiR-HBV。進(jìn) 入 細(xì) 胞 質(zhì) 后，pre-miRHBV 進(jìn)一步經(jīng)Dicer 酶剪切，形成成熟的miR-HBV。一 方 面，雙gRNA 導(dǎo)向的CRISPR/Cas9 系統(tǒng)通過切割并去除cccDNA 的關(guān)鍵調(diào)控和編碼序列直接破壞cccDNA；另一方面，通過miRHBV 在轉(zhuǎn)錄后水平抑制HBV 復(fù)制，進(jìn)而抑制cccDNA 池的補(bǔ)充，協(xié)同促進(jìn)HBV cccDNA 的清除。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pri-miRNA-31 的側(cè)翼序列長度為38bp時(shí)，與雙gRNA 組成的三聯(lián)體對HBV 復(fù)制的抑制效率最高。

應(yīng)用于臨床仍需突破技術(shù)難點(diǎn)

此項(xiàng)技術(shù)雖然在實(shí)驗(yàn)階段取得突破，但離臨床應(yīng)用尚有較遠(yuǎn)的距離。一方面，如何高效和靶向性地將三聯(lián)體遞送到受HBV 感染的肝細(xì)胞內(nèi)是需要攻克的一大障礙；另一方面，CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)的脫靶效應(yīng)也具有安全隱患。近年來，隨著Cas 核酸酶的不斷改造，其脫靶效應(yīng)已經(jīng)得到了有效控制，安全性大大提高。而且，隨著金黃色葡萄球菌Cas9 的 發(fā) 現(xiàn)，使 得CRISPR/Cas9 系 統(tǒng)可以裝入腺相關(guān)病毒載體中，致使該技術(shù)應(yīng)用于臨床的距離逐漸縮短。

此次研究通過gRNA-(miR-HBV)-gRNA 三聯(lián)表達(dá)框架聯(lián)合CRISPR/Cas9和RNA 干擾技術(shù)高效破壞cccDNA，促進(jìn)HBV 的清除，為慢性乙肝的抗病毒治療提供了新的思路。此項(xiàng)研究得到了國家十二五重大科技專項(xiàng)計(jì)劃“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”項(xiàng)目和國家自然科學(xué)基金的支持。